Сочетанное воздействие химического и радиационного факторов низкой интенсивности на цитогенетические и биохимические реакции организма экспериментальных животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Сочетанное воздействие химического и радиационного факторов низкой интенсивности на цитогенетические и биохимические реакции организма экспериментальных животных

БАРАНЦЕВА М.Ю.

МОСКВА - 2007

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Мухамедиева Лана Низамовна доктор медицинских наук Федоренко Борис Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Штемберг Андрей Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор Бородавко Виктор Константинович

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины МО РФ, г. Москва

Защита состоится "18" мая 2007 г в _______________ на заседании диссертационного Совета К 002. 111. 01 в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (123007, Москва, Хорошевское шоссе, 76-а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем РАН.

Автореферат разослан "___"______________ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И.П. Пономарева

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В условиях длительных пилотируемых космических полетов участники экспедиции подвергаются сочетанному воздействию химического и радиационного факторов низкой интенсивности. На современном этапе развития пилотируемой космонавтики при подготовке к длительным межпланетным экспедициям актуальность изучения сочетанного влияния на организм человека химического и радиационного факторов стала одной из основных проблем медико-биологического обеспечения безопасности человека. В связи с этим, для сохранения здоровья и работоспособности космонавтов, как в период осуществления профессиональной деятельности, и, особенно важно, в отдаленные сроки после её завершения, необходимо изучение физиологических возможностей организма на донозологическом уровне при длительном сочетанном воздействии низких доз ионизирующего излучения и комплекса химических веществ в концентрациях, характерных для воздушной среды пилотируемых космических аппаратов. Учитывая, что дальнейшее освоение космического пространства будет идти по пути удлинения сроков пребывания человека на космических орбитах, проблема сочетанного воздействия исследуемых факторов космического полета приобретает особую актуальность.

Исследования сочетанного действия химического и радиационного факторов низкой интенсивности на организм человека и животных в основном проводились в районах, подвергшихся химическому и радиационному загрязнению окружающей среды вследствие радиационных аварий (авария на чернобыльской атомной электростанции), химических выбросов в атмосферу при работе производственных предприятий. Сочетанное радиационно-химическое воздействие сопровождалось преимущественно эффектами синергизма и характеризовалось более выраженными метаболическими и цитогенетическими нарушениями в организме животных в отличие от изолированного воздействия повреждающих факторов [А.Ф. Маленченко, 1989; С.И. Заичкина, О.М. Розанова, Г.Ф. Аптикаева, 2001; С.Д. Иванов, В.В. Семенов, Е.Г. Кованько, 2002; W. Burkart, G.L. Finch, T. Jung, 1997; J. Lubin, 1998]. Проведенные исследования подтверждают необходимость изучения биологических эффектов при одновременном воздействии на организм химического и радиационного факторов низкой интенсивности, характерных для длительных пилотируемых космических полетов.

В настоящее время проведено большое количество экспериментальных исследований по моделированию изолированного воздействия химического и радиационного факторов космического полета на организм человека и животных [В.П. Савина, 1986; С. Каландаров, В.П. Бычков, В.А. Коршунов и др.,1987; Л.Н. Мухамедиева, Е.И. Никитин 2001; В.В. Цетлин, Е.А. Дешевая, Н.Д. Новикова, 2002; Л.Н. Мухамедиева, 2003; С.В. Ворожцова, Б.С. Федоренко, В.В. Цетлин, 2004]. Однако данные исследования проводились без учета модифицирующего влияния на организм химических веществ и ионизирующего излучения при сочетанном их воздействии.

Для изучения биологических эффектов низких доз ионизирующего излучения в опубликованных работах в качестве низких доз часто используется диапазон от 1 до 50 сГр. В свою очередь суммарная обобщенная доза, получаемая космонавтами при осуществлении длительных пилотируемых полетов от детерминированных источников (галактические космические лучи и радиационные пояса земли) в период максимума солнечной активности по расчетам ряда авторов [А.В. Шафиркин, В.П. Венедиктова, А.В. Коломенский и др.,1998] составляет около 6 бэр в год, а при межпланетных полетах при толщине защиты 10 г/см2, возможно, будет достигать 23 бэр в год. Согласно методическим указаниям по ограничению облучения космонавтов при околоземных космических полетах основной предел эквивалентной дозы космонавта за космический полет продолжительностью до 1 года не должен превышать 0,5 Зв. Следовательно, при моделировании сочетанного воздействия химического и радиационного факторов актуально использование доз ионизирующего излучения, которые бы не превышали 50 сГр и были наиболее приближены к реальным условиям пилотируемых полетов.

Для изучения сочетанного радиационно-химического воздействия на организм были выбраны химические вещества, которые вносят основной вклад (90-95 %) в суммарную загрязненность воздушной среды и входят в приоритетный перечень веществ определяющих качество воздушной среды пилотируемых космических аппаратов (ГОСТ Р50 804 и SSР 50 260) [Л.Н. Мухамедиева, 2003].

Для оценки биологических эффектов химического и радиационного факторов низкой интенсивности, по данным ряда отечественных и зарубежных авторов, актуально использование цитогенетических и биохимических показателей [Л.Н. Мухамедиева, Е.И. Никитин, 2001; Л.Н. Мухамедиева, 2003; С.В. Ворожцова, А.В. Шафиркин, Б.С.Федоренко, 2006; N.M. Bil'ko, N.F. Starodub, V.G. Bebeshko, 1996; N.M. Gulaya, V.M. Margitich, A.A. Chumak, 2000].

Цель исследований. Целью исследований являлось изучение сочетанного воздействия химического и радиационного факторов низкой интенсивности на цитогенетические и биохимические реакции организма экспериментальных животных.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Проведение сравнительной оценки биохимических показателей крови, метаболического статуса эритроцитов, гистохимических исследований липидов ткани легкого и выявление из них наиболее информативных показателей для токсикологической оценки комбинированного воздействия химических веществ в низких концентрациях (ПДКпка) с однонаправленным биоэффектом на организм животных.

