Характер накопления ростовых факторов в тканях глаза после введения криоконсервированных ядросодержащих клеток кордовой крови (КЯКККЧ)

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРАКТЕР НАКОПЛЕНИЯ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ В ТКАНЯХ ГЛАЗА ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК КОРДОВОЙ КРОВИ (КЯКККЧ)

Свидко Е.Н.^,

Рязанцев В.В.,

Бабийчук Л.А.,

Дёмин Ю.А.

Многие заболевания органа зрения человека, особенно хронические, характеризуются вовлечением в патологический процесс зоны лимба [8]. При этом наблюдается как снижение количества стволовых лимбальных клеток, способных к делению, так и изменение состояния микроокружения клеток лимба - специфических ростовых регуляторов, таких как фактор роста эпителия (EGF), трансформирующий ростовой фактор (TGF), различные нейротрофические ростовые факторы. В современной офтальмологии интенсивно развивается новое направление - клеточная терапия с применением ЯКККЧ [1, 9]. Все чаще для лечения многих патологий эффективно используется ЯКККЧ как источник гемопоэтических стволовых клеток, а также благодаря содержанию в ней большого количества биологически активных веществ и ростовых факторов [7, 10]. Одним из наиболее эффективных методов длительного хранения ЯКККЧ в полноценном состоянии является криоконсервирование [1, 4].

Традиционно используемым криопротектором является ДМСО, в данном случае с неизбежной примесью декстрана (в виде фармпрепарата полиглюкин). Однако, известно, что декстран имеет некоторые отрицательные качества. При его введении может возникать сенсибилизация и аллергические реакции. Известно, что декстран используют в качестве пролонгаторов в глазных каплях, так как полисахариды способны делать структуру препарата более вязкой, а значит дольше сохранятся на роговице. Вследствие этого препарат кЯКККЧ с декстраном трудно набрать в шприц, а выполнение инфильтрации роговицы требует определенных навыков. Также декстран вызывает отёк и утолщение роговицы. Это продлевает восстановительный период после введения. Полисахариды, и в частности декстран - хорошая среда для размножения бактерий. Потому повышается риск воспалительных заболеваний.

Цель работы -- оценить характер содержания ростовых факторов (TGF-в1 и BDNF) в зоне лимба у кролей с индукцией ЛНР после введения кЯКККЧ, криоконсервированных разными методами.

Экспериментальная работа была выполнена на кролях в возрасте 6 месяцев породы Шиншилла весом 2, 0-2, 5 кг (n=45). Для формирования экспериментальной ЛНР животным на область лимба выполняли аппликацию 0, 04% раствора митомицина-С (ММС) в течение 3-х минут [4]. Из эксперимента животных выводили под наркозом путем воздушной эмболии через ушную вену. Исследования проводились согласно «Общим этическим принципам экспериментов на животных» (29.09.01), которые согласовываются с положением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985).

Использовали препарат «Криоцелл-гемоклетки» после его размораживания, содержащий 5% ДМСО и 3, 6% декстрана (режим 1). В части экспериментов использовали такой же препарат, содержащий сниженное количество декстрана (не более 0, 4%), который при традиционном способе выделения ЯКККЧ из кордовой крови находится в среде замораживания в концентрации 3, 6% (режим 2) [2, 6]. В обоих случаях при криоконсервировании применяли 2-х этапный режим замораживания согласно методу [2, 6].

Введение кЯКККЧ проводили в зону лимба по 8 меридианам в объеме 0, 2 мл в концентрации 500тыс клеток в один глаз. Все кролики разделены на 3 группы: 1 - здоровые с введением кЯКККЧ, 2 - ЛНР с введением кЯКККЧ (режим криоконсервирования 2), 3 - ