Гемопоэз и метаболический статус эритроцитов мышей при длительном комбинированном воздействии ионизирующей радиации и химических веществ, моделирующем условия межпланетных полётов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ГЕМОПОЭЗ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ СТАТУС ЭРИТРОЦИТОВ МЫШЕЙ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ КОМБИНИРОВАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ, МОДЕЛИРУЮЩЕМ УСЛОВИЯ МЕЖПЛАНЕТНЫХ ПОЛЁТОВ

ТАТАРКИН СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

Специальность 14.03.08 - авиационная,

космическая и морская медицина

Москва - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ-ИМБП РАН)

Научные руководители: доктор медицинских наук Мухамедиева Лана Низамовна доктор биологических наук Шафиркин Александр Венецианович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно- исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды имени А.Н. Сысина» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий лабораторией Пинигин Мигмар Александрович

доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук, главный научный сотрудник Ильин Евгений Александрович

Ведущая организация: Научно- исследовательский испытательный центр (авиационно-космической медицины и военной эргономики) 4 Центрального научно-исследовательского института Минобороны России, г. Москва

Защита состоится « »_________ 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук (123007, г.Москва, Хорошевское шоссе).

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ

Dэф …....- эффективная остаточная доза излучения

Г6ФД - глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа

КМО …-.коэффициента модификации радиационного ответа

НО . ..-обобщенная доза излучения для характеристики отдаленных …………… …………………..неблагоприятных эффектов

ПАЛМ - периартериальная лимфоидная муфта

ПДКпка .-предельно допустимая концентрация (применительно к пилотируемым …………………..космическим аппаратам)

ХА - хромосомные аберрации

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение эффектов радиационного и химического воздействий на организм человека в диапазоне доз и концентраций, моделирующих режимы воздействия на космонавтов при межпланетном полете, и процессов компенсации вызываемых повреждений связано, прежде всего, с исследованием системы кроветворения, выполняющей основную роль в поддержании гомеостаза организма. Научное и практическое значение представляют комплексные исследования гемопоэза и метаболических процессов в эритроцитах, отражающие механизмы модификации функционирования клеточных мембран организма при патологиях различного генеза и эффект клеточную адаптацию в ответ на сочетанное воздействие факторов космического полета (Мазурик В.К., Михайлов В.Ф., 1999, Иванова С.М., 2001, Новицкий с соавт. 2006).

Предвидеть результирующий ответ биологической системы на комбинированное воздействие облучения и химических веществ, исходя из информации о биологических эффектах их изолированного воздействия, затруднительно вследствие формирования нелинейного отклика (от антагонизма до синергизма), обусловленного уровнем сохранности адаптационных возможностей организма (Гераськин С.А. и др. 1996). Повышение риска возникновения неблагоприятных радиобиологических эффектов в процессе космического полета подтверждается увеличением коэффициента модификации до 1,3 (КМО - коэффициент модификации радиационного ответа за счет нерадиационных факторов космического полета; в настоящее время равен 1) (Саксонов П.П., Антипов В.В., Давыдов Б.И., 1968; Григорьев Ю.Г., 1975; Антипов В.В., Давыдов Б.И., Вериго В.В., Свирижев Ю.М.,1975; Ушаков И.Б., 2000, 2003; Шафиркин А.В., Григорьев Ю.Г., 2004, 2009).

При выполнении профессиональной деятельности космонавт длительное время находится в среде, неблагоприятным фактором которой является комбинированное воздействие ионизирующей радиации и многокомпонентного загрязнения воздуха химическими веществами. При этом мероприятия, направленные на защиту экипажей пилотируемых космических аппаратов, сводятся к контролю соблюдения существующих гигиенических нормативов, таких как ГОСТ 25645.201-83; ГОСТ 28645.215-85; Методические указания МУ 2.6.1.44-03 - 2004, а также ГОСТ Р50 804 и SS Р50 260. Однако до настоящего времени нормативные требования не учитывают модифицирующего влияния химических веществ и ионизирующего излучения при сочетанном их воздействии (Савина В.П. с соавт., 1986; Мухамедиева Л.Н., с соавт. 2001; Федоренко Б.С. с соавт, 2002; Мухамедиева Л.Н., 2003; Ворожцова С.В., с соавт. 2004). В то же время, согласно опубликованным данным, комбинированное радиационное и химическое воздействие в низких концентрациях сопровождается преимущественно эффектами суммации, или синергизма, и характеризуется у животных более выраженными метаболическими и цитогенетическими нарушениями в отличие от изолированного воздействия повреждающих факторов (Маленченко А.Ф., 1989; Заичкина С.И., Розанова О.М., Аптикаева Г.Ф., 2001; Иванов С.Д., Семенов В.В., Кованько Е.Г., 2002; Burkart W., Finch G.L., Jung T., 1997; Lubin J., 1998). При этом наблюдаемые генные нарушения в системе кроветворения характерны как для воздействия химической природы (хроматидные аберрации), так и для токсического эффекта ионизирующей радиации (хромосомные поломки). Цитогенетическими исследованиями сочетанного воздействия факторов в условиях радиационного производства было установлено, что увеличение общей частоты хромосомных аберраций в клетках происходит за счет аберраций хроматидного типа - маркеров химического мутагенеза (Назаренко С.А., Тимошевский В.А. 2005), угнетение гемопоэза определяется на уровне полипотентных стволовых клеток в костном мозге и селезенке со снижением способности клеток к дифференцировке (Маленченко А.Ф., 1989; Заичкина С.И., Розанова О.М., Аптикаева Г.Ф., 2001; Иванов С.Д., Семенов В.В., Кованько Е.Г., 2002; Burkart W., Finch G.L., Jung T., 1997, 1998; Lubin J., 1998, Баранцева М.Ю. с соавт. 2010, 2011). Исследования цитогенетических нарушений в костном мозге животных при сочетанном радиационном и химическом воздействии в диапазоне низких (30сГр) доз г-облучения и концентраций химических веществ, характерных для орбитальных пилотируемых космических полетов, показали суммацию биоэффектов с более выраженными повреждениями хромосомного аппарата в ядросодержащих клетках костного мозга, чем при изолированном воздействии факторов (Баранцева М.Ю. с соавт., 2007).