2. Изучение влияния комбинированного воздействия изоэффективных концентраций химических веществ (ацетон, ацетальдегид, этанол, аммиак) на характер и динамику хромосомных аберраций в кариоцитах костного мозга, биохимические изменения периферической крови и показатели метаболизма эритроцитов.

3. Изучение биологических эффектов в организме экспериментальных животных при многократном воздействии гамма-излучения в суммарной дозе 30 сГр на основании цитогенетических и биохимических исследований.

4. Установление изменений динамики цитогенетических, биохимических и гематологических показателей при сочетанном влиянии химического и радиационного факторов низкой интенсивности.

Научная новизна. Впервые при исследовании сочетанного воздействия химического и радиационного факторов низкой интенсивности на хромосомный аппарат клеток костного мозга и метаболизм в эритроцитах лабораторных животных в дозах и концентрациях, характерных для среды обитания пилотируемых орбитальных станций показано, что совместное воздействие химических веществ в низких концентрациях и гамма-излучения в низких дозах оказывает эффект частичной суммации по сравнению с изолированным влиянием исследуемых факторов.

Практическая и научная значимость работы. Результаты исследований сочетанного радиационного и химического воздействия позволят разработать медико-технические требования к системам жизнеобеспечения направленные на обеспечение безопасности экипажа при осуществлении длительных космических полетов, осуществляемых в настоящее время и в перспективе при полете к Марсу. Результаты сравнительной характеристики динамики показателей цитогенетических нарушений и метаболизма эритроцитов показали, что изменения метаболического статуса эритроцитов могут быть использованы в качестве тест - маркера для оценки состояния здоровья космонавтов при осуществлении длительных межпланетных пилотируемых полетов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Длительное воздействие комплекса химических веществ с однонаправленным биоэффектом в изоэффективных концентрациях (соответствующих ПДКпка) оказывает более выраженное нарушение деления ядросодержащих клеток костного мозга и сопровождается отсутствием восстановления функциональных сдвигов метаболизма эритроцитов после окончания воздействия по сравнению с влиянием гамма-излучения в суммарной дозе 30 сГр.

2. При сочетанном радиационно-химическом воздействии на организм животных биоэффект химических веществ в низких концентрациях является доминирующим по результатам анализа видов хромосомных аберраций в кариоцитах костного мозга.

3. Сочетанное воздействие гамма-излучения в суммарной дозе 30 сГр и комплекса изоэффективных концентраций химических веществ в низких концентрациях на организм экспериментальных животных приводит к частичной суммации биологических эффектов.

Апробация работы. Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 9-й Международной конференции «Системный анализ и управление», Крым, Евпатория, 2004 г.; 4-й Молодежной конференции к 10-летию со дня окончания сверхдлительного космического полета врача - космонавта Полякова В.В., Москва, 2005 г.; 5-й конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной Дню космонавтики, Москва, 2006 г.; 13-й конференции «Космическая биология и авиакосмическая медицина» к 45-летию первого полета человека в космос, Москва, 2006 г.; 4-й Международной конференции «Авиация и космонавтика-2005», Москва, 2005 г.

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Диссертация апробирована на заседании секции по «Космической медицине» Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

Реализация полученных результатов. Результаты исследований по комбинированному воздействию химических веществ с однонаправленным биоэффектом в концентрациях на уровне ПДКпка использованы при разработке международного нормативного документа для МКС: «Medical Operation Requirements Document Revision B (MORD)» SSP 50260 Air Qualiti, 2004 и международного программного документа для МКС: International Space Station Program «Basic Provisions on Crew Actions in the Event of a Toxic Release on the International Space Station» SSP 50653-01, 2004.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты проведенных исследований, обсуждение результатов), заключения, выводов, списка литературы, приложения и содержит 128 машинописных страниц, включающих 34 таблицы, 5 рисунков. Список литературы включает 206 работ, из них 156 отечественных и 50 зарубежных.

2. Содержание работы

Материалы и методы исследований

В экспериментах использовано два вида мелких лабораторных животных: 300 половозрелых мышей-самцов массой 20-23 г линии F1(CBAЧC57BL6) и 64 крысы-самца массой 180-220 г линии Wistar. Животных содержали на стандартном пищевом рационе с двухнедельным карантином в условиях вивария.

Опытная группа животных состояла из 180 мышей и 40 крыс. Кроме того, 120 мышей и 24 крысы составляли группу виварного и гермокамерного контролей.

Исследования на животных при моделировании длительного сочетанного воздействия комплекса химических веществ и ионизирующего излучения низкой интенсивности проведены в 4 сериях экспериментов продолжительностью от 30 до 60 суток:

Основные направления и объем экспериментальных исследований представлены в табл. 1.

Методика проведения экспериментов.

Исследования проводили на испытательном стенде для санитарно-химических и токсикологических исследований (УМБИ-1) Государственного Научного Центра РФ - Институт медико-биологических проблем РАН. Экспериментальный стенд (объемом 12 м3) рассчитан на длительное пребывание животных и оснащен автономными системами жизнеобеспечения, которые используются в пилотируемых космических аппаратах (ПКА). С помощью автономной системы очистки и регенерации воздуха поддерживались концентрации основных газов (кислород, углекислый газ), химических примесей в пределах ПДК для герметичных помещений, а также заданные параметры температуры и влажности воздуха.

Концентрацию кислорода (21 ± 2%), углекислого газа (0,05-0,2%), температуру (24 ± 20С) и относительную влажность воздуха (65 ± 3%) контролировали круглосуточно. Концентрация аммиака в воздухе составляла 0,05-2,2 мг/м3.

Затравочная смесь состояла из ацетона, ацетальдегида и этанола. Концентрации этих веществ в гермокамере в течение всего экспериментального периода колебались в пределах 0,67-1,4; 0,86-1,75; 3,78-9,91 (мг/м3 ) соответственно и не превышали ПДКпка.

Затравку химической смесью проводили непрерывно в течение экспериментального периода. Дозирование и поддержание постоянных концентраций ацетона, ацетальдегида, этанола в воздухе экспериментальной камеры осуществлялось методом диффузии через пористые полимерные материалы. Дозатор состоит из герметичного металлического стакана, объем которого на 2/3 заполнен стекловолокном. Так как воздух подавался в дозатор, а, следовательно, и выходил из него с постоянной скоростью, то вымывание вещества с поверхности стекловолокна происходило так же с постоянной скоростью. Поэтому количество вещества, поступающего в гермокамеру, было прямо пропорционально количеству воздуха, подаваемого из дозатора, и времени его дозирования.

Временная зависимость определялась в модельных экспериментах при отработке методики создания и поддержания заданных концентраций ацетона, ацетальдегида, аммиака, этанола.

Таблица 1. Объем и структура экспериментальных исследований

Виды воздействия	Длительность экспериментов, сутки	Виды и кол-во животных	Исследования костного мозга	Биохимические исследования (кол-во проб плазмы крови)	Метаболизм эритроцитов (кол-во проб крови)	Гистохимические исследования ткани легкого (кол-во образцов)	Гематологичес- кие исследова- ния (кол-во образцов крови)
			кол-во анафаз (ХА)	кол-во образцов костного мозга (кариоциты)
Комбинированное действие химических веществ (ПДКпка)	30	крысы (линии Вистар) 64	-	-	64	64	64	64
Комбинированное действие химических веществ (ПДКпка)	30	мыши F1(СВАЧС 57BL6) 100	2148	100	50	31	-	100
Гамма-излучение (30 сГр)	30	мыши F1(CВАЧС 57 BL6) 100	1984	100	32	18	-	100
Сочетанное действие химических веществ и гамма-излучения	60	мыши F1(CBAЧC 57BL6) 100	1849	100	46	15	-	100
Общее количество животных: крысы - 64, мыши - 300
Общее количество анализов	5981	300	192	64	64	364

Метод обеспечивал в течение длительных экспериментов стабильность заданных концентраций химических веществ в воздухе гермокамеры (ошибка измерения составляла ±10%).

Содержание в гермокамере ацетона, ацетальдегида и этанола и аммиака определяли 1 раз в сутки. Предварительно отбирали пробы воздуха с помощью газового шприца из гермокамеры. Полученные газовые пробы вводили в набивные разделительные колонки газового хроматографа. Анализ проб воздуха проводили методом газовой хроматографии (газовые хроматографы - Хьюлетт-Паккард, модели HP 58890 и Вариан-Аэрограф, модели 2860). Расшифровку хроматограмм, идентификацию органических веществ и количественную оценку их в анализируемых пробах проводили с использованием компьютерной техники. Для оперативного анализа аммиака и окиси углерода использовали линейно-колористический метод (индикаторные трубки фирмы «Dreger»).

Облучение мышей низкими дозами гамма-излучения проводили в лаборатории радиобиологии тяжелых ионов в Дубне. Животных подвергали общему равномерному гамма-облучению на установке PX-г-30 с источником излучения 60СО. Мощность дозы составляла 0,32 сГр/мин, длительность экспозиции - 3 мин. За это время животные получали дозу ~ 1,0 сГр ежедневно. Суммарная доза облучения за 30 дней составила ~ 30,0 сГр.

Исследование сочетанного воздействия комплекса химических веществ в концентрациях, соответствующих ПДКпка и гамма-излучения в суммарной дозе 30 сГр проведено в 60-суточном эксперименте. После 30-ти суточного воздействия комплекса химических веществ животных подвергали в течение 30 суток гамма-облучению в суммарной дозе 30 сГр.

Мышей забивали методом цервикальной дислокации. Забой животных производили на 10, 20, 30 сутки экспериментального периода и на 14, 30 сутки периода восстановления. В те же сроки забивали животных контрольной группы, не подвергавшихся облучению и химическому воздействию.

Экспериментальные исследования на животных проводились с учетом всех норм и правил биомедицинской этики.

Исследования костного мозга. Определение общего количества ядросодержащих клеток костного мозга проводилось по стандартной методике [J.M. Mantz, 1957]. После извлечения бедренной кости её помещали в стаканчик емкостью 50 см 3, содержащий 8 см3 3% раствора ледяной уксусной кислоты, слегка подкрашенной метиленовым синим. Кость мелко дробили ножницами. Образовавшую эмульсию сливали в пробирку емкостью 20 см 3. Подсчет общего количества ядросодержащих клеток проводили в камере Горяева.

Анализ количества клеток костного мозга с хромосомными аберрациями в виде мостов и фрагментов проводили с использованием анафазного метода [Г.П. Груздев, 1968].

Гидролиз мазков костного мозга осуществляли с помощью водяной бани в 1-нормальном растворе соляной кислоты при температуре 55-540С. Окраску препаратов для цитогенетического исследования проводили с помощью 0,05% раствора метиленового синего.

Биохимические исследования проводили в гепаринизированной плазме крови животных, используя стандартные коммерческие наборы производства фирмы “DiaSys” (Германия). Определяли активность аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), креатинфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), альфа-гидроксибутиратдегидрогеназы (ОБДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), холинэстеразы (ХЭ), амилазы, а также концентрацию глюкозы, холестерина, триглицеридов, креатинина, мочевины, мочевой кислоты, общего белка и альбумина. Общий билирубин измеряли наборами фирмы “Cormay” (Польша) на биохимическом автоанализаторе “Targa BT 3000” (Италия). Малоновый диальдегид определяли методом [К. Yagi, 1976] на спектрофлуориметре модели 650-60 фирмы “Hitachi” (Япония), активность каталазы - методом [М.А. Королюк и соавт.,1988] на спектофотометре “Beckman DU 530” (США). Активность алкогольдегидрогеназы определяли посредством оптического теста Варбурга, используя этанол в качестве субстрата. Плазму крови в каждой пробе суммировали от 4 мышей [А.А. Маркин, О.А. Журавлева, 2006].

