Особенности развития окислительного стресса и генетические маркеры предрасположенности к ишемической болезни сердца у лиц пожилого и старческого возраста Ростовской области

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Нгуен Тхи Чанг

Особенности развития окислительного стресса и генетические маркеры предрасположенности к ишемической болезни сердца у лиц пожилого и старческого возраста Ростовской области

03.01.04 - Биохимия

03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону

2012

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биологии и на факультете биологических наук Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Шкурат Татьяна Павловна;

доктор биологических наук, профессор Внуков Валерий Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, гл. научн. сотр. Друкер Нина Александровна;

доктор биологических наук, профессор Асланян Марлен Мкртичович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Росздрава РФ.

Защита диссертации состоится «26» января 2012 г. в «11⁰⁰» часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, акт. зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148.

Автореферат разослан «30» ноября 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, с.н.с. Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

кровь окисление ишемический пожилой

Актуальность исследования. К концу ХХ-го века наметилась тенденция к увеличению доли людей пожилого и старческого возраста среди населения экономически развитых и развивающихся стран. По прогнозам ООН, к 2025 году число людей старше 60 лет достигнет 1,2 млрд. человек (15% всего населения планеты), при этом ожидается увеличение численности людей в возрасте старше 80 лет. Доля людей старшего поколения (пожилого и старческого возраста) в структуре населения России составляет более 20% (в 36 регионах достигла 27%), и, как ожидается, к 2015 году каждый третий из пожилых людей будет относиться к возрастной группе 75 лет и старше (Скулачев В.П., 2001; Сафарова Г.Л., 2004). Процесс демографического старения необратим, носит глобальный характер и в первой половине XXI века его темпы увеличатся.

Всемирная ассамблея ООН в 2002 году приняла программу по исследованию старения в XXI веке. Медико-биологические исследования с участием пожилых, старых людей и долгожителей признаны необходимыми для выявления факторов, маркеров риска и подходов к адекватной терапии возраст-ассоциированных заболеваний, разработки стратегии увеличения продолжительности жизни и улучшения ее качества в пожилом и старческом возрасте, поиска предикторов потенциального возраста дожития, а также для развития фундаментальных представлений о самом феномене старения.

В настоящее время одной из актуальных задач является исследование особенностей развития окислительного стресса в крови, структурно-функционального состояния мембран эритроцитов в старших возрастных группах населения. С нарушениями липидного гомеостаза сопряжены атерогенез и высокий риск развития сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. По мере увеличения возраста риск развития этих заболеваний нарастает. Пожилой возраст в целом характеризуется полиморбидностью. Наиболее серьезными проблемами этой возрастной группы являются артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца (ИБС), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона.

Результаты целого ряда исследований свидетельствуют в пользу того, что в наследственную предрасположенность к развитию дислипидемий, заболеваний сердечно-сосудистой и нервной систем вносит вклад полиморфизм генов, кодирующих белки, участвующие в метаболизме липидов (Barter P., 2004; Bamba V., 2007). Однако подавляющее большинство таких работ было проведено на лицах зрелого возраста и лишь немногие - в старших возрастных группах, в том числе, у стариков и долгожителей (Louhija J. et al., 1994; Cui Y. et al., 2001; Anderson R.M. et al, 2003). Возрастные ассоциации аллельных вариантов генов-кандидатов ИБС, старения и “заболеваний старшего возраста” практически не исследованы, а сведения о полиморфизме этих генов в популяциях разных народов мира ограничены. Вместе с тем, современный подход к проблеме управления здоровьем и долголетием в профилактике заболеваний в пожилом и старческом возрасте предполагает обязательный учет особенностей конкретных популяций (климато-географические особенности региона проживания, этнические, культурные и популяционно-генетические характеристики населения). Вместе с тем, комплексные исследования, посвященные изучению изменения системы свободного радикального окисления (СРО) крови и полиморфизма генов-кандидатов ишемической болезни сердца в пожилом и старческом возрасте у населения Ростовской области, до сих пор не проводились, что и определило цель настоящей работы.

Цель работы. Исследование интенсивности системы свободно-радикального окисления крови, показателей структурно-функционального состояния мембран эритроцитов и распределения частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов-кандидатов у больных ишемической болезнью сердца в группах лиц пожилого и старческого возраста, проживающих в Ростовской области.

1. Исследовать интенсивность свободнорадикальных процессов по параметрам хемилюминесценции и содержанию метаболитов NO (NOHb, RNO_X, RSNO и NOТир.) в плазме крови больных ИБС различных возрастных групп.

2. Определить интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) по содержанию молекулярных продуктов - диеновых конъюгатов (ДК), малонового диальдегита (МДА) и шиффовых оснований (ШО) в плазме крови и эритроцитах больных ИБС различных возрастных групп.