Основной вклад до (95%) в суммарную загрязнённость воздушной среды пилотируемых космических аппаратов (ПКА) вносят ацетон, ацетальдегид и этанол. Эти вещества включены в приоритетный перечень основных загрязнителей, определяющих качество воздушной среды ПКА (ГОСТ Р50 804 и SS P50 260), и были использованы в данной работе для изучения комбинированного радиационного и химического воздействий на организм в концентрациях, соответствующих ПДК пилотируемых космических аппаратов (ПДКпка) (Мухамедиева Л.Н., 2003).

Учитывая, что расчетная суммарная доза г-облучения, воздействующая на космонавтов в условиях межпланетного пилотируемого полета, превысит орбитальный уровень и составит около 120 - 150сГр, можно прогнозировать усиление генотоксического эффекта комбинированного радиационного и химического воздействий и изменения коэффициента модификации до значения КМо > 1,0 (А.В. Шафиркин, с соав.1998, Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д., 2001, Петров В.М., с соав. 2003; Ушаков И.Б., 2003).

Следовательно, для формирования научной основы гигиенического нормирования комбинированного действия радиационного и химического факторов необходимо установить характер биологического ответа организма (суммирование, синергизм), на дозы и концентрации, характерные для межпланетных полетов, с проведением комплексных исследований реакции гемопоэза и метаболической перестройки в клетках как чувствительных индикаторов компенсации повреждений системы кроветворения и поддержания гомеостаза на уровне организма в целом.

Учитывая, что перспективные программы межпланетных полетов на Луну и Марс будут связаны со значительным удлинением сроков пребывания человека в космическом пространстве, проблема экспериментального изучения комбинированного воздействия радиационного и химического факторов на организм приобретает особую актуальность.

Цель исследования: изучить цитологические и цитогенетические изменений гемопоэза и метаболические перестройки в эритроцитах для установления характера биологического ответа системы кроветворения мышей на комбинированное последовательное радиационное и химическое воздействие, моделирующее условия для космонавтов при межпланетных полетах.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1) Изучить динамику цитологических и цитогенетических изменений в органах кроветворения (костный мозг и селезенка) экспериментальных животных (мыши) при изолированном и комбинированном последовательном воздействии ионизирующей радиации в суммарной дозе 350 сГр (Dэф = 70 сГр) и смеси химических веществ (пары ацетона, ацетальдегида и этанола) на уровне ПДКпка, моделирующих условия межпланетных полетов.

2) Изучить динамику показателей метаболического статуса эритроцитов при изолированном и комбинированном последовательном воздействии ионизирующей радиации и смеси химических веществ в дозах и концентрациях, моделирующих условия межпланетных полетов.

3) Провести сравнительную оценку динамики клеточного состава, типа хромосомных аберраций в кариоцитах костного мозга и пролиферирующей активности в селезенке в восстановительном периоде после комбинированного последовательного радиационного и химического воздействия. кровь химический цитологический периферический

4) Провести анализ полученных экспериментальных данных для установления характера биологического ответа системы кроветворения экспериментальных животных на комбинированное последовательное воздействие г-облучения 350 сГр (Dэф = 70 сГр) и смеси химических веществ в низких концентрациях (ПДКпка).

5) На основе количественных оценок с использованием системы интегральных показателей, используемых в физиологических и гигиенических исследованиях, включая обобщенный логарифмический показатель, определить уровень выраженности адаптационных процессов при изолированном и комбинированном действии исследуемых факторов и степень напряженности регуляторных систем организма мышей.

Научная новизна работы. Впервые экспериментально установлено, что комбинированное воздействие ионизирующей радиации в суммарной дозе 350 сГр (Dэф = 70 сГр) и смеси химических веществ в низких концентрациях вызывает дополнительно к индуцированному действию изолированных факторов усиление эффектов повреждения органов системы кроветворения с закреплением потенциально летальных (сублетальных) нарушений хромосомного аппарата клеток, напряжение антиоксидантного потенциала клеток, перенапряжение регуляторных механизмов адаптивных процессов в организме экспериментальных животных, сохраняющееся в восстановительном периоде, что свидетельствует о синергическом эффекте взаимодействия факторов.

Практическая значимость работы.

Проведенные исследования создают научную основу для коррекции (коэффициентов модификации КМо) нормативных требований к комбинированному воздействию на человека в орбитальном полете радиации и химических веществ и разработке методологии гигиенического нормирования и нормативов при увеличении длительности пилотируемых полетов до 3 лет как основы для разработки медико-технических требований к перспективным системам жизнеобеспечения.

Получены экспериментальные данные для расчета радиационного риска и возможного сокращения средней предстоящей продолжительности жизни человека при комбинированном воздействии смеси химических веществ на уровне ПДКПКА и ионизирующей радиации.

Основные положения, выносимые на защиту.