Гистохимические исследования ткани легкого крыс на жирно-кислотный состав и общее содержание липидов. Фракции липидов экстрагировали из 0,1 мг ткани с помощью перегнанных органических растворителей - изопропилового спирта и хлороформа. Жирно-кислотный состав липидов определяли газохроматографическим методом на газовом хроматографе “Цвет-110“ после высушивания экстрактов липидов в токе азота и последующего метилирования с помощью 12% раствора гидроокиси тетраметиламмония в смеси метанол-изопропанол (1:1) и йодистого метила [Н.М. Ватуля, В.П. Найдина ,1980].

Гематологические исследования содержания гемоглобина и форменных элементов крови проводили по общепринятым методикам [Л.В. Козловская, А.Ю. Николаев, 1984] с использованием прибора «Целлоскоп-134» фирмы «Medata».

Метаболизм эритроцитов оценивали по содержанию аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), лактата, восстановленного глутатиона (gSH), активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и гексокиназы (ГК) спектрофотометрическими методами [E.M.D. Beutler, 1971]; [С.М. Иванова, О.И. Лабецкая, 2006].

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента, корреляционного и дисперсионного анализа и пакетов программ Statgraf и Excel [В.Ю. Урбах, 1975]. Различия считали достоверными при Р<0,05.

Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента корреляции методом «Зет» Фишера. Коэффициент корреляции считали достоверным при r>r крит (Р=0,005). Исключение отдельных значений, не входящих в генеральную совокупность выборки, производили по критерию Dixon [Л. Закс, 1976].

Результаты исследований и их обсуждение

Биохимические и гистохимические показатели при комбинированном воздействии химических веществ в низких концентрациях на организм лабораторных животных.

В данной главе приведены результаты исследований по определению наиболее информативных показателей, которые могут быть использованы для адекватной оценки влияния на организм смеси химических веществ с однонаправленным биоэффектом в концентрациях на уровне 1-1,5 ПДКпка.

Непрерывное 30 суточное воздействие смеси химических веществ не оказало влияния на величину таких интегральных показателей состояния организма животных, как гемоглобин, количество эритроцитов, массу тела, функциональное состояние печени и миокарда, а также на общее содержание и жирно-кислотный состав липидов ткани легкого экспериментальных животных.

Прирост массы тела животных составил в среднем 47,0±2,4 г (от 180 до 220 г), величина гемоглобина крови не изменялась и находилась в пределах 156,6 - 160,0 г/л на протяжении всего экспериментального периода.

Анализ комплекса биохимических показателей при токсикологической оценке комбинированного воздействия химических веществ в ПДКпка показал высокую чувствительность метаболического статуса эритроцитов крови экспериментальных животных (крыс) в ответ на воздействие повреждающего фактора.

Воздействие используемого комплекса химических веществ приводит к компенсаторным изменениям метаболических параметров в эритроцитах с тенденцией к повышению энергообразующих процессов в организме животных и нормализацией метаболических параметров в эритроцитах к 14 суткам периода восстановления [В.В. Поляков, С.М. Иванова, В.Б. Носков, 1998].

Влияние комбинированного воздействия химических веществ в низких концентрациях на организм экспериментальных животных.

Длительное комбинированное воздействие смеси химических веществ в концентрациях на уровне ПДКпка не оказало влияния на массу тела, а также на массу органов иммунной и репродуктивной систем экспериментальных животных (мышей). Прирост массы тела животных на протяжении всего экспериментального периода составил в среднем 5,0±0,6 (24,0 - 29,0 г) и 4,1±0,5 г (25,0-29,0) в экспериментальной и контрольной группах соответственно.

Для оценки количества структурных повреждений хромосом в кариоцитах костного мозга проанализировано 2148 клеток на стадии деления поздней анафазы - ранней телофазы. Установлено, что длительное комбинированное воздействие химических веществ приводит к повышению количества хромосомных аберраций в кариоцитах костного мозга до 2,8 % (Р<0,01) (табл. 2). Важно отметить, что увеличение количества хромосомных аберраций происходило главным образом за счет фрагментов (96,4 %) (рис. 1). Количество мостов составляло лишь 3,6 %. Увеличение содержания аберрантных клеток с фрагментами по сравнению с количеством клеток с мостами указывает на менее выраженную способность хромосом к воссоединению [Б.С. Федоренко, А.В Ершов, Н.П. Щербак и др., 2002]. Через 14 суток после прекращения воздействия смеси химических веществ, на фоне гибели и последующей элиминации поврежденных клеток из организма наблюдалось снижение частоты аберрантных митозов до 1,9 %, статистически значимо не отличаясь от контрольных данных.

Таблица 2. Изменение числа хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей при длительном комбинированном воздействии смеси химических веществ в концентрациях на уровне ПДКпка.

Аберрантные митозы, %	Количество проанализированных анафаз	Количество и виды хромосомных поломок	Сроки исследования, сутки
		мосты	фрагменты
1,5±0,4	324	-	5	10
2,8±0,4*	392	-	11	20
2,7±0,2*	257	1	6	30
1,9±0,5	290	-	5	14 сутки восстановительного периода
1,2±0,3	445	3	3	Виварный контроль
0,9±0,5	440	2	3	Гермокамерный контроль

Рис. 1. Частота (%) обнаружения видов хромосомных аберраций в кариоцитах костного мозга мышей при изолированном и сочетанном радиационно-химическом воздействии.

Хромосомные нарушения в кариоцитах костного мозга сопровождались изменением метаболического статуса эритроцитов периферической крови (рис. 2).

При анализе динамики обменных процессов в эритроцитах мышей прослеживалось фазовое течение приспособительных реакций с активацией энергообразующих процессов к 10 суткам экспериментального периода и стабилизацией интенсивности гликолиза к 20 и 30 суткам в период воздействия смеси химических веществ. Активация гликолитических процессов в эритроцитах отражает развитие приспособительных реакций организма, направленных на поддержание энергетических затрат, связанных с детоксикацией химических веществ. Характерной особенностью воздействия химического фактора низкой интенсивности на протяжении всего экспериментального периода явилось низкое содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах, свидетельствующее о пониженной клеточной резистентности и связано, вероятно, с токсическим действием смеси химических веществ на мембраны клеток [Е.С. Северин, 2003]. хромосомный костный мозг метаболизм

После прекращения воздействия химических веществ на организм животных к 14 суткам восстановительного периода не происходило стабилизации обменных процессов в эритроцитах. Снижение активности анаэробных процессов в клетках сопровождалось активацией окислительных реакций.

