Оценка пластичности протеома плазмы крови здорового человека в экстремальных условиях жизнедеятельности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оценка пластичности протеома плазмы крови здорового человека в экстремальных условиях жизнедеятельности

14.03.08 Авиационная, космическая и морская медицина

03.01.09 Математическая биология, биоинформатика

Трифонова О.П.

Москва 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) и в Учреждении Российской академии медицинских наук Институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ларина Ирина Михайловна

доктор биологических наук Лисица Андрей Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Воронков Юрий Иванович

доктор биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Анализ протеома плазмы крови позволяет выявлять белковые биомаркеры, практическая значимость которых определяется перспективой использования в сфере молекулярной диагностики и мониторинга эффективности лечения широкого спектра заболеваний (N.L. Anderson, N.G. Anderson, 2002). Крупномасштабное изучение протеома плазмы крови было проведено под эгидой международной организации HUPO (Human Proteome Organization). В рамках проекта HUPO Plasma Proteome Project (HPPP) было идентифицировано 7884 белка, как обобщенный результат 95 исследовательских проектов (Omenn G.S. et al., 2005, Klie S. et al., 2008). За последние 10 лет при исследовании различных заболеваний протеомными методами в плазме и сыворотке крови было выявлено более 200 потенциальных биомаркеров, однако, только единицы из них обладали высокой специфичностью. Первым и на настоящий момент единственным примером практического применения результатов протеомики стал многопараметрический тест OVA1, одобренный в 2009 году Американским агентством FDA для диагностики рака яичников (Anderson N.L., 2010, Hortin G.L. et al., 2010). Одной из причин такой низкой эффективности протеомных исследований является проблема биологической вариабельности контрольного биоматериала, остро стоящая в клинической протеомике.

При обнаружении в крови белков, потенциальных биомаркеров, необходимо знать, какой степенью изменчивости обладает концентрация данных белков в норме (так называемая пластичность протеома), а также - границы внутри- и межиндивидуальных различий Внутрииндивидуальная вариабельность - индивидуальные изменения уровня белков в течение времени. Межиндивидуальная вариабельность - различия протеома между разными индивидуумами в группе.. Anderson&Anderson в 2002 году согласно опубликованным данным о вариабельности ряда белков, таких как протромбин, миоглобин, гаптоглобин, интерлейкин, С-реактивный белок, липопротеины выдвинули гипотезу, что индивидуальные изменения уровня белков во времени должны быть как минимум вдвое ниже чем вариабельность внутри популяции (Anderson N.L., Anderson N.G., 2002). Недавно Todd H. Corzett с соавторами (2010) провели статистический анализ внутрииндивидуальной вариабельности протеома плазмы крови с помощью дифференциального гель электрофореза (Corzett T.H. et al., 2010). Их результаты показали, что групповая вариабельность значительно превышает индивидуальные изменения протеома во времени, которые, в свою очередь, сравнимы с технической погрешностью метода. Однако авторы не принимали во внимание ни состояние здоровья, ни образ жизни, ни пол обследуемых.

Помимо значительных отличий между протеомными профилями индивидуумов и естественных изменений индивидуального протеома во времени, существуют вариации, связанные с адаптивным ответом на изменение внешних условий (Anderson N.L., Anderson N.G., 2002). Характеристика изменений белковой композиции плазмы крови является основой для изучения молекулярного ответа человека в новых условиях существования. При выполнении космических полетов, а также при участии в модельных экспериментах («сухая» иммерсия, длительная изоляция и др.) организм человека реагирует на непривычные для него условия. Изменения затрагивают все системы органов, что отражается на качественном и количественном составе белков крови. Так с помощью различных биохимических методов были выявлены изменения гормонов белковой природы (инсулина, соматотропина, ренина и других) (Ларина И.М. 2000; 2003; Григорьев А.И. с соавт., 1999), компонентов иммунной системы (иммуноглобулинов, факторов комплемента) (Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю, 1979, 1980; Рыкова М.П. с соавт., 2001, 2004, 2006), белков системы свертывания крови (Фомин, А.Н., 1981) и «острой» фазы (Ларина О.Н., 1992; 2006), ферментов, в т.ч. протеолитических (Тигранян с соавт., 1987).

Протеомный анализ для оценки изменений белкового состава жидкостей тела здорового человека во время космических полетов и наземных модельных экспериментов начали применять совсем недавно. Впервые, в нашей лаборатории для анализа изменений протеома сыворотки крови здоровых добровольцев был применен метод прямого масс-спектрометрического профилирования после предварительного фракционирования на магнитных частицах (Пахарукова Н.А. с соавт., 2010, Pakharukova N.A. et al., 2011). Метод позволяет анализировать одновременно несколько десятков пептидов, белков и белковых фрагментов, однако может применяться только для определения молекул с весом до 17 кДа.

Широко распространенным методом анализа сложных белковых смесей в широком диапазоне молекулярных весов является двумерный гель-электрофорез (2-DE) (O'Farrell P.H., 1975). С помощью 2-DE можно осуществлять визуальное картирование протеома плазмы крови, проводить относительный количественный анализ и поиск дифференциально экспрессируемых белков.

Несмотря на активно ведущиеся исследования по протеомному профилированию патологических состояний, понятие «норма» в протеомике до сих не определено. Можно полагать, что качественный и количественный состав белков может изменяться в пределах заложенной на генетическом уровне нормы реакции, однако систематизированные представления о мере пластичности/консерватизма протеома плазмы крови здорового человека при воздействии на его организм различных факторов среды или условий жизнедеятельности в настоящий момент отсутствуют.