1) Комбинированное воздействие г-облучения в суммарной дозе 350 сГр (Dэф = 70 сГр) и смеси химических веществ (пары ацетона ацетальдегида и этанола) в концентрациях на уровне ПДКпка на систему кроветворения мышей сопровождается депрессией гемопоэза, угнетением пролиферативной активности клеток костного мозга и селезенки, нарушениями митоза в кариоцитах костного мозга с преобладанием хромосомных повреждений по типу фрагментов, свидетельствуя о снижении способности аберрантных клеток к репарации, и реакцией «клеточного опустошения» селезенки.

2) Метаболическая перестройка в эритроцитах при комбинированном воздействии г-облучения в суммарной дозе 350 сГр (Dэф = 70 сГр) и смеси химических веществ в низких концентрациях, характеризуется напряжением регуляторных механизмов, направленных на поддержание гомеостаза и окислительно - восстановительного потенциала клетки.

3) Комбинированное воздействие радиации и смеси химических веществ сопровождается усилением эффектов повреждения органов кроветворения с закреплением потенциально летальных (сублетальных) нарушений хромосомного аппарата клеток, перенапряжением регуляторных механизмов адаптивных процессов в организме мышей, сохраняющимся в восстановительном периоде.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на:

Всероссийской конференции с международным участием - «Современные проблемы гигиенической науки и медицины труда», Уфа, 2010 г, 22-23 сентября; 21 съезде Физиологического общества им. Павлова, г.Калуга, 19-25 сентября, 2010 г.; конференции молодых учёных, специалистов и студентов, посвящённая Дню космонавтики, Москва, 2010 г., 14 апреля; Международном космическом форуме 2011 г., посвященный 50-летию полета в космос Ю.А. Гагарина. Россия, Москва; Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии», Россия, Санкт-Петербург, май 2011 г.; XXXV Академических чтениях по космонавтике. Россия. Калуга, 2011 г.; Х конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная 50-летию со дня первого полета человека в космос. Россия, Москва, 2011 г.; Всероссийской научно практическая конференция с международным участием «Современные Проблемы гигиенической науки и медицины труда, Уфа, 2011 г.; VII международном аэрокосмическом конгрессе IAC, Москва, 26-31 августа, 2012 г.

По теме диссертационной работы опубликовано 18 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах.

Диссертация апробирована на секции «Космическая медицина» Учёного Совета ФГУН ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН (протокол №2 от 2 апреля 2013г).

Личный вклад автора. Результаты, составляющие основу работы: исследования костного мозга (клеточный состав и цитогенетические нарушения), морфологический состав периферической крови получены автором самостоятельно. Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении длительных экспериментов на животных, отборе экспериментального материала и подготовке экспериментального материала к анализу. Автором научно обоснованы и обобщены результаты экспериментальных исследований. В работах, выполненных в соавторстве, автором проводился отбор и подготовка экспериментального материала к анализу и научное обобщение результатов исследований. Автор принимал непосредственное участие на всех этапах экспериментально-теоретического обоснования и обсуждения результатов, изложенных в научных публикациях и докладах.

Соответствие работы паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.03.08. - «авиационная космическая и морская медицина», пункт 4.

Реализация полученных результатов. Результаты исследований использованы как основа для модели математического прогнозирования токсикологических эффектов при разработке гигиенических нормативов (ПДК) содержания вредных химических веществ в воздухе обитаемых герметичных помещений и пилотируемых космических аппаратов (Акт внедрения №783А-121-03/13).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, включающих обзор литературы, материалов и методов исследований, результатов проведенных исследований, обсуждения полученных результатов, а также заключения с предложениями о возможной реализации полученных в работе результатов, выводов и списка литературы. Диссертация содержит 142 машинописных страницы, включающих 22 таблиц, 8 рисунков. Список литературы включает 233 работы, из них 164 отечественных и 59 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Исследования проводились на 504 половозрелых мышах (масса 20-23 г) линии F1(CBAЧC57BL6) с учетом норм и правил биомедицинской этики: использование минимального количества животных было достаточным для получения статистически достоверных результатов. Контрольная группа составляла 168 мышей. При выборе методов исследования исходили из поставленных задач.

Исследования костного мозга. Определение общего количества ядросодержащих клеток костного мозга проводилось по стандартной методике (Mantz J.M., 1957). Анализ количества клеток костного мозга с хромосомными аберрациями в виде мостов и фрагментов проводили с использованием анафазного метода на стадии поздней анафазы - ранней телофазы (Груздев Г.П., 1968).

Морфологическое исследование селезёнки. Для исключения влияния на чистоту эксперимента сопутствующих заболеваний при вскрытии проводилась ревизия всех органов животных. Подсчет клеток проводили на срезах, окрашенных гематоксилином - эозином и пикрофуксином по Ванн-Гизона. Общую оценку гистологического препарата селезенки, линейные измерения, подсчет клеточного состава лимфоидной ткани проводили на микропрепаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, микротопографию белой пульпы селезенки - на препаратах после окраски пикрофуксином. Линейные размеры (толщина и диаметр периартериальных муфт, продольный размер лимфоидного узелка) измеряли при помощи окулярной линейки. Количество лимфоидных узелков измерялось в десяти квадратах окулярной сетки (площадь 880 кв мкм каждый, т.е. на площади 8800 кв мкм). Измерение линейных размеров и площадей проводили в пяти полях зрения микроскопа. Подсчет клеток осуществлялся при помощи морфометрической сетки (с шагом 10,39 мкм), вмонтированной в окуляр (10х) микроскопа.

Исследование морфологического состава периферической крови. Определение количества ретикулоцитов проводили в мазках крови на 1000 эритроцитов в «разреженных полях» под большим увеличением (Любина А.Я, Ильичёва Л.П., 1984).

