7

Размещено на http://www.allbest.ru/

Западно-Казахстанский аграрно-технический университет имени Жангир Хана

Применение метода полимеразной цепной реакции для выделения ДНК из изолятов и вакцинных штаммов

К.Ж. Кушалиев, доктор вет. наук, профессор,

магистранты: Губайдуллина А.,

Кубашева Д., Сабыржанова Н.

Аннотации

Подбор праймеров осуществляли на основе имеющихся литературных данных по изучению Brucella spp. В результате обработки литературных материалов были подобраны две пары праймеров для видового определения возбудителей заболевания бруцеллеза. На основе компьютерного анализа при помощи пакета программ Vector NTI были проанализированы подобранные две пары праймеров. В результате анализа первая подобранная пара праймеров 24-1 (TGCAGCTCACGGATAATTTG) и 24-2 (ACACCTTGTCCACGCTCAC) строго специфична для B. аbortus. Вторая подобранная пара 25-1 (ATCTGGTTCTTTCGGGTGTG) и 25-2 (CATCACCAAGAACCGTGTTG) является маркерной для определения видов B. аbortus, B. melitensis и B. suis. Праймеры были заказаны и синтезированы в компании ЗАО Евроген, Российская Федерация, город Москва.

Рисунок 3. Компьютерная обработка первой пары праймеров для определения B. аbortus.

Оптимизация условий ПЦР.

Таким образом, оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции проведена с учетом имеющихся литературных данных по изучению Brucella spp и проведению ПЦР. Оптимизация велась по трем направлениям:

1) Температурный профиль;

2) Временной профиль реакции;

3) Состав реакционной смеси;

Была разработана программа амплификации коллекции ДНК микроорганизмов рода Brucella, состоящая из 42-х циклов включающая в себя 1 этап "денатурация" при 95°С в течении 3-х минут, 2 этап "отжиг" при 63°С в течении 1-ой минуты и 3 этапа "элонгации" или "синтеза" при 72°С в течении 1-ой минуты.

Состав реакционной смеси включал в себя следующие компоненты: праймеры по 0,1 мкл, буфер для проведения ПЦР реакции по 2,0 мкл, MgCl 1.5 M по 1,2 мкл, смесь дизоксинуклеотидтрифосфатов dNTP в количестве 0,4 мкл и Taq-полимераза по 0,4 мкл на реакцию.

Таким образом, проведена определенная работа по выяснению географического местоположения выделения штаммов, история их движения и изучения, что позволяет дополнять базу данных новыми сведениями из опубликованных материалов различных исследователей по конкретным штаммам. Также собраны данные по изолятам бруцелл циркулирующих в регионе Западно-Казахстанской области и выделение ДНК из изолятов и вакцинных штаммов бруцелл 82 и 82-ПЧ.

штамм бруцелла вакционный изолят

Список использованных источников

1. Абуталипов, А.А. Методические указания по проведению анализа ДНК методом полимеразной цепной реакции ПЦР / А.А. Абуталипрва, В.Е. Тен // ДГП "Научно-Исследовательский Ветеринарный Институт" РГП "НПЦ ЖиВ" МСХ РК. - Алматы: 2007. - 38 с.

2. Бадашкеева, А.Г. Меченные биотином олигонулклеотиды как зонды в методе молекулярной гибридизации [Текст] / А.Г. Бадашкеева; // Молекулярная биология, 1989. - Т.23. - Вып.5. - 1221-1226 с.

3. Деренко, М.В. Однопраймерный вариант ПЦР-амплификации участков главной некодирующей области [Текст] / Г.И. Деренко., Б.А. Малярчук.

4. Урбан, В.П. Иммунопрофилактика инфекционных болезней животных // Проблемы ветеринарной иммунологии. / В.П. Урбан - М.: Агропромиздат, 1998.

5. Мозесюк, Е.О. Сравнительная антигенная характеристика некоторых штаммов бруцелл, отнесенных к стабильным и нестабильным L-формам // Актуальные вопросы профилактики и ликвидации заразных болезней с. - х. животных: Сб. науч. тр. / Е.О. Мозесюк, Н.М. Чувилькин, И.И. Колодий - Л., 1983. - вып.73. - 66-70 с.

Размещено на Allbest.ru