Целью работы являлась качественная и количественная оценка вариабельности белков плазмы крови здорового человека при воздействии на организм различных факторов, включая факторы, моделирующие эффекты микрогравитации. В рамках достижения указанной цели решались следующие задачи:

Получить методом двумерного электрофореза и охарактеризовать протеомную карту плазмы крови здорового человека после удаления мажорных и концентрирования минорных белков.

Выявить достоверно различающиеся по уровню содержания в плазме крови белки, определяющие внутри- и межиндивидуальные различия (пластичность) протеома здоровых людей.

Выявить изменения протеома плазмы крови здорового человека, вызванные воздействием экстремальных факторов («сухая» иммерсия и длительная изоляция).

Сопоставить пластичность протеома плазмы крови, обусловленную экстремальными условиями жизнедеятельности, с известными данными об изменении уровня содержания белков в плазме крови при патологии.

Научная новизна

Впервые было проведено исследование по выявлению пределов вариабельности протеома плазмы крови, характерных для нормального человека, в том числе связанных с экстремальными воздействиями. С помощью метода двумерного электрофореза были оценены изменения в протеоме плазмы крови здоровых людей в ходе наземных экспериментов по моделированию отдельных факторов космического полета - 7-суточная «сухая» иммерсия и 105-суточная изоляция в гермообъекте. Впервые показано, что колебания состава протеома проявляются как признаки адаптивной пластичности протеома, в частности, в период восстановления после перенесенного воздействия.

Практическая значимость работы

В работе решена проблема оценки пластичности протеома плазмы крови, препятствующая медицинскому освоению результатов протеомных исследований. Определены доверительные интервалы коэффициента вариации, в пределах которых количественные изменения белкового состава крови не связаны с молекулярным механизмом развития болезни, а отражают физиологическую норму реакции организма. Установлено, что для отдельных белков масштаб этих колебаний сопоставим с изменением уровня белков плазмы, наблюдаемым при патологии. Получена важная информация с точки зрения исследования индивидуальных защитных механизмов, повышающих функциональные резервы здорового человека при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и факторов космического полета.

Положения диссертации, выносимые на защиту

Двумерный гель-электрофорез в сочетании с пробоподготовкой с использованием пептидных микрогранул (ProteoMiner™) для удаления мажорных и концентрирования минорных белков является информативным и воспроизводимым методом анализа протеома плазмы крови здорового человека в диапазоне концентраций от 10^-4 до 10^-7 М.

Пребывание человека в условиях длительной изоляции в гермообъекте не вызывает выраженных изменений в протеоме плазмы крови, что сопоставимо с индивидуальными изменениями во времени, наблюдаемыми в условиях обычной жизнедеятельности.

Экстремальные условия жизнедеятельности, моделирующие эффекты микрогравитации («сухая» иммерсия), вызывают в период реадаптации после перенесенного воздействия существенные изменения содержания белков плазмы крови у здорового человека.

Адаптивное изменение уровня содержания белков крови, выявленных у здоровых добровольцев в экстремальных условиях жизнедеятельности, также наблюдается у пациентов как неспецифическая реакция организма в связи с развитием заболевания.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены на 8 научных конференциях, в том числе и международные: 3-я протеомная конференция стран Центральной и Восточной Европы (Будапешт, Венгрия, 6-9 октября, 2009 г.); Российско-французско-белорусская конференция «Нейрососудистые изменения, вызванные воздействием условий внешней среды: молекулярно-клеточные и функциональные подходы» (Анже, Франция, 10-12 марта 2010 г.); 31-ый международный симпозиум по гравитационной физиологии (Триест, Италия, 13-18 июня, 2010 г.); I Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 17-19 ноября 2010 г.); 18-й международный симпозиум «Человек в космосе» (Хьюстон, США, 11-15 апреля 2011г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В диссертации приведены 11 таблиц и 24 рисунка. Список использованной литературы содержит 71 отечественных и 122 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы исследования

Исследовали образцы плазмы крови 16 здоровых добровольцев, прошедших врачебно-экспертную комиссию ИМБП РАН и допущенных к участию в модельных экспериментах: 1 - 7-суточная «сухая» иммерсия - 5 мужчин в возрасте 23 - 29 лет, пробы крови отбирали за 7 суток до начала эксперимента, на 7-е сутки проведения эксперимента и через 7 суток после окончания эксперимента (период реадаптации); 2 - 105-ти суточная изоляция в гермообъекте - 6 мужчин в возрасте 26 - 41 лет, пробы крови отбирали за 6-7 суток до начала эксперимента, на 17, 51-52 и 85-86 сутки проведения эксперимента и на 7-8-е сутки после окончания эксперимента (период реадаптации); 3 - внутрииндивидуальная вариабельность в норме - 5 мужчин в возрасте 26 - 48 лет, пробы крови отбирали на 1-е, 14-е и 21-е сутки в привычных условиях жизнедеятельности. Процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при ГНЦ РФ - ИМБП РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследовании, было получено письменное Информированное согласие.

Методы исследования

Получение образцов плазмы крови. Пробы крови у испытуемых отбирали из локтевой вены утром натощак. ЭДТА плазму крови получали стандартным методом, замораживали и хранили при -80°С до проведения дальнейших протеомных исследований.

Получение обедненной фракции плазмы крови методом удаления мажорных и концентрирования минорных белков. Обедненную фракцию плазмы крови получали с помощью микрогранул ProteoMiner™ (Bio-Rad, США). 1 мл плазмы крови добавляли к спин-колонке с микрогранулами, дальнейшие шаги выполняли согласно инструкции производителя. На выходе получали 300 мкл элюата, замораживали и хранили при -20°С.