Подсчёт лейкоцитарной формулы проводился на окрашенных мазках крови на 200 лейкоцитов. Окраска мазков производилась поэтапно красителем-фиксатором Май-Грюнвальдом, а затем красителем по Романовскому (Меньшиков В.В., 1987).

Исследование метаболического статуса эритроцитов. Биохимические исследования проводили в гепаринизированной крови животных. Метаболизм эритроцитов и структурно-функциональное состояние их мембран оценивали по содержанию аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), лактата, восстановленного глутатиона (gSH), активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (Beutler, E.M.D., 1975). В каждой пробе смешивали кровь от 4 животных (Баранцева М.Ю., Иванова С.М. с соавт. 2006).

Оценка напряжённости адаптационных процессов организма. Для расчетов обобщенного логарифмического показателя (ОЛП) использовали упрощенное выражение для оценки действия факторов на каждый исследованный параметр гемопоэза в отдельности ILg = Lg[Ni(t)/N0i(t)], где ILg -- обобщенный логарифмический показатель; Ni -- значение i-го параметра, выбранного для характеристики состояния какой-либо физиологической системы в исследуемой группе организмов.

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента, корреляционного и дисперсионного анализа, пакетов программ Statgraf и Excel (Урбах В.Ю., 1975). Результаты экспериментов представлены в виде среднеарифметической и стандартного отклонения (M±m). Различия считались достоверными при критическом значении уровня значимости 5% (р<0,05).

Методика проведения экспериментов на животных. Исследования на мышах при моделировании длительного изолированного и комбинированного воздействия фракционированного г-облучения и смеси химических веществ, а также изменения изучаемых показателях в восстановительном периоде (90суток) были проведены в многоуровневом эксперименте общей продолжительностью 522 суток, включающие:

1)Изучение биологического действия на организм животных длительного (146 суток) изолированного фракционированного г-излучения в расчетных дозах, моделирующих уровень воздействия на космонавтов при осуществлении межпланетного космического полёта. 2)Изучение биологического действия изолированного воздействия (160 суток) смеси химических веществ в изоэффективных концентрациях. 3)Изучение длительного (224 суток) комбинированного воздействия фракционированного г-облучения и смеси химических веществ.

Моделирование радиационного воздействия. Экспериментальные мыши еженедельно в течении 70 суток (всего 10 раз по 50 сГр) в суммарной дозе 350 сГр были облучены на г-облучателе биологических объектов ГОБО-60 с источником излучения 137Cs в ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Суммарная доза 350 сГр была выбрана с учетом коэффициента экстраполяции радиочусвительности мышей, равного 3, которая соответствует дозе для человека около 120 сГр и согласуется с возможным уровнем суммарных среднетканевых эквивалентных доз для космонавтов при осуществлении межпланетного полета на Марс (Шафиркин А.В., Григорьев Ю.Г.,2009; Шафиркин А.В., Коломенский А.В., Митрикас В.Г., Петров В.М.,2010). Мощность дозы источника г-излучения составляла 25 сГр в час. Учитывая быстрые процессы восстановления на клеточном уровне, эффективная доза за каждую фракцию составляла 35 сЗв. Следовательно, суммарная доза на 63-и сутки от начала эксперимента после 10-ой фракции составила 350 сГр. Животных забивали на 2-е сутки после очередной дозы облучения. Учитывая восстановительные процессов на уровне организма, эффективная остаточная доза нарастала, затем выходила на плато и оставалась на уровне около 70 сГр.

Моделирование воздействия смеси химических веществ. При моделировании длительного ингаляционного комбинированного воздействия смеси химических веществ животные находились в гермокамерах с рабочим объемом 12 м³. Исследования проводили на испытательном стенде для санитарно-химических и токсикологических исследований (УМБИ-1) ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Автономная система очистки и регенерации воздуха поддерживала концентрации основных газов (кислород 21 ± 2%, диоксид углерода 0,05-0,2%), аммиак 0,05-2,2 мг/м³ и химических примесей в пределах ПДК для герметичных помещений, а также заданные параметры температуры 24 ± 2⁰С и относительной влажности воздуха 65 ± 3%.

Ингаляционное воздействие смеси паров химических веществ ацетона, ацетальдегида и этанола осуществлялось динамическим способом. Контроль концентраций веществ проводился 1 раз в сутки методом газовой хроматографии. Величины концентраций поддерживались в гермокамере в течение всего экспериментального периода в пределах 0,67-1,4; 0,86-1,75; 3,78-9,91 (мг/м³) соответственно для ацетона, ацетальдегида и этанола. Состав и концентрации химических соединений для затравочной смеси были выбраны в соответствии с приоритетным перечнем химических веществ, которые вносят основной вклад (от 85 до 95%) в загрязнение воздушной среды пилотируемых космических аппаратов (Мухамедиева Л.Н., 2003) с учетом их однонаправленного токсического биоэффекта.

Моделирование длительного комбинированного воздействия г-излучения и смеси химических веществ.

Длительное комбинированное воздействие радиационного и химического факторов осуществляли последовательно. Сначала мышей подвергали 146 суточному фракционному г-облучению в суммарной дозе 350 сГр (Dэф = 70 сГр), а затем 70 суточному химическому воздействию парами ацетона, ацетальдегида и этанола, в концентрациях на уровне ПДКпка, согласно приведённому выше описанию. После окончания последовательного радиационного и химического воздействия исследовался длительный период последействия (90 суток).