3. Исследовать активность антиоксидантных ферментов - супероксидисмутазы (СОД), каталазы и церулоплазмина в плазме крови и эритроцитах больных ИБС различных возрастных групп.

4. Определить стабильность (по содержанию внеэритроцитаного гемоглобина (ВЭГ) и суммарной пероксидазной активности (СПА) и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов с использованием флуоресцентного зонда пирена (по параметрам микровязкости и текучести) больных ИБС различных возрастных групп.

5. Определить частоты аллелей и генотипов по полиморфным маркерам ряда генов: L28P - гена аполипопротеина Е (АРОЕ); Q192R - гена параоксоназы 1 (PON1); T174M и M235T - генов ангиотензиногена (AGT); L33P - гена интегрина в-3 (ITGB3); С807Т - гена интегрина б-2 (ITGA2); C786T - гена эндотелиальной NO - синтазы (eNOS); С3238G - гена аполипопротеина С-3 (APOC3) у лиц пожилого и старческого возраста больных ИБС.

6. Провести сочетанный анализ носительства аллельных вариантов генов АРОЕ, PON1, AGT, APOC3, ITGB3, ITGA2, eNOS у больных ИБС пожилого и старческого возраста.

Научная новизна. Впервые установлены закономерности изменения процессов СРО и их регуляции в плазме крови и эритроцитах, а также показателей стабильности и структурно-функционального состояния мембран у больных ишемической болезнью сердца Ростовской области в зависимости от возраста. Впервые изучены особенности развития окислительного стресса в крови больных ИБС Ростовской области в возрастном аспекте и выявлено влияние развития свободнорадикального окисления на структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов. Впервые выявлены влияния процесса старения на состояние процессов СРО и структурного гомеостаза в крови здоровых людей, проживающих в Ростовской области. Показано, что с увеличением возраста (от зрелого до старческого) скорость продукции активных форм кислорода (АФК) в плазме возрастает как в контрольных группах, так и в группах больных ИБС. С увеличением возраста наблюдается увеличение уровня метаболитов NO в плазме крови больных ИБС относительно зрелой возрастной группы больных ИБС, а в контрольных группах отмечены незначительные колебания уровня метаболитов NO^?. Впервые у здоровых и больных ИБС Ростовской области пожилого и старческого возраста изучены и проанализированы данные о частотах аллелей и распределении генотипов PON1 (Q192R), APOE (L28P), APOC3 (C3238G), ITGB3 (L33P), ITGA2 (C807T), еNOS (С786Т), AGT (T174M и M235T), выявлена ассоциация полиморфных маркеров ряда генов AGT (T174M), ITGB3 (L33P), APOE (L28P), APOC3 (C3238G), eNOS (С786Т) по мере развития ишемической болезни сердца. Впервые изучены сочетания полиморфных аллелей ряда генов PON1 (Q192R), APOE (L28P), APOC3 (C3238G), ITGB3 (L33P), ITGA2 (C807T), еNOS3 (С786Т), AGT (T174M и M235T) у больных ИБС Ростовской области разного возраста, а также связь между окислительным стрессом и полиморфизмом этих генов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Развитие ишемической болезни сердца у лиц различных возрастных групп сопровождается повышением скорости продукции АФК, уровня метаболитов оксида азота, интенсивности процессов ПОЛ в плазме крови и эритроцитах.

2. У лиц различных возрастных групп развитие ИБС сопровождается уменьшением активности ферментов первичного звена антиоксидантной защиты - СОД и каталазы в эритроцитах и увеличением оксидазной активности в плазме крови цирулоплазмина.

3. У больных ИБС с увеличением возраста наблюдается дестабилизация и изменение параметров, отражающих нарушение структурной организации эритроцитарных мембран.

4. С развитием ишемической болезнью сердца у лиц пожилого и старческого возраста появляется ассоциация полиморфизма генов AGT (T174M), ITGB3 (L33P), APOE (L28P), АPOC3 (C3238G) и eNOS (C786T).

5. В развитие ишемической болезни сердца у больных разного возраста Ростовской области вносит вклад сочетание полиморфных аллельных вариантов генов AGТ (Т174М), ITGB3 (L33P) и eNOS (C786T), находящихся в патологическом гомозиготном состоянии.

Научно-теоретическое и практическое значение результатов исследования. Научно-теоретическое значение работы обусловлено гериатрическими аспектами исследования факторов риска ИБС. Полученные данные могут быть использованы как исходные для формирования региональных референтных показателей структурного и функционального состояния мембран эритроцитов у больных ИБС пожилого и старческого возраста. Возможно использование полученных результатов для прогнозирования течения и исхода ряда заболеваний, в частности, сердечнососудистых заболеваний (ССЗ), в старших возрастных группах, планирования и организации адекватных лечебных и профилактических мероприятий и поддержания успешного долголетия.