Проверку качества обеднения плазмы крови проводили по наличию пиков одно - (m/z=66,5 кДа) и двухзарядного (m/z=33,3 кДа) ионов альбумина с помощью прямого масс-спектрометрического профилирования цельной плазмы и обедненной фракции, полученной после обработки микрогранулами ProteoMiner™. Для этого подкисленные растворы плазмы и обедненной фракции пропускали через обращеннофазовые наконечники ZipTip C18 (Millipore, Франция). Полученный элюат смешивали с матрицей (синаповая кислота (SA)) в соотношении 1:1 и наносили на MALDI мишень AnchorChip (Bruker Daltonics, Германия). Спектры получали в линейном режиме на масс-спектрометре с времяпролетным анализатором Autoflex III TOF (Bruker Daltonics, Германия) в диапазоне масс 18 - 120 кДа.

Проведение двумерного электрофореза. Для выравнивания анализируемых двумерных электрофореграмм по общему белку перед проведением анализа методом двумерного электрофореза концентрацию белка в образцах обедненной фракции плазмы крови определяли по методу Брэдфорда (Bradford M.M., 1976) на вертикальном фотометре УНИПЛАН™ (Пикон, Россия). Измерение проводили по оптической плотности растворов при длине волны 530 нм. Пересчет оптической плотности в концентрацию осуществляли линейной аппроксимацией методом наименьших квадратов калибровочной прямой, построенной с использованием стандартных растворов бычьего сывороточного альбумина.

Для разделения белков по изоэлектрической точке аликвоты образца обедненной фракции плазмы крови, соответствующие 200 мкг белка, разводили буфером (7М мочевина, 2М тиомочевина, 4% CHAPS, 0,5% Амфолит рН 3-10 и 50мМ ДТТ) до конечного объема 200 мкл и наносили на 11 см стрип с иммобилизованным нелинейным градиентом рН 3-10 (Bio-Rad). Изоэлектрическое фокусирование проводили на приборе Protean IEF Cell (Bio-Rad) по следующей схеме: активная регидратация в течение 14 часов, 250 В в течение 30 минут, 5500 В до 35000 Вч и 800 В в течение 10 часов. Затем стрипы промывали в уравновешивающем буфере (6М мочевина, 50мМ Tris-HCl pH 6,8, 20% глицерин и 2% SDS) сначала с добавлением 1% ДТТ, а потом 2,5% акриламида по 30 минут соответсвенно. Для разделения белков на основании различия их размеров (молекулярных масс) и пространственных конфигураций стрипы переносили на самодельные 4%-12% Tris-HCl полиакриламидные гели (13,3Ч8,7 см). Разделение проводили в ячейке Criterion Dodeca Cell (Bio-Rad) в несколько стадий: 15 минут при 50 В, 30 минут при 150 В и около 40 минут при 175 В при постоянном охлаждении. Гели окрашивали 0,1% раствором Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 (Sigma). Для усреднения технической погрешности метода каждый образец анализировали в двух-трех повторах.

Получение и анализ изображений гелей. Изображение гелей получали с помощью калибровочного денситометра Molecular Imager® GS-800™ (Bio-Rad) в режиме трансмиссии с разрешением 300 точек на дюйм. Анализ изображений гелей с определением интенсивности белковых пятен проводили с помощью программного пакета GelEditor (ИБМХ РАМН). Сводные данные интенсивности пятен по всем гелям переносили в Exсel для дальнейшего анализа.

Анализ данных. Все данные в работе представлены как среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение (M±SD). Для оценки достоверности изменений и воспроизводимости метода вычислялся коэффициент вариации (CV) интенсивности для каждого пятна как отношение стандартного отклонения величины к ее среднему значению (CV=SD/M*100%).

Анализ распределения образцов по кластерам проводили с помощью иерархического кластерного анализа методом невзвешенного попарного арифметического среднего (программа Statistica 6.0). Расстояние между объектами (образцами плазмы крови) вычисляли с использованием коэффициента корреляции между профилями интенсивности белковых пятен на геле. Робастность результатов кластерного анализа оценивали путем моделирования выборок из эмпирического распределения значений интенсивности белковых пятен.

Статистический анализ проводили с использованием непараметрического критерия Уилкоксона (программа Statistica 6.0). Межгрупповые отличия считали достоверными при p<0,05.

Идентификация белковых пятен методом масс-спектрометрического анализа пептидных фрагментов (PMF). Вырезанные вручную из геля белковые пятна отмывали обесцвечивающим буфером (100 мМ бикарбоната аммония (NH4HCO3) в 50 % растворе ацетонитрила), дегидратировали 100% аценитрилом и подвергали трипсинолизу. Элюат пептидов смешивали с матрицей (2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB)) и наносили на MALDI мишень AnchorChip.

Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре с время-пролетным анализатором Autoflex III TOF (Bruker Daltonics) в рефлекторном режиме в диапазоне масс 800 - 4500 Да. Полученные спектры обрабатывали с помощью программы FlexAnalysis 3.0 (Bruker Daltonics). Определение пиков в спектре осуществлялось алгоритмом SNAP после предварительного вычитания базовой линии типа «top hat» и сглаживания за счет удаления шумов с помощью математического фильтра методом Savitzki-Golay. В масс-лист включались только пики, для которых отношение сигнал/шум превышало 5. Перекалибровку масс-спектров проводили по пикам аутолиза трипсина с массой 842,509 Да и 2211,104 Да.