Рис. 2. Метаболизм эритроцитов (мкМ/г Нв) мышей при воздействии изоэффективных концентраций смеси химических веществ.

Реакция костного мозга мышей в ответ на длительное воздействие химических веществ низкой интенсивности проявлялась в виде увеличения количества кариоцитов к 10 суткам экспериментального периода на 8,2 % относительно групп виварного и гермокамерного контролей (Р<0,05) с последующим восстановлением численности гемопоэтических клеток (табл. 3). Временное увеличение клеток костного мозга, по-видимому, обусловлено компенсаторным усилением пролиферативной активности клеточной популяции в ответ на действие повреждающего фактора. К 14 суткам периода последействия общее число ядросодержащих клеток костного мозга оставалось сниженным и составляло 43,1±2,5 млн (Р<0,05), статистически значимо отличаясь от контрольных значений.

Временное повышение количества кариоцитов костного мозга сопровождалось увеличением количества лейкоцитов в периферической крови до 15,4±1,0 тыс/мм3 (Р<0,05) (табл. 3). Данная реакция может быть связана с усилением лейкопоэтической функции костного мозга в этот период. Однако уже к 30 суткам химического воздействия количество лейкоцитов снизилось до 9,8±0,7 тыс/мм3, находясь на уровне контрольных значений.

Таблица 3. Изменение количества кариоцитов костного мозга (млн.) и лейкоцитов периферической крови (тыс/мм3) мышей при комбинированном действии изоэффективных концентраций смеси веществ.

Исследуемые показатели	Гермокамерный контроль	Виварный контроль	Сроки исследования, сутки	Восстанови-тельный период, сутки
			10	20	30	14
Количество кариоцитов	64,4±3,4	62,7±2,3	69,7±3,5*	63,5±3,8	64,5±2,9	43,1±2,5*
Количество лейкоцитов	11,6±2,1	12,3±1,8	14,9±0,5*	15,4±1,0*	9,8±0,7	9,4±0,7

*- показатели достоверны по отношению к виварному и гермокамерному контролю, Р<0,05.

Проведенные биохимические исследования плазмы крови показали, что комбинированное действие химических веществ в низких концентрациях не вызывает существенных нарушений обмена веществ в органах-«мишенях»: печень, миокард, почки. К 10 суткам химического воздействия наблюдалось незначительное снижение интенсивности метаболических процессов в организме животных и активация перекисного окисления липидов, с последующей стабилизацией обменных процессов.

Цитогенетические, биохимические и гематологические исследования в организме экспериментальных животных после воздействия гамма - излучения в низких дозах.

На протяжении всего экспериментального периода масса тела животных опытной группы не отличалась от контрольной группы и колебалась в пределах физиологической нормы (18.1-22.0 гр.). Многократное воздействие гамма-облучения сопровождалось обратимым повышением массы тимуса и селезенки до 0,39 % и 0,54 % (Р<0,05) соответственно. Это может быть связано с активацией пролиферативных процессов в органах в ответ на воздействие радиационного фактора. Показано также снижение массы семенников (Р<0,05), по-видимому, обусловленное гибелью части клеток и запустением семенных канальцев, уменьшением размеров и количества половых клеток в органе, связанных с задержкой сперматогенеза [Е.Ф. Конопля, 2001]. К 30 суткам периода восстановления масса семенников оставалась сниженной, составляя 0,68 % против 0,82 % у необлученных мышей (Р<0,05).

Для определения числа хромосомных аберраций в виде мостов и фрагментов было проанализировано 1984 клетки на стадии поздней анафазы - ранней телофазы (табл. 4). В ходе исследований установлена нелинейная зависимость частоты цитогенетических нарушений от дозы ионизирующего излучения. Так, при достижении суммарной дозы облучения 10 сГр количество хромосомных аберраций было выше (1,7 %), чем при дозе 20 сГр, когда число аберрантных митозов приближалось к контрольному уровню (1,0 %). Возможно, повышение радиорезистентности кариоцитов костного мозга происходит в результате включения репарационных процессов при достижении определенного уровня повреждения клеток [B. Marples, M.C. Joiner, 1993].

Дальнейшее повышение суммарной дозы облучения до 30 сГр (30 сутки экспериментального периода) способствовало увеличению хромосомных аберраций, количество которых достигало 2,6 % (Р<0,01). К 14 и 30 суткам периода восстановления частота аберрантных митозов снижалась и составляла 1,6 и 1,0 % соответственно, свидетельствуя об элиминации поврежденных клеток из организма облученных животных. При анализе видов хромосомных поломок в клетках костного мозга мышей (рис. 1) при воздействии низких доз ионизирующего излучения показано, что 66,7 % аберраций хромосом приходилось на количество мостов и 33,3 % - на количество фрагментов, отражая высокую способность кариоцитов костного мозга к восстановлению хромосомного аппарата клеток.

Таблица 4. Изменение числа аберрантных митозов в кариоцитах костного мозга мышей при воздействии гамма-излучения в низких дозах.

Аберрантные митозы, %	Кол-во проанализиро-ванных анафаз	Количество и виды хромосомных поломок	Сроки исследования, сутки
		мосты	фрагменты
1,7±0,5	348	3	3	10 20 1,7±0,5
1,4±0,4	282	3	1	20 1,4±0,4
2,6±0,3*	236	4	2	30
1,6±0,4	360	4	1	14 сутки восстановительного периода
1,0±0,3	337	2	1	30 сутки восстановительного периода
1,0±0,4	421	3	1	Контроль (необлученные животные)

Многократное воздействие гамма-облучения в суммарной дозе 30 сГр способствовало незначительному снижению анаэробных процессов в эритроцитах к 10 и 30 суткам от начала эксперимента и активацией энергообразующих процессов к 20 суткам гамма-облучения, что является, по-видимому, приспособительной реакцией организма в ответ на многократное воздействие ионизирующего излучения в низких дозах (рис. 3). Воздействие на организм лабораторных животных гамма-облучения в низких дозах характеризовалось также преобладанием восстановительных процессов в эритроцитах. На протяжении всего экспериментального периода наблюдалось повышение активности Г-6-ФД и уровня восстановленного глутатиона, обеспечивающего детоксикацию продуктов ПОЛ и защиту макромолекул от окислительных радикалов.