Полученные результаты характеризуются своей практической направленностью для биохимии, генетики, медицины, биологии развития и являются полезными для выявления окислительного повреждения белков в мембранах, которое, как правило, сопровождается необратимыми поражениями мембраны эритроцитов при ряде заболеваний, в том числе и ИБС. Использование биохимических и молекулярно-генетических методов для оценки состояния прооксидантной и антиоксидантной систем у больных с ИБС в практическом здравоохранении позволит оптимизировать патогенетическую терапию с целью предотвращения развития инфаркта миокарда у пациентов пожилого и старческого возраста, а своевременное выявление низкой антиоксидантной активности крови у лиц, имеющих предрасположенность к развитию сердечнососудистых заболеваний, позволит оптимизировать лечение и проводить первичную профилактику ИБС.

Показано, что исследованные полиморфные маркеры генов AGT (T174M и M235T), ITGB3 (L33P), ITGA2 (C807T), APOE (L28P), eNOS (C786T), APOC3 (C3238G) и PON1 (Q192R) могут использоваться для оценки риска развития ИБС с учетом возраста пациентов. Выявление ассоциации полиморфных маркеров генов с развитием ИБС в зависимости от возраста манифестации заболевания открывает новые перспективы в выделении групп пациентов с высоким риском развития патологии в пожилом и старческом возрасте.

Апробация работы. Материалы, использованные в диссертационной работе, представлялись на V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды (Ростов-на-Дону, 2009), III Международной конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины" (Ростов-на-Дону, 2009), V Международной конференции по биотехнологии и медицине (г. Азов, 2009), VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), всероссийской студенческой конференции «Молодежь XXI века - будущее Российской науки 2010», XL VIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2011), VII Miedzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji «Aktualne problem nowoczesnych nauk» (Przemyls, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 публикаций, в том числе 6 в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Личный вклад автора в опубликованном материале - 85,42%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 188 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, методики, результаты собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающие 345 источников, в том числе 93 работы отечественных и 242 - иностранных авторов. Работа иллюстрирована 20 рисунками, 30 таблицами и 2 приложениями.

Связь темы с основным планом научной работы учреждения. Диссертационная работа выполнена в рамках грантов Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2012» № 02.740.11.5015; и № 14.740.11.0006.

Реализация результатов работы. Результаты данной работы внедрены и используются в учебном процессе кафедр биохимии и микробиологии, генетики факультета биологических наук ЮФУ при чтении лекций по спецкурсам «Основы мембранологии», «Свободные радикалы в живых системах», «Биохимия», «Биология старения», «Медицинская генетика», «Биофизика» и в деятельности клинико-диагностической лаборатории ЗАО «Наука».

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнялась в период с 2009 по 2011 гг. в лаборатории генетики человека Научно-исследовательского института биологии и в лаборатории биохимии факультета биологических наук Южного федерального университета (г. Ростова-на-Дону).

Характеристика обследованных групп. Все участники обледования были разделены на группы, условно названные: Зрелый (I группа, 30-44 лет), средний (II группа, 45-59 лет), пожилой и старческий возраст (III группа, 60-89 лет), согласно возрастной периодизации, принятой Европейским регионарным бюро ВОЗ в 1963 г. и действующей до настоящего времени (Осколова О., 2007).

Для выполнения биохимических обследований в каждой возрастной группе отбирались по 20 человек больных ИБС и по 10 - практически здоровых доноров (контроль).

Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с ИБС проводили, используя три возрастных группы пациентов (каждая группа включала 100 человек). В исследовании отбирались пациенты с ИБС, поступившие в стационар кардиологического отделения Ростовской областной клинической больницы №1. Контрольная группа представляла собой случайную выборку лиц обоего пола, которые не выявляли достоверных признаков ИБС и была разделена также на три возрастных группы (140, 70, 70 человек в I, II и III группах соответственно).

В работе использованы следующие методы исследования:

Биофизические методы исследования. Определение интенсивности Н₂О₂-люминол-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) проводили по методу Шестакова и др. (1979). Регистрировали высоту быстрой вспышки (H) и светосумму (Sm) хемилюминесценции в течение 100 секунд.

Структурное состояние мембран эритроцитов изучали методом латеральной диффузии гидрофобного зонда пирена. Определяли текучесть липидного бислоя и зон белок-липидных контактов, полярность липидного бислоя. Уровень структурных перестроек мембранных белков оценивали по эффективности переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых остатков белков на пирен (Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980; Добрецов Г.Е., 1989). Определение гемоглобина осуществляли с помощью стандартного набора реагентов фирмы «Эколаб» (Россия).

Биохимические методы исследования. Определение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) осуществляли по содержанию первичных продуктов - диеновых конъюгатов (ДК) (Стальная И.Д, 1977), промежуточных - малонового диальдегида (МДА) (с использованием тест - системы OxyStat «Biomedica» (Вена)), конечных - шиффовых оснований (ШО) (Bidlack W.R., Tappel A.L., 1973). Определение содержания метаболитов оксида азота в плазме кров и проводили по методу И.И. Степуро и соавт. (Лобышева И.И. и др., 1999; Степуро И.И. и др., 1997). Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) проводили с использованием тест-системы «Bender Medsystem» (Автралия) (Fried R., 1975) и каталазы (Королюк М.А. и др., 1988). Для определения оксидазной активности церулоплазмина (ЦП) использовали модифицированный методод Ревина (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982) и метод суммарной пероксидазной активности (Лукаш А.И. и др., 1996). Получение липидных экстрактов осуществляли по Блаю и Дайеру (Bligh E.G., Dyer E.G., 1978). Содержание белка в суспензии эритроцитов определяли методом Лоури (1951). Определение активности антиоксидантных ферментов проводили в плазме крови и лизате эритроцитов и пересчитывали с учетом содержания в биологическом материале гемоглобина.

Молекулярно-генетические методы исследования. Геномную ДНК пациентов использовали для амплификации фрагментов ДНК, содержащих полиморфные маркеры ряда генов-кандидатов, предположительно вовлеченных в патогенезе атеросклероза и ишемической болезни сердца. Популяционный анализ полиморфизмов изучаемых генов был проведен с использованием баз данных FIAV (fiav.ru), Ensembl (us.expasy.org), OMIM, NCBI, (www.ncbi.nih.gov). Полиморфизм генов определяли с использованием реагентов «SNP-экспресс» фирмы «Litex» методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе Corbat Reseach (Australia), детекцию продуктов амплификации проводили в агарозном геле методом горизонтального электрофореза, а анализ электрофореграмм под ультрафиолетовой фракцией (УФ) на трансиллюминаторе GelDoc «Biorad» (США).

Методы статистической обработки результатов исследования. Статистическую обработку биохимических данных проводили по методу Монцевичуте-Эрингене (1964). Достоверность полученных различий оценивали с использованием t-критерии Стьюдента для средних арифметических независимых выборок (Лакин В.З., 1990). Для обработки результатов генетического исследования использован метод Х - квадрата с использованием программы STATISTICA 6. Коэффициент несогласия (OR) вычисляли с помощью программы он-лайн Calculator for confidence intervals of odds ratio (http://www.hutchon.net/ConfidOR.htm и http://gen-expert.ru/calculator_or.php).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Интенсивность свободнорадикального окисления в крови и структурное состояние мембран эритроцитов больных ИБС Ростовской области различного возраста.

В данной главе представлены результаты исследования, характеризующие особенности развития окислительного-нитрозильного стресса (ОНС) в крови больных ИБС различного возраста. Для оценки влияния ИБС на биохимические показатели крови проводили их сравнение у больных и здоровых доноров в каждой возрастной группе (p1). Для оценки возрастных особенностей проводили сравнение между I группой (30-44 лет) и двумя остальными (45-59 и 60-89) отдельно условно здоровых доноров (р2) и больных ИБС (р3).

Интенсивность свободнорадикального оксисления в плазме крови и эритроцитах больных ИБС различных возрастных групп

Установлено, что у больных ИБС высота быстрой вспышки (Н) Н₂О₂-люминол индуцированной ХЛ в плазме крови увеличивается на 31% и 18% в I и II возрастных группах, а величина светосуммы возрастает на 18%, 34% и 13%, соответственно, в трех возрастных группах по сравнению с контрольной группой соответствующего возраста (Рис. 1; р1). Это указывает на повышенную продукцию активных форм кислорода (АФК) - супероксидного анион-радикала (О₂^?), гидроксильного радикала (ОН^?), липидных радикалов (LO^?, LO₂^?).

- I группа, - II группа, - III группа

Рис. 1. Изменение интенсивности Н₂О₂- люминол индуцируемой хемилюми-несценции (ХЛ) в плазме крови здоровых доноров и больных ИБС различных возрастных групп.

Обозначения: p₁ - изменение показателя в I, II и III группах больных ИБС по сравнению с контрольной группой соответствующего возраста; p₂ - изменение показателя во II, III группах по сравнению с I группой для контроля и p₃ - для больных ИБС; * - достоверные различия при Р<0,05; ** - при Р<0,01; *** - при Р<0,001; ? - тенденция к изменению (0,05<Р<0,1).

Важную роль в развитии ишемии и реперфузионного синдрома играет оксид азота (NO^?) и продукты его метаболизма. Интенсивность продукции NO исследовали по уровню его метаболитов в плазме крови. Показано, что в условиях развития ИБС наблюдается повышение уровня метаболитов NO в плазме пациентов различного возраста с наибольшим отличием от нормы у III группы больных (Рис. 2; 3).