Поиск белков по набору масс пептидов проводили в программе Mascot v.2.1 (MatrixScience, Великобритания). Параметры поиска были следующие: база данных - NCBIr, вид организма - Homo sapiens, используемый фермент - трипсин, возможные модификации - Oxidation M, Propionamide C и точность определения масс пептидов - 100 ppm. Идентификацию белка считали достоверной, если вычисленный для него эмпирический критерий «Mascot score» превышал 63.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Протеомная карта обедненной фракции плазмы крови здорового человека

Для создания протеомной карты здорового человека использовали двумерные электрофореграммы 60 образцов обедненной фракции плазмы крови, полученной после удаления мажорных и концентрирования минорных белков с использованием микрогранул ProteoMiner™ (Bio-Rad). Данный метод позволил значительно снизить концентрацию таких высокопредставленных белков, как альбумин и иммуноглобулины.

Всего было получено 150 двумерных электрофореграмм, то есть по 2-3 повтора на каждый из анализируемых 60 образцов. После окрашивания гелей Coomassie Brilliant Blue подсчитывали количество визуализированных белковых пятен на всех двумерных электрофореграммах. При подсчете не было выявлено статистически достоверных различий показателя среднего количества регистрируемых белковых пятен ни между экспериментами, ни между группами образцов в одном эксперименте (табл. 1).

Таблица 1. Среднее количество регистрируемых белковых пятен на электрофореграмме обедненной фракции плазмы крови в группах образцов

Среднее количество регистрируемых пятен на всех 150 двумерных электрофореграммах, полученных в ходе выполнения данной работы, составило 120±15. Эти данные соответствуют результатам других исследований, в которых изучали плазму крови человека методом 2-DE, с учетом размера гелей (13,3Ч8,7 см) и способа визуализации белков (Coomassie Brilliant Blue) (Ahmed N. et al., 2003, Kalenka A. et al., 2006, Archakov A. et al., 2009). На основании приведенных в таблице 1 данных можно утверждать, что условия модельных экспериментов не влияли на количество регистрируемых белковых пятен на двумерной электрофореграмме, и в ходе проведения исследования были достигнуты условия воспроизводимости анализа плазмы крови методом двумерного электрофореза.

Для белковых пятен, регистрируемых на полученных двумерных электрофореграммах, анализировали встречаемость на всех 150 гелях. Результаты анализа приведены на гистограмме, показанной на рисунке 1.

Рисунок 1. Гистограмма распределения частоты встречаемости регистрируемых белковых пятен на полученных гелях обедненной фракции плазмы крови здоровых добровольцев.

Видно, что 40% белковых пятен наблюдали на всех полученных гелях (100%). Более 70% пятен наблюдались не менее чем на половине гелей, и только 30% встречались менее чем на 50% гелей. Редко встречающиеся пятна чаще всего характеризовались низким уровнем интенсивности, и их низкая воспроизводимость может объясняться как технической погрешностью метода протеомного анализа, так и пределом чувствительности выбранного метода визуализации белковых пятен (Coomassie Brilliant Blue, до 10^-7-10^-8М).

Оценка воспроизводимости аналитического метода (определение технической погрешности 2-DE). Воспроизводимость метода двумерного электрофореза анализировали с помощью расчета коэффициента технической вариации. Для этого по техническим повторам анализа образцов оценивали разброс стандартного отклонения относительно средней величины интенсивности каждого пятна на двумерной электрофореграмме. На гистограмме распределения коэффициента технической вариации интенсивности белковых пятен, наблюдавшихся на полученных двумерных электрофореграммах, видно, что для 45% пятен коэффициент составил менее 20%, и только для 22 пятен из 140 проанализированных (16%) он превысил 30% (рис. 2).

Рисунок 2. Гистограмма распределения коэффициента технической вариации метода для регистрируемых белковых пятен на двумерных электрофореграммах обедненной фракции плазмы крови.

В среднем по всем образцам коэффициент технической вариации интенсивности белковых пятен составил 22%, что совпадает с данными других авторов, использовавших метод двумерного электрофореза для анализа протеома плазмы крови человека (Corzett T.H. et al., 2006, Winkler W. et al., 2008).

Аннотирование мастер-геля. В качестве мастер-геля была взята двумерная электрофореграмма с максимальным количеством регистрируемых белковых пятен. На таком геле было визуализировано 140 белковых пятен, 70 из которых выявлялись более чем на 70% всех полученных в ходе данной работы электрофореграмм. Результаты идентификации пятен методом масс-спектрометрического картирования пептидных фрагментов показали, что на полученной протеомной карте наиболее интенсивно окрашенные группы пятен относились к следующим белкам плазмы крови: витронектин, протромбин, сывороточный альбумин, б-, в- и г-цепи фибриногена и аполипопротеины A-I, A-IV и Е. Путем сопоставления результатов масс-спектрометрической идентификации белковых пятен на мастер-геле с аннотированными электрофореграммами плазмы крови человека, депонированными в базе данных SWISS-2DPAGE (http://www.expasy.ch/swiss-2dpage/viewer), было установлено, что полученная протеомная карта обедненной фракции плазмы крови совпадает с типовой картиной разделения белков плазмы крови методом 2-DE.

Для дальнейшего анализа были определены 70 пятен с высокой частотой встречаемости (регистрировались не менее чем на 70% гелей) и относительно низкой погрешностью измерений (коэффициент технической вариации не более 25%).