Объём и структура экспериментальных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 Объем и структура экспериментальных исследований

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биологическое действие длительного фракционированного г-облучения в суммарной дозе 350 сГр (Dэф = 70 сГр) на гемопоэз и метаболический статус эритроцитов

Фракционное г-облучение в возрастающей дозе до 350 сГр (Dэф = 70сГр) сопровождалось депрессией гемопоэза с уменьшением числа малодифференцированных клеток костного мозга (p<0,05). Цитогенетические нарушения характеризовались структурными изменения хромосом в делящихся клетках костного мозга преимущественно в виде образования мостов (57,03%) и возросшим количеством клеток с нарушениями митозов в зависимости от накопленной дозы (табл. 2).

Таблица 2 Динамика количества кариоцитов и аберрантных митозов (%) в костном мозге животных при изолированном и комбинированном воздействии г-облучения и смеси химических веществ.

Примечание: *статистически значимые отклонения от группы контроля (p<0,05)

Волнообразный характер цитогенетических нарушений, возможно, обусловлен одновременно протекающими процессами нарушения и репарации генетического аппарата. Полагаем, что наблюдаемое в исследованиях превалирование структурных нарушений в клетках по типу мостов при г-облучении подтверждает этот вывод и свидетельствует о способности генетического аппарата к репарации.

В селезёнке у мышей экспериментальной группы изменения характеризовались отсутствием (кроме единичных случаев) центров размножения в составе лимфоидных узелков, в отличие от группы контроля. Толщина периартериальной лимфоидной муфты (ПАЛМ) была неравномерной. Существенно изменялся качественный состав белой пульпы, в которой практически отсутствовали типичные межклеточные (микросинтопические) взаимоотношения между разными типами клеток лимфоидного ряда (ряды малых и средних лимфоцитов, макрофагально-лимфоцитарные комплексы). Наблюдались лишь единичные плазмоциты и плазмобласты, митотически делящиеся клетки лимфоидного ряда, при существенном возрастании количество деструктивно измененных клеток.

Угнетение красного ростка кроветворения отразилось в снижении концентрации гемоглобина в периферической крови -3,46% (p<0,05, на 14-е сутки эксперимента) и ретикулоцитов (-30,5%, p<0,001, к 36-м суткам эксперимента), при этом количество эритроцитов статистически значимо не изменялось. Количество лейкоцитов к 70-м суткам воздействия уменьшилось на 30,5% (p<0,001).

Результаты проведенных исследований показали, что при фракционном воздействии облучения в возрастающей дозе до 350 сГр (Dэф = 70 сГр) наблюдалось снижение интенсивности энергообразующих процессов в эритроцитах (таблица 3). Вместе с тем увеличение активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ) подтверждает сохранность антиоксидантного потенциала клетки, а волнообразный характер изменения концентрации восстановленного глутатиона, свидетельствуя об интенсификации свободнорадикальных процессов в клетке и компенсаторном характере наблюдаемых сдвигов, направленных на сохранение метаболического гомеостаза.

Биологический эффект длительного ингаляционного воздействия смеси химических веществ в низких концентрациях на гемопоэз и метаболический статус эритроцитов

В отличие от радиационного фактора, длительное ингаляционное воздействие химических веществ не сопровождалось значимыми изменениями в показателях красной крови. Статистически значимые отклонения количества ретикулоцитов от контроля наблюдались лишь на 14-е сутки воздействия, тогда как концентрация гемоглобина и количество эритроцитов оставались в пределах величин контрольной группы. Лейкопения, напротив, была выражена в большей степени по сравнению с эффектом г-облучения и отклонение от группы виварного контроля составило 52,53% (p<0,001).

Таблица 3 Сравнительная характеристика показателей метаболизма эритроцитов периферической крови животных при изолированном и комбинированном воздействием г-облучения и смеси химических веществ.

Примечание: ^, v-характер отклонения статистически значимых различий от контрольных значений (p<0,05).

Количество клеток с аберрантными митозами практически не изменялось на протяжении экспериментального периода (табл.2). Однако при относительной стабильности общего числа клеток с аберрантными митозами с 14 суток воздействия, прослеживалось увеличение количества клеток с генными структурными нарушениями по типу фрагментов, свидетельствующее о токсическом эффекте воздействия и снижении способности аберрантных клеток костного мозга к восстановлению генетического аппарата. В пользу этого свидетельствовала и лейкопения в периферической крови, нарастающая (p<0,001) по мере увеличения длительности воздействия.

Микротопографиия и клеточный состав красной и белой пульпы селезенки характеризовались исчезновением больших лимфоцитов и митотически делящихся клеток лимфоидного ряда (юные формы клеток). Верифицировалось значительное содержание деструктивно измененных клеток лимфоидного ряда, обнаруживались лишь единичные эритроциты, тромбоциты, четко прослеживалась неравномерность ПАЛМ, что можно рассматривать как проявление реакции «клеточного опустошения» и снижения пролиферативной активности клеток в следствии воздействии смеси химических веществ.

При анализе динамики метаболических процессов в эритроците экспериментальных животных (табл. 3) прослеживается стабилизация энергообразования и антиоксидантной защиты клетки, направленных на поддержание процессов гомеостаза при детоксикации воздействия химических веществ. Однако наблюдаемое к 70 суткам воздействия (p<0,05) одновременное уменьшение активности гликолиза и Г6ФД, а также образования восстановленного глутатиона, свидетельствует о снижение компенсаторных возможностей клетки, токсическом эффекте воздействия химических веществ.