- I группа, - II группа, - III группа

Рис. 2. Изменение (в %) содержания метаболитов NO в плазме крови доноров и больных ИБС различных возрастных групп. Обозначения как на Рис. 1.

Важнейшим акцептором NO^? в плазме крови является внеэритроцитарный гемоглобин, скорость взаимодействия которого с NO^? в 800 раз выше, чем гемоглобина, локализованного в эритроцитах. Образование нитрозилгемо- глобина (NOHb) можно определить спектрофотометрически по наличию характерного максимума поглощения при длинах возбуждения 545 нм (Степуро И.И. и др., 1997). Показано, что по сравнению с нормой уровень NOHb возрастает на 31%, 34% и 68%, соответственно, в плазме крови трех групп пациентов (Рис. 2, NOHb, р1).

При ИБС наблюдается повышение на 25%, 28% и 76% уровня аддуктов NO^? - RNO_x в плазме крови пациентов всех трех возрастных групп (Рис. 2, RNO_x, p1). Согласно существующим данным (Лобышева И.И. и др., 1999), пероксинитрит (ONOOH), продукт взаимодействия оксида азота и супероксида, может взаимодействовать с тиолами с образованием нитрозоаддуктов типа RSNO_x, которые имеют максимум поглощения, как и пероксинитрит, на 302 нм.

В ходе проведенного исследования обнаружено, что уровень нитрозотиолов (RSNO) возрастает во II и III группах больных ИБС на 33% и 131%, соответственно, относительно нормы. Одновременно при ИБС наблюдается возрастание уровня нитротирозина (NOТир) на 23% и 61% в плазме крови больных II и III группы (Рис. 3, р1).

- I группа, - II группа, - III группа

Рис. 3. Изменение (в %) содержания нитрозотиолов (RSNO) и нитротиозина (NOТир) в плазме крови доноров и больных ИБС различных возрастных групп. Обозначения как на Рис. 1.

Данный метаболит образуется при взаимодействии тирозина с продуктом распада пероксинитрита NO^?₂ (Меньщикова Е.Б. и др., 2006)

Таким образом, в условиях развития ИБС наблюдается повышенная продукция активных форм кислорода и азота, что создает предпосылки для интенсификации ПОЛ в крови.

В ходе проведенного исследования нами установлено, что в плазме крови I, II и III групп больных ИБС содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) - увеличивается, соответственно, на 83%, 45% и 31% относительно нормы (Рис. 4, ДК, р1). Уровень промежуточного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) - в обследованных группах пациентов возрастает на 41-56% (Рис. 4, МДА, р1), а содержание конечных продуктов ПОЛ - шиффовых оснований (ШО) повышается на 24% только в III возрастной группе пациентов (Рис. 4, ШО, р1).

Следует отметить, что при исследовании динамики ПОЛ в плазме крови лиц контрольных групп показано возрастание уровня только первичных молекулярных продуктов ПОЛ - ДК - на 33% и 77% во II и III группах, по сравнению с I возрастной группой (Рис. 4, ДК, р2).

- I группа, - II группа, - III группа

Рис. 4. Относительный прирост уровня продуктов ПОЛ в плазме крови здоровых и больных ИБС различных возрастных групп. Обозначения как на Рис. 1.

В эритроцитах больных ИБС трех возрастных групп отмечено повышение содержания молекулярных продуктов ПОЛ как первичных и вторичных, так и конечных (Рис. 5). Уровень ДК в эритроцитах возрастает на 66%, 34% и 18% в I, II и III группах больных ИБС. Содержание МДА и ШО увеличивается на 24-31% во всех трех возрастных группах пациентов (Рис. 5, р1). Причем, следует отметить, что с увеличением возраста в группах условно здоровых людей наблюдается накопление молекулярных продуктов ПОЛ по сравнению с I возрастной контрольной группой (Рис. 5, р2).

Уровень ДК в эритроцитах II и III контрольных группы возрастает на 39% и 64%, по сравнению с I группой. Содержание МДА в эритроцитах II и III контрольных группы на 17% и 11% выше, чем в I группе, а уровень ШО возрастает на 17% только в III группе относительно группы зрелого возраста.

При сравнении уровня продуктов ПОЛ в эритроцитах больных ИБС различных возрастных групп (относительно I возрастной группы своей категории) установлено, что уровень ДК в эритроцитах повышается на 12% и 17% соответственно у II и III групп больных, а содержание МДА и ШО увеличивается на 13% и 21%, но только в III группе пациентов.

- I группа, - II группа, - III группа

Рис. 5. Относительный прирост уровня продуктов ПОЛ в эритроцитах здоровых и больных ИБС различных возрастных групп. Обозначения как на Рис. 1.

Таким образом, при ИБС отмечена интенсификация ПОЛ в плазме крови и эритроцитах обследованных больных. В плазме крови наблюдается накопление первичных (ДК) и вторичных (МДА) продуктов ПОЛ во всех трех возрастных группах пациентов, а в III группе больных еще и конечных продуктов ПОЛ (ШО) возрастает только.

В контрольных группах с увеличением возраста отмечено повышение уровня только ДК в плазме крови. У больных ИБС в эритроцитах всех трех возрастных групп наблюдается накопление первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ приблизительно в равной степени.

В возрастном аспекте в эритроцитах больных ИБС II и III группы наблюдается повышение интенсивности начальных стадий ПОЛ, а в III группе пациентов активируются промежуточные и конечные стадии свободнорадикального цепного процесса. В контрольных группах по мере увеличения возраста наблюдается заметное повышение уровня ДК, менее выраженное накопление МДА. Содержание в эритроцитах ШО к 60 - 89 годам (III группе) достоверно повышается и в группе здоровых доноров, и в группе больных ИБС.

Активность компонентов антиоксидантной системы крови больных ИБС различных возрастных групп

Как показывает проведенное исследование, у больных ИБС оксидазная активность церулоплазмина (ЦП) в плазме крови повышается на 91%, 48% и 33% в I, II и III возрастных группах, соответственно, по сравнению с возрастной нормой (Рис. 6, ЦП, р1). Следует отметить, что с возрастом активность ЦП в плазме крови изменяется незначительно (Рис. 6, ЦП, р3). При этом в контрольных группах с увеличением возраста от зрелого до старческого оксидазная активность ЦП в плазме крови лиц II и III группы увеличивается на 39% и 34%, по сравнению с лицами зрелого возраста (Рис. 6, ЦП, р2).

Важным интегральным показателем антиокислительной активности плазмы крови является скорость утилизации гидропероксида (). Данный показатель в плазме крови больных ИБС различных возрастных групп повышается, соответственно, на 91%, 31% и 21% относительно контроля (Рис. 6, , р1), что можно рассматривать, как и активацию ЦП, в качестве защитной реакции, препятствующей накоплению гидропероксида и фентоновски активных ионов железа (Fe²⁺).

- I группа, - II группа, - III группа

Рис. 6. Изменение оксидазной активности церулоплазмина (ЦП) и скорости утилизации гидропероксида () в плазме крови доноров и больных ИБС различных возрастных групп. Обозначения как на Рис. 1.

Во II и III группах здоровых лиц скорость утилизации перекиси водорода с возрастом превосходит уровень I группы на 20% и 28%. Вместе с тем, по мере старения в группах больных ИБС отмечается тенденция к снижению на 19-20% параметра в плазме крови (Рис. 6, , р2, р3).

В эритроцитах важнейшими антиоксидантными ферментами первичного звена антиоксидантной защиты являются СОД и каталаза, которые регулируют СРО на стадии активации молекулярного кислорода и зарождения цепного процесса.

Полученные результаты показывают, что в эритроцитах больных ИБС различного возраста активность СОД снижается на 33%, 16% и 27% в I, II и III группах пациентов (относительно контроля). Аналогичная динамика наблюдается в активности каталазы, которая функционирует сопряжено с СОД и расщепляет гидропероксид, продукт реакции дисмутации, с образованием воды и кислорода. В эритроцитах больных ИБС I, II и III возрастных групп активность каталазы снижается на 18%, 13% и 15%, соответственно, (Рис. 7, СОД, р1).

- I группа, - II группа, - III группа

Рис. 7. Изменение активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (Кат) в эритроцитах доноров и больных ИБС различных возрастных групп. Обозначения как на Рис. 1.

Стабильность и структурное состояние мембран эритроцитов больных ИБС различного возраста

В плазме крови больных ИБС трех возрастных групп уровень внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) и суммарной пероксидазной активности (СПА) повышается на 17-50% и 27-36%, что свидетельствует о нарушении стабильности мембран эритроцитов, так как данные показатели рассматриваются как маркеры стабильности эритроцитов (Лукаш А. И. и др., 1996).

Отмечено повышение уровня СПА на 55% в плазме крови III группы условно здоровых лиц, по сравнению с группой лиц зрелого возраста (I группа). При аналогичном сравнении больных ИБС этот показатель оказался выше на 57% (Рис. 8, СПА, р2).

- I группа, - II группа, - III группа

Рис. 8. Изменение уровня внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) и суммарной пероксидазной активности (СПА) в плазме крови доноров и больных ИБС различных возрастных групп. Обозначения как на Рис. 1.

Исследование структурных свойств мембран эритроцитов с помощью флуоресцентного зонда пирена свидетельствует о снижении параметра Fэ/Fм при длинах возбуждения 334 нм на 11-18%, что указывает на соответствующее уменьшение текучести (или повышение микровязкости) липидного бислоя мембран эритроцитов во всех трех возрастных группах больных ИБС. Это может приводить к повышению ригидности эритроцитарной мембраны, нарушению мембранных процессов, ухудшению микроциркуляции.