Анализ внутри- и межиндивидуальной вариабельности протеома плазмы крови здоровых людей в норме

Внутрииндивидуальная вариабельность. Изменчивость протеома плазмы крови изучали у 5 здоровых мужчин за три недели их обычной жизнедеятельности. Обработка значений интенсивности анализируемых белковых пятен на двумерных электрофорераммах по трем точкам эксперимента показала, что средний коэффициент внутрииндивидуальной вариабельности в течение периода обследования составил 22±13%. Этот уровень вариабельности сравним с погрешностью метода анализа, что подтверждается графиком рассеяния среднего коэффициента внутрииндивидуальной вариации относительно коэффициента технической вариации интенсивности анализируемых белковых пятен (рис.3).

Рисунок 3. Распределение среднего коэффициента внутрииндивидуальной вариации относительно коэффициента технической вариации интенсивности белковых пятен на 2D электрофореграмме для образцов плазмы крови, полученных от 5 здоровых добровольцев на 1-е, 14-е и 21-е сутки обследования в обычных условиях жизни.

Видно, что практически все точки на графике рассеяния расположены близко к линии, проведенной под углом 45°. Следовательно, средние индивидуальные колебания интенсивности соизмеримы с различиями между техническими повторами для большинства анализируемых белковых пятен. Полученные данные показывают, что в заданных условиях проведения исследования (выборка из 5 человек и достаточно ограниченное время мониторинга - на протяжении 3-х недель) не наблюдалось существенных изменений в составе протеома плазмы крови, обусловленных изменчивостью во времени.

Анализ данных об изменении интенсивности белковых пятен индивидуально для каждого из 5 добровольцев указал на неинформативность усредненных показателей. Несмотря на то, что средний уровень внутрииндивидуальной вариабельности для некоторых пятен оказался незначителен, а для других был сравним с технической погрешностью метода анализа, в ряде случаев индивидуальные колебания оказались значимыми. Так, у одного добровольца интенсивность пятна кластерина на 14-й день обследования уменьшилась более чем в 2 раза по сравнению с 1-м днем, а на 21-й день - вернулась к первоначальному значению. У другого добровольца интенсивность этого пятна, наоборот, увеличилась в 1,5 раза на 14-й день обследования. В то же время у остальных трех добровольцев изменение интенсивности пятна кластерина в течение 3-х недель было совсем незначительным, в пределах 10-15%. Таким образом, профиль наблюдаемых изменений во времени для каждого человека индивидуален.

Межиндивидуальная (групповая) вариабельность в норме. Для определения межиндивидуальных различий в протеоме плазмы крови здоровых людей в норме были проанализированы обедненные фракции образцов плазмы крови 16 мужчин, полученные в период их обычной жизнедеятельности. Аналогично предыдущей задаче, для каждого пятна вычисляли коэффициент вариации интенсивности между индивидуумами и сравнили с коэффициентом технической вариации метода (рис. 4).

Рисунок 4. Распределение коэффициента межиндивидуальной вариации относительно коэффициента технической вариации интенсивности белковых пятен на двумерной электрофореграмме для образцов плазмы крови, полученных от 16 здоровых добровольцев.

При сравнении графика на рис. 4 с ранее полученными данными по внутрииндивидуальной вариабельности (рис. 3) очевидно, что общее количество пятен, характеризующихся высокой межиндивидуальной вариабельностью, значительно превысило количество пятен, характеризующихся высокой внутрииндивидуальной изменчивостью. В среднем коэффициент межиндивидуальной вариации составил 50±19%, что более чем в два раза выше, чем аналогичный показатель для индивидуальной вариабельности и для технической погрешности метода. Масс-спектрометрическая идентификация была проведена для пятен, расположенных на рис. 4 ниже линии, проведенной под углом 45°, с коэффициентом межиндивидуальной вариации более 50%, что как минимум в два раза превышает погрешность метода. Таких белковых пятен оказалось 37; результаты масс-спектрометрической идентификации приведены в таблице 2. плазма кровь белок патология

Таблица 2. Белки плазмы крови, характеризующиеся высокой межиндивидуальной вариабельностью в норме. Коэффициент вариации усредняли по 16 образцам.

Примечание: CV - коэффициент вариации; * - согласно данным Gene Ontology (GO).

Среди идентифицированных белков встречаются аполипопротеины A-I, Е и кластерин (аполипопротеин J), которые характеризовались и относительно высокой внутрииндивидуальной вариабельностью, которая в 1,5 раза превышала техническую погрешность метода. Высокая межиндивидуальная вариабельность различных форм аполипопротеинов может объясняться особенностями как липидного и энергетического обмена, так и двигательной активности у здоровых лиц. Кроме того, высокая изменчивость аполипопротеинов А-I и Е в крови здоровых добровольцев может быть связана с различным содержанием жиров и холестерина в рационе в течение обследования. Остальные белки, такие, как аполипопротеин A-IV, б-, в-цепи фибриногена, плазминоген, витронектин, фрагменты фактора С4 комплемента и другие, не были выявлены при исследовании внутрииндивидуальной изменчивости. Это указывает, что биологическая вариабельность протеома превышает внутрииндивидуальную изменчивость.

Изменения протеома плазмы крови под воздействием модельных экспериментов

Эксперимент с 7-суточной «сухой» иммерсией. Анализ изменений белковой композиции плазмы крови проводился в ответ на воздействие безопорной среды. Во время «сухой» иммерсии тело испытуемого, погруженного в воду, отделено от нее специальной водоотталкивающей пленкой (Шульженко И.Б., Виль-Вильямс И.Ф., 1976), поэтому сила опоры оказывается равномерно распределенной по всей поверхности тела.