Биологический эффект длительного комбинированного фракционированного г-облучения и последующего ингаляционного воздействия смеси химических веществ на гемопоэз и метаболический статус эритроцитов

Комбинированное воздействие химического и радиационного факторов сопровождалось депрессией гемопоэза с уменьшением количества кариоцитов (p<0,001), одновременным увеличением числа клеток костного мозга с генетическими перестройками (ХА) и по характеру ответа соответствовало зависимости доза-эффект (табл. 2). Основным отличием ответа генетического аппарата клеток костного мозга на комбинированное воздействие факторов по сравнению с изолированным воздействием является тип поломок. Так, если при комбинированном воздействии динамика изменения количества аберрантных клеток в большей степени соответствовала эффекту ионизирующего излучения, то вид ХА в ядросодержащих клетках костного мозга определялся эффектом воздействия смеси химических веществ на уровне ПДКпка и выражался увеличением аберрантных поломок в виде фрагментов. Количество ХА в клетках костного мозга за счет фрагментов составило 67,7%, тогда как количество мостов было в пределах 32,3%.

Изменения в селезенке характеризовались большим по сравнению с изолированным воздействием уменьшением массы органа, дефицит которой сохранялся в восстановительном периоде. Наблюдалось уменьшение количества лимфоидной ткани, уменьшение общего числа клеток лимфоидного ряда (до 12,3 ± 0,9 против 23,7±2,5 в контроле), угнетение пролиферативной активности клеток лимфоидного ряда. Увеличение доли деструктивно измененных лимфоидных клеток было более выраженным по сравнению с изолированным действием факторов. Наблюдаемые морфологические изменения в селезенке и одновременное исчезновение плазмоцитов и плазмобластов в белой пульпе и эритроцитов и тромбоцитов - в красной пульпе характерны для реакции «клеточного опустошения» органа.

Динамика клеточного состава периферической крови экспериментальных мышей свидетельствовала о стабильности красного ростка кроветворения (рис. 1). Так, количество эритроцитов в периферической крови составляло в среднем 10,5+1,8*1012/л, что не имеет статистически значимых различий с группой контроля. Концентрация гемоглобина оставалась неизменной весь экспериментальный период. Количество ретикулоцитов в периферической крови на 14-е и 28-е сутки комбинированного воздействия было выше (р<0,05) значений контрольной группы на ^12,1% и 54,1% соответственно. Дальнейшее увеличение длительности воздействия не оказало значимого влияния на количество ретикулоцитов, которое имело тенденцию к постепенному снижению, приближаясь к значениям контрольной группы (р>0,05).

Рис. 1. Динамика показателей периферической крови при последовательном воздействии радиационного и химического факторов. Отклонение от контроля, %.

Исследование динамики количества лейкоцитов в периферической крови животных показало постепенное (с 14-х суток воздействия) нарастание лейкопении (р<0,001), что характерно как для воздействия химических веществ, так и для г-облучения. Количество лейкоцитов в экспериментальной группе снизилось на 34,7% по сравнению с группой контроля, однако к 70-м суткам химического воздействия, последовавшего за радиационным, статистически значимых отличий между опытной и контрольной группами (р>0,05) не наблюдалось.

Изменения в метаболическом статусе эритроцитов при комбинированном воздействии радиационного и химического факторов характеризовались стабилизацией метаболической активности и восстановлением интенсивность гликолиза - основного энергетического процесса (табл. 3). Наблюдалось постепенное восстановление уровня АТФ до значений контрольной группы, направленное на нормализацию работы ионных насосов мембранных белков, а, следовательно, и на активацию перестройки мембранных гликопротеидов. Важно отметить, что нормализация процесса энергообразования в клетке сопровождалась постепенным нарастанием окислительно-восстановительного потенциала клетки и выражалась в последовательно нарастающем процессе сохранения синтеза биологического антиоксиданта - глутатиона.

Характеристика адаптационных процессов и степени напряжения регуляторных систем в условиях последовательного длительного действия радиационного и химического факторов

Адаптационные процессы в организме экспериментальных мышей при комбинированном воздействии оценивались по динамике интегральных обобщенных показателей, включая обобщенный логарифмический показатель (ОЛП), величина которого позволяет количественно оценить: характер адаптационных процессов в организме; степень напряжения регуляторных механизмов; скорость снижения функциональных резервов организма и снижение его устойчивости к действию других стрессорных факторов (Григорьев Ю.Г., Шафиркин А.В., Васин А.Л., 2004; Шафиркин А.В., Васин А.Л., 2007; Васин А.Л.,2008).

Рис.2. Динамика напряжённости адаптационных процессов в организме, рассчитанная, на основе обобщенного логарифмического показателя.

Результаты анализа показали, что степень напряженности адаптационных процессов (рис. 2), рассчитанная по динамике показателей, характеризующих процессы антиоксидантной защиты в клетке при комбинированном воздействии факторов в режимах, соответствующих расчетному воздействию на космонавтов в условиях межпланетных полетов, свидетельствуют о более чем суммации биологических эффектов. Наблюдается значительное и более выраженное напряжение адаптационных процессов с перенапряжением регуляторных механизмов в организме мышей по сравнению с эффектом изолированного действия факторов, которое сохраняется в восстановительном периоде, свидетельствует о снижении компенсаторных резервов организма и повышении риска неблагоприятных отдаленных последствий.

Обоснование характера комбинированного действия факторов

При обосновании характера комбинированного действия г-облучения в суммарной дозе 350 сГр (Dэф = 70 сГр) и смеси химических веществ в низких концентрациях был проведен сравнительный анализ показателей системы кроветворения и метаболизма эритроцитов в экспериментальном и восстановительном периодах. Анализ данных показал, что комбинированное воздействие оказало более выраженное повреждение костномозгового кроветворения экспериментальных животных по сравнению с изолированным действием радиационного и химического факторов (табл. 1), что проявлялось депрессией гемопоэза, с уменьшением количества кариоцитов в костном мозге (p<0,001), увеличением аберрантных митозов до 8,5% в ядросодержащих клетках костного мозга, характерных для эффекта г-облучения в дозе 350 сГр (Dэф = 70сГр), и значительным увеличением числа ХА по типу фрагментов (до 60,6%), характерных для изолированного химического воздействия. Важно отметить, что преобладание хромосомных аберраций по типу фрагментов (до 71,5%) сохранялось на 14-е сутки восстановительного периода по окончании комбинированного воздействия, к 90-м суткам последействия было выражено в большей степени по сравнению с изолированным химическим воздействием (рис. 3).