В период последействия к 14 и 30 суткам исследуемые показатели метаболизма эритроцитов статистически значимо не отличались от контрольных данных.

Рис. 3. Метаболизм эритроцитов (мкМ/г Нв) мышей при воздействии гамма-излучения в суммарной дозе 30 сГр.

Анализ изменений общего содержания ядросодержащих клеток костного мозга экспериментальных животных при воздействии на организм низких доз гамма-излучения (табл. 5) показал обратимое снижение количества кариоцитов костного мозга до 30,1±6,4 млн, тогда как в необлученной группе животных этот показатель находился в пределах 59,7±7,7 млн., что связано, по-видимому, с задержкой клеточного деления полипотентных клеток костного мозга в ответ на действие ионизирующего излучения [С.П. Ярмоненко, 1988]. Несмотря на изменения в количестве ядросодержащих клеток костного мозга (Р<0,05), количество лейкоцитов в периферической крови оставалось стабильным и находилось в пределах 10,4 - 11,4 тыс/мм3 (табл. 5).

Таблица 5. Общее число кариоцитов костного мозга (млн.) и лейкоцитов периферической крови (тыс/мм3 ) мышей при воздействии гамма-излучения в низких дозах.

Исследуемые показатели	Контроль	Сроки исследования, сутки	Восстановительный период, сутки
		10	20	30	14	30
Количество кариоцитов	59,7±7,7	30,1±6,1*	41,2±6,6*	52,1±7,9	48,4±6,4*	63,6±3,5
Количество лейкоцитов	11,5±0,9	10,8±0,4	11,2±0,6	11,2±0,7	10,4±0,4	11,4±0,7

* - Р< 0,05

Биохимические исследования плазмы крови животных показали, что динамика интенсивности обменных процессов при длительном воздействии низких доз гамма-излучения характеризуется волнообразным течением, с периодами, как спада, так и активации метаболических процессов. После прекращения воздействия низких доз ионизирующего излучения, несмотря на тенденцию к нормализации исследованных биохимических альтераций, увеличение концентрации малонового диальдегида на 72 % (Р<0,05) и повышение активности каталазы на 36 % относительно контрольных данных свидетельствуют об отсутствии восстановления обменных процессов.

Цитогенетические, биохимические и гематологические показатели при сочетанном воздействии химического и радиационного факторов низкой интенсивности на организм животных.

Длительное сочетанное воздействие химических веществ и гамма-облучения в низких дозах не оказывало существенного влияния на массу тела животных, массу органов иммунной и репродуктивной систем. На протяжении всего экспериментального периода прирост массы тела лабораторных животных в среднем составил 4,2±0,5 г (26,0 - 30,0 г).

При сочетанном радиационно-химическом воздействии наблюдалась нелинейная зависимость между изменением количества хромосомных аберраций в кариоцитах костного мозга и дозой гамма-облучения (табл. 6). Так к 10 суткам экспериментального периода количество аберрантных митозов увеличивалось относительно контрольных значений (1,4 %) и составило 2,1 % от общего количества проанализированных анафаз. Однако к 20 суткам сочетанного воздействия, несмотря на увеличение длительности воздействующих факторов, количество аберрантных митозов статистически значимо не отличалось от контрольного уровня и составляло 1,6 %. Наблюдаемая нелинейная зависимость «доза-эффект» связана, по-видимому, с развитием устойчивости клеток костного мозга к длительному воздействию химических веществ и ионизирующего излучения. Количество хромосомных повреждений при сочетанном радиационно-химическом воздействии повышалось в основном за счет фрагментов - 91,2 %, тогда как количество мостов составляло лишь 8,8 % от общего количества хромосомных поломок (рис. 1). Повреждение хромосомного аппарата клеток более характерно для изолированного воздействия химического фактора, что свидетельствует о доминирующей его роли при сочетанном воздействии химических веществ и гамма-облучения.

При сочетанном действии исследованных факторов на организм животных количество цитогенетических повреждений оставалось повышенным до 14 суток восстановительного периода (2,2 %) (Р<0,05). Тогда как при изолированном химическом и радиационном воздействии в те же сроки уровень ХА приближался к контрольным значениям, то есть процессы восстановления протекали более интенсивно. Эффект частичного суммирования при сочетанном воздействии двух факторов, по-видимому, обусловлен высокой чувствительностью кроветворной ткани к воздействию химических веществ в низких концентрациях и ионизирующего излучения в низких дозах.

Таблица 6. Количество хромосомных аберраций в кариоцитах костного мозга мышей при сочетанном воздействии химического и радиационного факторов низкой интенсивности.

Аберрантные митозы, %	Количество проанализированных анафаз	Количество и виды хромосомных поломок	Сроки исследования, сутки
		мосты	фрагменты
2,1±0,5	362	1	7	10
1,6±0,4	303	-	5	20
3,0±0,3*	406	2	11	30
2,2±0,3*	358	-	8	14 сутки восстановительного периода
1,4±0,4	420	2	4	Контроль

При сочетанном воздействии на организм животных химического и радиационного факторов низкой интенсивности наблюдаются фазные изменения показателей интенсивности метаболических процессов в эритроцитах, проявляясь активацией приспособительных реакций к 20 суткам воздействия в виде усиления энергообразующих процессов в эритроцитах (рис. 4). Это выражалось достоверным (Р<0,02) повышением одного из основных ферментов гликолиза - ЛДГ на 51% и увеличением уровня лактата на 52% (Р<0,001) относительно величин исследуемых показателей в контрольной группе животных. Данные изменения сопровождались повышением активности Г-6-ФД на 49% (Р<0,02), направленного на поддержание в эритроцитах уровня восстановленного глутатиона и предотвращения, тем самым, окислительной деструкции клеток. Важно отметить, что к концу 14 суточного периода наблюдения после окончания сочетанного радиационно-химического воздействия на организм животных восстановления метаболических процессов в эритроцитах не наблюдалось. Интенсивность энергообразующих процессов в клетках оставалась сниженной и сопровождалась активацией окислительных реакций. Тогда как изолированное влияние на организм животных гамма-излучения в низких дозах сопровождалось тенденцией к восстановлению метаболических реакций в эритроцитах в этот период. При комбинированном влиянии химических веществ на организм животных в период последействия изменения метаболизма эритроцитов также сохранялись, но были, однако, менее выраженными, чем при сочетанном радиационно-химическом воздействии.