На рисунке 5 приведены результаты кластерного анализа образцов плазмы крови, проведенного на основе сопоставления профилей интенсивности анализируемых белковых пятен на гелях.

Рисунок 5. Результаты кластерного анализа образцов плазмы крови, полученных у 5 здоровых добровольцев до (I), после (II) воздействия «сухой» иммерсии и в период реадаптации (III).

Видно, что вся совокупность из полученных в эксперименте образцов разделилась на 2 кластера. Такое распределение объектов по кластерам наблюдали в 943 случаях из 1000 моделированных из эмпирического набора значений интенсивности выборок, что подтверждает нечувствительность результатов кластерного анализа к неоднородностям в результатах измерений. В первый кластер вошли образцы, полученные в период реадаптации, второй кластер образовали образцы, полученные до и после иммерсионного воздействия. Характер распределения указывает, что существенные изменения в протеоме плазмы крови происходили во время реадаптации организма к условиям нормальной гравитации после 7-суточного воздействия гипогравитации.

Средний коэффициент вариации интенсивности анализируемых белковых пятен в образцах, полученных в период проведения эксперимента, составил 46±28%. Это достаточно высокий уровень вариабельности, в два раза превышающий погрешность метода анализа (коэффициент технической вариации). Кроме того, данный показатель в два раза превысил уровень внутрииндивидуальной вариабельности протеома плазмы крови здорового человека в норме, который составлял 22±13%. Эти данные подтверждают, что наблюдаемые в плазме крови изменения обусловлены воздействием модельного эксперимента, а не являются следствием проявления нормальной изменчивости протеома в течение времени. Построив диаграмму сравнения коэффициента вариации в течение эксперимента с «сухой» иммерсией относительно коэффициента технической вариации интенсивности анализируемых белковых пятен (рис. 6) были выявлены пятна расположенные ниже линии в 45° с коэффициентом вариации более 50%, что указывает на существенное изменение их интенсивности в ходе эксперимента.

Рисунок 6. Распределение среднего коэффициента вариации интенсивности белковых пятен на двумерных электрофореграммах в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией для 5 добровольцев относительно коэффициента технической вариации метода.

Белковые пятна с достоверно изменяющимся уровнем интенсивности и примеры изменения их интенсивности в ходе эксперимента представлены на двумерной электрофореграмме, приведенной на рисунке 7. Видно, что для групп пятен обозначенных цифрами 3, 6 и 7 наблюдали увеличение интенсивности в период реадаптации (III) по сравнению с фоном и последними (7-ми) сутками пребывания в иммерсионной ванне. В свою очередь, интенсивность белковых пятен в группах 1, 2, 4 и 5 в этот период, наоборот, уменьшилась.

Рисунок 7. Двумерная электрофореграмма обедненной фракции плазмы крови здорового добровольца в фоновом периоде и пример изменения интенсивности групп белковых пятен в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией: фон - I, 7-е сутки воздействия - II и период реадаптации - III.

Отмеченные на рисунке 7 группы белковых пятен были идентифицированы как 1,2 - б- и в-цепи фибриногена, 3, 6, 7 - аполипопротеины А-I, A-IV и Е, 4 - фрагменты фактора С4 комплемента и 5 - сывороточный амилоид Р (табл. 3). В таблице 3 приведены численные данные об изменении интенсивности идентифицированных белковых пятен в ходе модельного эксперимента.

В период реадаптации после окончания иммерсии (+7-е сутки обследования) наблюдали достоверное увеличение (более чем в 2 раза) уровня аполипопротеинов А-I, E и A-IV по сравнению с фоном и 7-м днем «сухой» иммерсии. При этом на 7-е сутки пребывания в иммерсионной ванне отмечалось незначительное снижение уровня содержания указанных белков. Наблюдаемые сдвиги указывают на изменения в функционировании системы транспорта липидов. Известно, что гиподинамия в космическом полете или модельных условиях приводит к снижению интенсивности определенных обменных процессов (Маркин А.А., Моруков Б.В. и др., 2008). Возможно, наблюдаемое нами столь значительное увеличение уровня аполипопротеинов A-I, A-IV и Е, важнейших апобелков, участвующих в обмене липидов и обладающих антисклеротическим действием (Mahley R.W., Innerarity T.L. et al., 1984), может иметь значение в реутилизации и элиминации из организма избыточного холестерина в период реадаптации.

Таблица 3. Изменения уровня интенсивности идентифицированных белковых пятен в плазме крови здоровых добровольцев в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией (СИ)

Примечание. Все данные представлены в отн. ед. измерения интенсивности; * - достоверное различие с фоном и 7-м днем «сухой» иммерсии (р<0,05); Н/Д - не детектировались.

Как видно из данных таблицы 3, также были выявлены изменения и в системе регуляции гемостаза, проявляющиеся в достоверном уменьшении в период реадаптации уровня интенсивности белковых пятен, относящихся б- и в- цепи фибриногена. Наблюдаемое снижение уровня фибриногена может быть следствием возрастания объема циркулирующей плазмы (ОЦП) - явления, характерного для первых дней реадаптации к нормальным условиям жизнедеятельности после «сухой» иммерсии (О.Г. Газенко, И.И. Касьян, 1990, Ларина И.М., М.-А. Кусто и др., 2008). С другой стороны, нельзя исключать также и влияние эмоционального стресса, испытываемого добровольцами в ходе иммерсии, на параметры гемостаза. Известно, что адреналин способствует повышению уровня фибриногена в крови (Карагезян К. Г., 1960).