Рис. 3. Соотношение типов хромосомных аберраций (ХА) при изолированном и комбинированном радиационном и химическом воздействии.

Представленные графики (рис. 4) расчетных значений приращения числа хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей, в сравнении с полученными экспериментальными данными свидетельствуют о близости расчетных и экспериментальных величин приращения числа аберрантных митозов при изолированных воздействиях радиационного и химического факторов. В то же время необходимо отметить, что наблюдаемый в эксперименте прирост числа аберрантных клеток при последовательном комбинированном действии факторов является более высоким, чем простое расчетное сложение числа клеток с нарушениями митоза (ХА) при изолированном их воздействии. Это обусловлено, по-видимому, закреплением потенциально летальных (сублетальных) повреждений структуры ДНК клеток, возникающих при радиационном воздействии и обусловленных последующим воздействием химических токсикантов. Важно отметить, что эффект сохранялся на протяжении всего периода ингаляционного действия химических веществ после предшествующего г-облучения (с 78 по 134 сутки от начала эксперимента). В дальнейшем количество аберрантных митозов в клетках снижается по экспоненциальному закону.

Комбинированное воздействие факторов (табл. 3) сопровождалось более выраженным, по сравнению с изолированным действием факторов напряжением восстановительных процессов в эритроцитах, которое сохранялось до 90-х суток восстановительного периода, свидетельствуя о сохранении активности свободнорадикальных процессов, инициации мембраноповреждающего эффекта и напряжении компенсаторных возможностей организма.

Рис.4 Сравнительная характеристика увеличения числа кариоцитов с нарушениями митоза у мышей при изолированном и комбинированном воздействии облучения и химического фактора и эффективной остаточной дозы D_эф, сГр.

Морфологические исследования селезенки экспериментальных мышей показали, что лимфоидные образования органа более чувствительны к комбинированному воздействию факторов. Изменения в селезенке характеризовались более значительным по сравнению с изолированным воздействием уменьшением массы органа, дефицит которой сохранялся в восстановительном периоде. Наблюдалось уменьшение количества лимфоидной ткани и общего числа клеток лимфоидного ряда (до 12,3 ± 0,9 против 23,7±2,5 в контроле). Количество деструктивно измененных лимфоидных клеток было большим по сравнению с изолированным действием факторов. Четко прослеживалась неравномерность ПАЛМ. Наблюдаемые морфологические изменения в селезенке и одновременное исчезновение плазмоцитов и плазмобластов в белой пульпе и эритроцитов и тромбоцитов в красной пульпе характерны для реакции «клеточного опустошения» органа (рис. 5).

В период последействия длительность восстановления морфологических нарушений в селезенке также была различной. Так, регенерация лимфоидной ткани селезенки животных в восстановительном периоде после г-облучения проявлялась на 14-е сутки восстановительного периода и только через 30 суток после химического воздействия. Регенерация лимфоидной ткани селезенки мышей после комбинированного воздействия проявляется только на 60 сутки восстановительного периода в 50% препаратов, когда впервые появляются центры размножения лимфоидных узелков, становятся равномерными по толщине ПАЛМ, нормализуется клеточный состав межклеточных ассоциаций среди клеток лимфоидного ряда и размерные показатели структурных компонентов белой пульпы. Проявления регенерации лимфоидной ткани органа после изолированного воздействия к 90-м суткам восстановительного периода не отличаются от контроля, тогда как после комбинированного воздействия морфологическая картина не соответствует контролю и характеризуется как «неполная регенерация» органа.

Рис.5. Изменение морфологических показателей селезенки при изолированном и комбинированном радиационном и химическом воздействии

Обобщение результатов исследований показало, что комбинированное воздействие г-облучения в суммарной дозе 350 сГр (Dэф = 70 сГр) и смеси химических веществ в низких концентрациях по выраженности цитологических и цитогенетических повреждений костного мозга, угнетения митотических процессов в селезенке и увеличения сроков регенеративных процессов в органе, а также выраженности напряженности компенсаторных механизмов антиоксидантной защиты в клетке в восстановительном периоде, свидетельствует о более значительном токсическом эффекте, при воздействии исследованных повреждающих факторов.

Длительное комбинированное фракционированное облучение животных с последующим воздействием смеси химических веществ в режимах, моделирующих условия среды при межпланетных полетах, сопровождается более значительным и длительным напряжением адаптационных процессов и перенапряжением регуляторных механизмов, по сравнению с эффектом изолированного действия факторов (рис. 2), что может приводить к снижению суммарного объема компенсаторных резервов организма и повышению риска неблагоприятных отдаленных последствий (Шафиркин А.В., Мухамедиева Л.Н., Татаркин С.В., Баранцева М.Ю., 2012).

Исходя из концепции эффекта синергического взаимодействия факторов (Петин В.Г. с соавт. 2009), увеличение цитогенетических нарушений, с одновременным уменьшением количества клеток костного мозга, способных к восстановлению, сохранение интенсивности антиоксидантной защиты в клетках системы крови мышей и формирование дополнительного эффекта повреждения в селезенке с морфологическими проявлениями «неполной регенерации» свидетельствуют о напряжении компенсаторных механизмов организма, сохраняющемся на 90-е сутки восстановительного периода, и являются следствием формирования дополнительного повреждения системы и синергического усиления эффекта комбинированного воздействии г-облучения в суммарной дозе (350 сГр (Dэф = 70сГр) и смеси химических веществ в низких концентрациях.