С увеличением возраста в контрольных группах наблюдается тенденция к снижению на 6% текучести липидного бислоя мембран эритроцитов в III группе условно здоровых лиц, по сравнению с I группой.

Вместе с тем, на фоне повышения микровязкости липидного бислоя эритроцитарных мембран наблюдается повышение параметра Fэ/Fм при длинах возбуждения 282 нм зонда пирена, что свидетельствует о повышении текучести зон белок-липилных контактов (или аннулярных липидов) на 11-27% у больных ИБС. В контрольных группах данный параметр незначительно изменяется с возрастом.

Изменение структурной организации эритроцитарных мембран больных ИБС различного возраста проявляется также в уменьшении параметра Fo-F/Fo зонда пирена на 10-16%, характеризующего снижение эффективности переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых остатков мембранных белков на пирен (Рис. 9). Такие изменения параметра Fo-F/Fo могут свидетельствовать о структурных перестройках в мембранных белках эритроцитов, связанных с их окислительной модификацией вследствие повышенной продукции АФК, АФА и продуктов ПОЛ. Следует отметить, что при сравнении с I группой больных ИБС данный параметр (Fo-F/Fo) снижается у III группы на 14%, тогда как во II группе пациентов не наблюдается достоверных различий.

- I группа, - II группа, - III группа

Рис. 9. Изменение структурного состояния мембран эритроцитов доноров и больных ИБС различных возрастных групп. Обозначения как на Рис. 1.

В то же время в контроле отмечено снижение параметров Fo-F/Fo на 6-8% во II и III группах (по сравнению с I группой) (Рис. 9, Fo-F/Fo, р2). Это свидетельствует о повышении уровня структурных перестроек мембранных белков эритроцитов с возрастом. Полученные результаты показывают, что в мембранах эритроцитов больных ИБС I и II возрастной группы наблюдается повышение параметра F372/F393 при длинах возбуждения 334 нм (Рис. 9, F372/F393, р1). С увеличением возраста в группах доноров показана тенденция к повышению полярности липидного бислоя эритроцитарных мембран в III группе доноров по сравнению с I группой (Рис. 9, F372/F393, р2).

Таким образом, проведенное исследование показывает, что при ишемии миокарда наблюдаются нарушения стабильности и структурной организации эритроцитарных мембран, которые в ряде случаев усиливаются с возрастом.

Нарушение структурного состояния мембран эритроцитов больных ИБС различного возраста характеризуется противоположными изменениями текучести липидного бислоя, которая снижается, и текучести аннулярных липидов, которая увеличивается, структурными перестройками мембранных белков и повышением полярности внутренних гидрофобных областей мембран. Нарушение стабильной (по уровню СПА) и структурной организации мембран эритроцитов (по уровню структурных перестроек мембранных белков) более выражены в III возрастной группе больных ИБС, по сравнению с I группой пациентов.

В контрольных группах с увеличением возраста также наблюдаются снижение стабильности и изменение структурного состояния мембран эритроцитов, имеющие одинаковую направленность со сдвигами структурного гомеостаза, наблюдающегося при ИБС, и относящиеся к возраст-ассоциированными патологиями.

Возрастная ассоциация частот аллелей и генотипов по полиморфным маркерам ряда генов кандидатов ишемической болезни сердца у жителей Ростовской области.

Основной подход к изучению роли молекулярно-генетических факторов в развитие ИБС связан с выявлением группы генов с потенциально наибольшим вкладом в патогенез заболевания. Были исследованы гены-кандидаты одновременно нескольких систем: некоторые гены белков метаболизма липидов (ген АРОЕ, ген APOC3, ген PON1), гены белков свертывающей системы крови и фибринолиза (ген ITGB3, ген ITGA2), а также ген AGT и ген еNOS.

Частота встречаемости полиморфных маркеров T174M и M235T гена AGT у больных ИБС и здоровых разных возрастных групп

При исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера T174M гена AGT установлено, что во всех трех возрастных группах, частота гетерозиготных носителей генотипов ТМ гена AGT составила 0,27, 0,23 и 0,38, соответственно, а частота гомозиготных генотипов по полиморфному аллелю зафиксирована в 0,06 и 0,10 и 0,10, соответственно.

При исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера T174M гена AGT в группах с ИБС и в контрольных группах разного возраста статистически достоверные различия были обнаружены только для III возрастной группы. Было показано, что носители аллеля М (OR = 2,31 при 95% CI (1,33 - 4,03)) и генотипов ТМ (OR = 1,65 при 95% CI (0,85 - 3,20)) и MМ (OR = 7,67 при 95% CI (0,96 - 61,33)) полиморфного маркера Т174М гена AGT имеют повышенный риск к развитию ИБС, в то время как носители аллеля Т (OR = 0,43 при 95% CI (0,25 - 0,75)) и генотипов TT (OR = 0,43 при 95% CI (0,23 - 0,83)) - пониженный риск развития этого заболевания. Таким образом, полиморфизм Т174М гена AGT ассоциирован с развитием ишемической болезни сердца у лиц пожилого и старческого возраста, проживающих в Ростовской области.