В период реадаптации после иммерсионного воздействия происходило также достоверное изменение уровня содержания сывороточного амилоида Р и фрагментов фактора С4 комплемента (табл. 3). Соответствующие этим белкам пятна практически не регистрировались на электрофореграммах, полученных на +7-е сутки обследования, что говорит о низкой концентрации этих белков, близкой к пределу чувствительности метода анализа. Безусловно, резкое снижение интенсивности пятен, относящихся к фактору С4 отражает сдвиги в иммунной системе (Belt K.T., Caroll M.C. et al.,1984, Dodds A.W., Law S.K., 1990). В исследовании индивидуальных особенностей регуляции уровней белков крови, относящихся к электрофоретическим фракциям б1- и б2-глобулинов при 7-суточной иммерсии были выявлены и совокупность эффектов, характерных для острофазной реакции (Ларина О.Н., Беккер А.М., 2009). На основании наших данных мы не могли проследить за особенностями развития реакции острой фазы или уровнем содержания иммуноглобулинов, поскольку эти белки относятся к мажорным и были удалены на стадии пробоподготовки. Известно, что сывороточный амилоид Р тесно связан с С-реактивным белком, главным показателем реакции острой фазы, и работает по тому же механизму запуска иммунного ответа (Pepys M.B., Dash A.C. et al., 1978). Можно предположить, что наблюдаемые изменения в уровне содержания сывороточного амилоида Р и фактора С4 комплемента отражали развитие острофазной реакции организма, вызванной воздействием экспериментальных условий и уменьшающуюся в период реадаптации. Кроме того, уровень сывороточного амилоида Р коррелирует с параметрами, отражающими состояние сердечно-сосудистой системы, а также уровень физической активности и интенсивность липидного обмена (Jenny N.S., Arnold A.M. et al., 2007). Комплекс факторов «сухой» иммерсии затрагивал все вышеперечисленные системы (Козловская И.Б., 2008), что позволяет говорить о тесной взаимосвязи наблюдаемых изменений. Следует также отметить и высокую межиндивидуальную вариабельность идентифицированных белков в фоновом периоде. Как видно из данных таблицы 3, разброс значений интенсивности пятен б-, в-цепи фибриногена и сывороточного амилоида Р у разных добровольцев достигал 60%.

Эксперимент с 105-суточной изоляцией в гермообъекте. Пребывание человека в условиях ограниченного пространства сопровождается изменением функционирования различных систем организма. Для выявления изменений в протеоме плазмы крови мы проанализировали 30 образцов плазмы крови 6 здоровых добровольцев в условиях модельного эксперимента с 105-суточной изоляцией в гермообъекте.

Средний коэффициент вариации интенсивности анализируемых пятен в период проведения эксперимента составил 27±12%, что немногим превышает средний коэффициент технической вариации метода - 20% (оценен по образцам, полученным от участников изоляции). Оказалось, что только для 5 белковых пятен коэффициент вариации в данном эксперименте превысил 50%, что может указывать на достоверное изменение концентрации соответствующих белков (рис. 8). Таким образом, протеом плазмы крови претерпевает определенные изменения в ходе воздействия модельного эксперимента с изоляцией, но наблюдаемые изменения не столь существенны по сравнению с результатами модельного эксперимента с «сухой» иммерсией.

Рисунок 8. Распределение среднего коэффициента вариации интенсивности белковых пятен на двумерных электрофореграммах в эксперименте с 105-суточной изоляцией относительно коэффициента технической вариации метода.

Наблюдаемые у участников длительной изоляции изменения связаны с увеличением или уменьшением интенсивности пятен, относящихся к следующим белкам: б- и в-цепи фибриногена, фрагмент фактора С4 комплемента, аполипопротеины A-I и Е, плазминоген, фактор С1 комплемента и иммуноглобулин М (табл. 4).

Таблица 4. Идентифицированные белковые пятна с изменяющимся уровнем интенсивности у 6 здоровых добровольцев в ходе эксперимента со 105-суточной изоляцией в гермообъекте.

Примечание: CV - коэффициент вариации; MW - молекулярный вес; pI - изоэлектрическая точка и * - перекрывание аминокислотной последовательности белка идентифицированными пептидными фрагментами.

Изменение уровня интенсивности пятен, относящихся к аполипопротеинам A-I и Е, вероятно, связано со сдвигами в липидном метаболизме, которые в свою очередь могли быть вызваны изменением привычного рациона питания и ограничением двигательной активности испытателей. Исследование биохимических показателей крови в экспериментах с длительной изоляцией в гермообъекте выявило определенные отклонения в уровне энергетического, белково-азотистого, нуклеинового и холестеринового обмена (Маркин А.А., Журавлева О.А. и др., 2010). По-видимому, гипокинезия, являющаяся неотъемлемым фактором длительной изоляции в гермообъекте, вызывает изменения в содержании аполипопротеинов плазмы крови. Считается, что изменения липидного состава мембранных структур клеток организма, а также плазмы крови тесно связаны с двигательной активностью человека, зависят от его компенсаторных возможностей по отношению к внешним стрессогенным воздействиям и от глубины сформировавшихся метаболических сдвигов (Заболотская И.В., Маркин А.А., 2001; Найдина В.П., Ларина И.М. и др., 1991).