Таким образом, можно заключить, что комбинированное воздействие г-облучения в суммарной дозе (350 сГр (Dэф = 70сГр) и смеси химических веществ в низких концентрациях сопровождается формированием дополнительных по сравнению с изолированным действием эффективных повреждений системы кроветворения, сохраняющихся в восстановительном периоде, с уменьшением способности клеток костного мозга к восстановлению, морфологическими проявлениями «неполной регенерации» селезенки, сохранением интенсивности антиоксидантной защиты в клетках мышей, подавлением энергетических процессов в клетках, а также выраженной напряженностью адаптационных процессов и перенапряжением регуляторных механизмов, сохраняющимся в восстановительном периоде, что согласно работам Кустова В.В., Тиунова Л.А. (1975) и концепции Петина В.Г. с соавт. (1993, 2009) является следствием синергического взаимодействия факторов.

ВЫВОДЫ

1. Изолированное хроническое ингаляционное воздействие смеси химических веществ в концентрациях на уровне ПДКпка сопровождается повреждением хромосомного аппарата клеток костного мозга (2,75%), преимущественно по типу фрагментов (81,2%), снижением энергопродукции и восстановительного потенциала в эритроцитах, свидетельствуя об инициации мембраноповреждающего эффекта и напряжении компенсаторных возможностей организма. Токсичность воздействия смеси химических веществ подтверждается лейкопенией в периферической крови, нарастающей (р<0,001) по мере увеличения длительности воздействия.

2. Изолированное фракционное в течение 64 суток г-облучение мышей в дозе 350 сГр (Dэф = 70сГр) сопровождается депрессией гемопоэза с уменьшением (р<0,001) количества кариоцитов в костном мозге, увеличением числа клеток с аберрантными митозами (9,25%) и структурными поломками преимущественно в виде мостов (59,5%), активностью восстановительных процессов в эритроцитах и компенсаторном характере метаболических сдвигов.

3. Комбинированное г-облучение в суммарной дозе 350 сГр (Dэф = 70сГр) и воздействие смеси химических веществ в низких концентрациях оказывает ингибирующее действие на пролиферативную активность клеток селезенки мышей, уменьшает общее число клеток лимфоидного ряда (до 12,3 ± 0,9 против 23,7±2,5 в контроле), усиливает деструктивные процессы в ПАЛМ, уменьшает (до единичных) содержание эритроцитов и тромбоцитов в красной пульпе и плазмоцитов и плазмобластов в белой пульпе, что характеризует реакцию «клеточного опустошения» органа.

4. Комбинированное воздействие оказывает более выраженное повреждение костномозгового кроветворения экспериментальных мышей по сравнению с изолированным действием изученных факторов, что проявляется депрессией гемопоэза с увеличением количества аберрантных митозов в ядросодержащих клетках костного мозга, характерных для эффекта г-облучения и увеличением до 60,6% хромосомных аберраций по типу фрагментов, характерных для изолированного химического воздействия, свидетельствуя о снижении способности клеток к восстановлению.

5. Комбинированное воздействие ионизирующей радиации в суммарной дозе 350сГр (Dэф = 70сГр) и смеси химических веществ на уровне ПДКпка сопровождается дополнительно к изолированному действию факторов усилением эффектов повреждения органов кроветворения с угнетением пролиферативной активности и уменьшением способности клеток костного мозга к восстановлению генетического аппарата, морфологические проявления «неполной регенерации» селезенки, что характеризует синергический характер взаимодействия факторов.

6. Синергический характер взаимодействия факторов подтверждается увеличением числа аберрантных клеток в костном мозге мышей, обусловленным закреплением потенциально летальных (сублетальных) повреждений структуры ДНК клеток.

7. Адаптационные перестройки в системе кроветворения мышей при комбинированном последовательном длительном воздействии радиационного и химического факторов в режимах, моделирующих условиях среды при межпланетных полетах, сопровождается развитием активной адаптации с выраженным длительным напряжением регуляторных систем организма мышей, сохраняющимся в восстановительном периоде.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Показатели внутриклеточного метаболизма и состояния мембран эритроцитов, хромосомные аберрации в кариоцитах костного мозга при длительном сочетанном воздействии химического и радиационного факторов. «Современные проблемы гигиенической науки и медицины труда», Уфа, 2010, 22-23 сентября, с 270-274.

(в соавторстве с Баранцевой М.Ю., Шафиркиным А.В., Ивановой С.М., Ярлыковой Ю.В., Мухамедиевой Л.Н.).

2. Цитогенетические, цитологические и структурные изменения органов кроветворения при сочетанном воздействии на организм лабораторных животных химического и радиационного факторов низкой интенсивности. «Морфология», №4, 2010 г., с. 26. (в соавторстве с Баранцевой М.Ю., Мухамедиевой Л.Н., Ворожцовой С.В., Чава С.В., Оганесян М.В.).

3. Экспериментальное изучение характера адаптационных процессов в условиях длительного сочетанного действия химического загрязнения воздушной среды и облучения животных в режимах, характерных для длительных орбитальных космических полетов. Космический форум 2011, посвященный 50-летию полета в космос Ю.А. Гагарина. Россия, Москва, С.133-134 (в соавторстве с Баранцевой М.Ю., Шафиркиным А.В., Ивановой С.М., Мухамедиевой Л.Н.).