Таким образом, исследование обмена веществ эритроцитов при сочетанном радиационно-химическом воздействии свидетельствует о частичной суммации биологических эффектов, связанное, вероятно, с единым механизмом действия ионизирующего излучения и химических веществ на мембраны клеток.

Рис. 4. Метаболизм эритроцитов (мкМ/г Нв) мышей при сочетанном воздействии химических веществ и гамма-излучения.

Анализ экспериментальных данных показал высокую корреляционную зависимость между изменением количества хромосомных аберраций в клетках костного мозга и показателями метаболизма эритроцитов (лактат, ЛДГ, Г6ФД) при изолированном и сочетанном воздействии ионизирующего излучения и химических веществ на организм животных (рис. 5).По-видимому, между уровнем хромосомных повреждений в клетках костного мозга и активностью метаболических процессов в эритроцитах существует причинно-следственная связь. Хромосомные повреждения в клетках - предшественниках эритроидного ряда могут быть причиной изменения метаболических реакций зрелых форм эритроцитов [Н.Н. Великий, 1999]. Тем не менее, нельзя исключать непосредственного воздействия ионизирующего излучения и химических веществ на мембраны эритроцитов, т.к. нарушение целостности мембран может приводить к нарушению ионного баланса клетки и неблагоприятно отражаться на метаболических процессах [С.П. Ярмоненко, 1988].

Рис.5. Корреляционная связь между показателями метаболизма эритроцитов (лактат, ЛДГ, Г-6-ФД) и количеством хромосомных аберраций в кариоцитах костного мозга мышей при сочетанном радиационно-химическом воздействии.

Сочетанное радиационно-химическое воздействие характеризовалось волнообразными изменениями общего количества кариоцитов костного мозга, которые зависели от длительности действия повреждающих факторов (табл. 7). Так, к 10 суткам экспериментального периода наблюдалось статистически значимое (Р<0,05) снижение общего количества ядросодержащих клеток костного мозга на 55,4% по отношению к контролю, свидетельствуя о задержке клеточного деления, обусловленного влиянием ионизирующего излучения на митотическую активность клеток костного мозга, так как при изолированном лучевом воздействии в те же сроки количество кариоцитов также снижалось почти в 2 раза. Однако к 20 суткам сочетанного действия количество ядросодержащих клеток возросло и достигло 68,03,4 млн (Р<0,05), что может быть связано с повышением активности клеточного деления клетками, сохранившими неизмененную пролиферативную способность [С.П. Ярмоненко, 1988]. К 30 суткам сочетанного радиационно-химического воздействия и 14 суткам восстановительного периода количество кариоцитов костного мозга находилось на уровне контрольных значений и составляло 59,63,2 и 59,72,8 млн соответственно, свидетельствуя о регенерации клеточного деления в костном мозге.

Фазные изменения при длительном сочетанном действии химического и радиационного факторов низкой интенсивности на организм животных наблюдались также при исследовании количества лейкоцитов в периферической крови (табл. 7). Наличие лейкопении может быть связано со снижением лейкопоэтической функции костного мозга в этот период и характерно для воздействия на организм малых доз ионизирующего излучения [Л.Н. Николаевич, Л.М. Винник, А.П. Амвросьев, 2000]. Однако в наших экспериментах изолированное влияние радиационного фактора в отличие от сочетанного радиационно-химического воздействия не сопровождалось снижением количества лейкоцитов в периферической крови, что может свидетельствовать о модификации биологических эффектов при совместном влиянии на организм смеси химических веществ и гамма-излучения в низких дозах.

Таблица 7. Общее число кариоцитов костного мозга (млн.) и лейкоцитов в периферической крови (тыс/мм3) мышей (М±m) при сочетанном радиационно-химическом действии факторов низкой интенсивности.

Исследуемые показатели	Контроль	Сроки исследования, сутки	Восстановительный период, сутки
		10	20	30	14
Количество кариоцитов	59,9±0,6	36,3±2,7*	68,0±3,4*	59,6±3,2	59,7±2,8
Количество лейкоцитов	11,5±0,7	5,7±0,6*	4,9±0,3*	6,9±0,3	6,8±0,5

* - Р<0,05

При комплексном биохимическом исследовании крови животных установлено, что сочетанное воздействие химических веществ и ионизирующего излучения не оказывало существенного влияния на биоэнергетические и пластические функции организма. Отсутствие нарушений обмена веществ при слабых радиационно-химических воздействиях подтверждается сбалансированным состоянием свободнорадикальных процессов (МДА) и антиоксидантного статуса организма (каталаза) на протяжении всего экспериментального периода.

Заключение

Реакции организма животных при сочетанном воздействии химического и радиационного факторов низкой интенсивности представлены на схеме 1.

Совместное воздействие комплекса химических веществ в низких концентрациях и гамма-облучения в суммарной дозе 30 сГр приводит к более выраженным цитогенетическим и метаболическим изменениям в организме животных, чем изолированное воздействие химического и радиационного факторов. При сочетанном радиационно-химическом воздействии на основе анализа видов хромосомных аберраций установлено, что химический фактор является доминирующим.