Изменение уровня фибриногена могло быть связано с «подвижностью» фракции белков острой фазы, уровень которых изменяется в ответ на различные неблагоприятные воздействия: воспаления, обусловленные бактериальной инфекцией, травматическими повреждениями (Алешкин В.А., Новикова Л.И. и др., 1998). В том числе уровень фибриногена может изменяться в связи со стрессогенными периодами эксперимента в начале и конце изоляции.

Обнаруженные изменения уровня интенсивности белковых пятен, относящихся к факторам С1 и С4 системы комплемента и иммуноглобулину М, могут указывать на возможную активацию иммунной системы организма в период изоляции, в ответ на определенные факторы окружения, в том числе - на специфическую микробную среду гермообъекта. Динамичность иммунной системы дает возможность адаптироваться к постоянно меняющимся внешним воздействиям и тем самым характеризует норму функционирования организма (Лебедев К.А., Понякина И.Д., Авдеева В.С., 1991).

При этом, если в эксперименте с изоляцией наблюдали резкие колебания анализируемых белков у отдельных индивидуумов, то в период реадаптации для большинства показателей была характерна тенденция возврата к фоновым значениям, что говорит об адаптационном характере наблюдаемых изменений.

Сопоставление пластичности протеома плазмы крови с изменениями уровня содержания идентифицированных белков при патологии

Обобщая результаты сравнительного анализа двумерных электрофореграмм, полученных как в экспериментах по оценке внутри- и межиндивидуальной (биологической) вариабельности протеома плазмы крови здоровых добровольцев, так и данные экспериментов по моделированию факторов космического полета, было выявлено 12 белков, уровень которых достоверно изменялся. Белки относятся к следующим системам организма: регуляция гемостаза - б-, в-цепи фибриногена, плазминоген и витронектин; метаболизм липидов - аполипопротеины A-I, A-IV, Е и J (кластерин) и иммунная система - факторы С1 и С4 комплемента, сывороточный амилоид Р и иммуноглобулин М. Как видно из литературных данных, большинство этих белков присутствует в крови в концентрации 10^-7-10^-4 М (J. Schaller, S. Gelber et al., 2008). Это в первую очередь свидетельствует о методических ограничениях выбранного способа визуализации с использованием окрашивания Coomassie Brilliant Blue.

В проведенных модельных экспериментах здоровые добровольцы испытывали воздействия, которые находятся в пределах физиологических резервов организма. Соответственно и наблюдаемые изменения белкового состава крови отражали нормальную (адаптационную) вариабельность протеома (так называемую пластичность), не связанную с развитием патологии. В рамках данной работы был проведен анализ с привлечением литературных данных, полученных методом двумерного электрофореза, чтобы проверить сопоставимо ли изменение уровня белков, выявленных у здоровых добровольцев с данными об изменениях, связанных с развитием каких-либо патологических процессов. Соответствующие литературные данные для 7 идентифицированных в модельных экспериментах белков приведены в таблице 5.

Анализ литературы показал, что наблюдаемые в протеомных профилях здоровых добровольцев изменения в большинстве случаев уже были ранее охарактеризованы в связи с патологическими процессами. В большинстве приведенных в таблице 5 работ, описывающих изменение данных белков при развитии патологического процесса, исследователи отмечали изменение уровня белков семейства аполипопротеинов. Нами также было выявлено достоверное увеличение уровня аполипопротеинов A-I, E и A-IV в период реадаптации организма к нормальной гравитации после 7-суточного воздействия «сухой» иммерсии. Уровень этих белков изменялся от двух до шести раз при таких заболеваниях, как острый дыхательный синдром (J.-H. Chen et al., 2004), инфаркт миокарда (P.J. Mateos-Caceres et al., 2004), диабет, нефропатия (A. Lapolla et al., 2008) и различные онкологические процессы (Е.И. Гоуфман с соавт., 2006; H.-L. Huang et al., 2006). Уровень другого белка - плазминогена, который характеризовался высокой пластичностью в эксперименте с изоляцией в гермообъекте - увеличивался в связи с таким заболеванием, как рак поджелудочной железы (М. Bloomston et al., 2006). Необходимо отметить, что изменения уровня белков, выявленные у здоровых добровольцев, меньше или соизмеримы с таковыми, наблюдаемыми при развитии заболеваний.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблица 5. Белки, характеризующиеся высокой вариабельностью у здоровых добровольцев, изменение уровня содержания которых по литературным данным наблюдали в связи с развитием патологических процессов.

Примечание: CV - коэффициент вариации; ^v - возрастание/убывание в указанное число раз.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Из данных таблицы 5 следует, что работы, выполненные методом двумерного электрофореза с целью поиска маркеров заболеваний, не учитывали параметры нормальной вариабельности, присущей здоровому организму. Как следствие, среди кандидатов в биомаркеры обнаруживали белки, изменение уровня которых характерно для здорового человека. Поэтому, определение доверительных интервалов, в пределах которых количественные изменения белкового состава крови не связаны с молекулярным механизмом развития болезни, остается актуальной научно-практической задачей протеомики.

Полученные данные свидетельствуют, что наблюдаемые во многих протеомных исследованиях изменения белкового профиля в большей степени имеют отношение к понятию физиологической нормы протеома плазмы крови, нежели к развитию патологического процесса. Изучение такого рода изменений может иметь практическое значение с точки зрения исследования индивидуальных защитных механизмов, повышающих функциональные резервы здорового человека при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и факторов космического полета.

ВЫВОДЫ

Получена протеомная карта обедненной фракции плазмы крови здорового человека, содержащая 140 белковых пятен, из которых 70 белковых пятен воспроизводились более чем на 70% электрофореграмм и характеризовались коэффициентом технической вариации не превышавшим 25%.