Распределение частот генотипов полиморфного маркера Т174М гена AGT у лиц пожилого и старческого возраста Ростовской области соответствует равновесию Харди-Вайберга, данные могут быть проанализированы с применением мультипликативной моделей, которая предполагает, что пенетрантность зависит от количества копий предрасполагающего аллеля.

При сравнении частот генотипов полиморфного маркера М235Т гена AGT в группе больных ИБС и в контрольной группе соответствующего возраста статистически достоверные различия были получены только для I группы. Было показано, что распределение частот генотипов II и III возрастных групп достоверно отличается от I.

При анализе распределения частот аллелей полиморфного маркера М235Т гена AGT различных возрастных группах относительно контрольной группы, статистически достоверные различия были обнаружены только для первой возрастной группы. Было показано, что носители аллели М (OR = 2,11 при 95% CI (1,45 - 3,06)) и генотипов ММ (OR = 10,64 при 95% CI (5,00 - 22,61)) и TT (OR = 1,10 при 95% CI (0,55 - 2,20)) полиморфного маркера М235Т гена AGT имеют повышенный риск развития ИБС, в то время как носители аллеля Т (OR = 0,47 при 95% CI (0,33 - 0,69)) и генотипов МТ (OR = 0,18 при 95% CI (0,10 - 0,32)) - пониженный риск ее развития. Таким образом, у жителей Ростовской области, имеющих полиморфизм М235Т гена AGT, выявлен повышенный риск возникновения ИБС в возрасте 30-44 лет.

Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера L33P гена ITGB3 у больных ИБС и здоровых различных групп

Анализ распределений частот генотипов полиморфного маркера L33P гена ITGB3 у здоровых и больных ИБС соответствующего возраста показал наличие статистически достоверных различий во всех трех возрастных группах. При сравнении II и III возрастных групп больных ИБС с I, различия наблюдались только между II и I. Было показано, что чем старше возрастная группа больных ИБС, тем меньше в ней гомозигот РР и больше гетерозигот LP. В исследуемой нами выборке здоровых жителей Ростовской области гомозигот по полиморфному аллелю 33Р гена ITGB3 не обнаружено. Можно предположить, что гомозиготы по аллелю 33Р гена интегрина в-3 обладают низкой жизнеспособностью и элиминируются на поздней стадии индивидуального развития.

При анализе распределения частот аллелей полиморфного маркера L33P гена ITGB3 было обнаружено статистически достоверное отличие лиц пожилого и старческого возраста , больных ИБС, от контрольной группы. Таким образом, полиморфизм L33P гена ITGB3 ассоциирован с развитием ишемической болезни сердца у жителей пожилого и старческого возраста Ростовской области. Было показано, что носители аллелей P (OR = 4,45 при 95% CI (2,17 - 9,12)) и генотипов LP (OR = 3,23 при 95% CI (1,47 - 7,09)) и PP (OR = 12,96 при 95% CI (0,74 - 228,29)) имеют повышенный риск развития ИБС, в то время как носители аллелей L (OR = 0,22 при 95% CI (0,11 - 0,46)) и генотипов LL (OR = 0,22 при 95% CI (0,10 - 0,48)) - пониженный риск развития ИБС.

Частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера С807Т гена ITGA2 (GPIa) у лиц с ишемической болезнью сердца в связи с возрастными градациями

При сравнении частот генотипов полиморфного маркера С807Т гена ITGA2 у здоровых лиц и больных ИБС соответствующего возраста было показано, что у больных ИБС II и III возрастных групп частота гетерозиготных генотипов повышается с увеличением возраста.

При анализе распределения частоты встречаемости аллелей полиморфного маркера C807T гена ITGA2 трех возрастных группах с ИБС относительно контрольных групп соответствующего возрастного контингента было получено достоверное различие только для I группы. Таким образом, полиморфизм С807Т гена ITGA2 ассоциирован с развитием ИБС у лиц зрелого возраста. Было показано, что носители аллелей Т (OR = 5,88 при 95% CI (3,72 - 9,30)) и генотипов СТ (OR =4,15при 95% CI (2,35 - 7,31)) и ТТ (OR = 15,15 при 95% CI (3,43 - 66,95)) имеют повышенный, а носители аллелей С (OR = 0,17 при 95% CI (0,11 - 0,27)) и генотипов СС (OR = 0,12 при 95% CI (0,07 - 0, 22)) - пониженный риск развития ИБС.