Частичная суммация биологических эффектов при сочетанном воздействии связана, по-видимому, с едиными механизмами воздействия на одни и те же биологические мишени. Использование комплекса химических веществ, как и ионизирующего излучения, способствует активации свободнорадикальных процессов в организме, что могло привести к повреждению мембран клеток и, соответственно, нарушению в них метаболических процессов. Длительное комбинированное воздействие химических веществ (ацетон, ацетальдегид, аммиак, этанол) в низких концентрациях совместно с ионизирующим излучением в низких дозах способствовало индукции цитогенетических повреждений в клетках костного мозга. По-видимому, компоненты клеточного ядра кариоцитов костного мозга так же являются единой мишенью, как для ионизирующего излучения, так и для комплекса исследуемых химических веществ.

Анализ экспериментальных исследований показал высокую корреляционную зависимость между изменением количества хромосомных аберраций в клетках костного мозга и показателями метаболизма эритроцитов (лактат, ЛДГ, Г6ФД) при изолированном и сочетанном воздействии ионизирующего излучения и химических веществ на организм животных. Повышение количества хромосомных аберраций в клетках костного мозга и изменение митотической активности клеток этого органа может быть одной из причин нарушения метаболических процессов в эритроцитах периферической крови, как при химическом, так и при радиационном воздействии.

Важно отметить, что изолированное химическое воздействие оказывало более выраженные нарушения хромосомного аппарата в ядросодержащих клетках костного мозга и метаболические сдвиги обменных процессов в эритроцитах, чем гамма-облучение в низких дозах.

Наблюдаемые фазовые изменения количества кариоцитов кроветворного органа способствовали изменению морфологического состава периферической крови в виде лейкопении.

Результаты экспериментальных исследований сочетанного радиационно-химического воздействия на организм животных необходимо учитывать при коррекции гигиенических нормативов при осуществлении длительных межпланетных пилотируемых полетов. Результаты сравнительной характеристики динамики показателей цитогенетических нарушений и метаболизма эритроцитов показали, что изменения метаболического статуса эритроцитов могут быть использованы в качестве тест - маркера для оценки состояния здоровья космонавтов при осуществлении длительных межпланетных пилотируемых полетов.

Выводы

1. Длительное комбинированное воздействие химических веществ в низких концентрациях на организм животных приводит к более выраженным повреждениям хромосомного аппарата в ядросодержащих клетках костного мозга по сравнению с гамма-облучением в низких дозах.

2. Комбинированное воздействие низких концентраций химических веществ оказывает более выраженное воздействие на метаболизм эритроцитов, по сравнению с гамма-облучением в низких дозах, и сопровождается активацией окислительных реакций в эритроцитах с сохранением наблюдаемых функциональных изменений после окончания химического воздействия.

3. При сочетанном радиационно-химическом воздействии на организм животных количество хромосомных аберраций повышается в основном за счет фрагментов (91,2 %), как и при изолированном химическом воздействии (96,4 %), свидетельствуя о доминирующей роли химического фактора.

4. При сочетанном воздействии химического и радиационного факторов низкой интенсивности, в отличие от их изолированного действия, хромосомные нарушения в кариоцитах костного мозга и метаболические сдвиги в эритроцитах периферической крови сохраняются после прекращения воздействия повреждающих факторов.

5. Изменения метаболизма эритроцитов являются высоко информативными показателями и могут быть использованы для адекватной оценки влияния на организм смеси химических веществ с однонаправленным биоэффектом в концентрациях на уровне ПДКпка.

6. Установлена высокая корреляционная зависимость (r = 0,88) между изменениями интенсивности метаболических процессов в эритроцитах и количеством хромосомных аберраций в клетках костного мозга при изолированном и сочетанном воздействии химических веществ в низких концентрациях и гамма-облучения в суммарной дозе 30 сГр.

7. Результаты экспериментальных исследований сочетанного воздействия на организм животных химического и радиационного факторов низкой интенсивности могут быть использованы в дальнейших исследованиях, направленных на совершенствование гигиенических нормативов и разработку медико-технических требований к перспективным системам жизнеобеспечения межпланетных пилотируемых космических полетов.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Цитогенетические и биохимические исследования при длительном комбинированном воздействии изоэффективных концентраций химических веществ с однонаправленным биоэффектом на организм лабораторных животных //Авиакосмическая и экологическая медицина. 2006. №3. С. 50-54 (в соавторстве с Ивановой С.М., Пахомовой А.А., Никитиным Е.И. и др.).

2. Метаболические аспекты клеточного гомеостаза при ингаляционном воздействии химических веществ малой интенсивности // Тез. докл. 9-й междунар. конф. «Системный анализ и управление». Крым. Евпатория. 2004. С. 156 (в соавторстве с Ивановой С.М.)

3. Повторные радиационные воздействия в низкой дозе на критические системы организма лабораторных животных // Тез. докл. 4-й молодежной конф. М. 2005. С. 8.

4. Цитогенетические и биохимические исследования при хроническом сочетанном воздействии химического и радиационного факторов в низких дозах на организм лабораторных животных // Тез. докл. 13-й конф. «Космическая биология и авиакосмическая медицина». М. 2006. С. 34 (в соавторстве с Мухамедиевой Л.Н., Федоренко Б.С., Ивановой С.М.и др.).

5. Цитогенетические и биохимические исследования при длительном комбинированном воздействии изоэффективных концентраций химических веществ с однонаправленным биоэффектом // Тез. докл. 5-й конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной дню космонавтики. М. 2006. С. 9 (в соавторстве с Пахомовой А.А., Ворожцовой С.В.).

6. Показатели метаболизма эритроцитов при воздействии на организм радиационного и химического факторов низкой интенсивности // Тез. докл. 4-й междунар. конф. «Авиация и космонавтика». М. 2005. С. 110 (в соавторстве с Ворожцовой С.В., Никитиным Е.И., Ивановой С.М.).

7. Роль обоняния человека при оценке загрязнения воздушной среды пилотируемых космических аппаратов компонентами газовыделений термодеструкции полимеров // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2006. Т. 40. № 6. С. 32-36 (в соавторстве с Соломиным Г.И., Мухамедиевой Л.Н., Никитиным Е.И.).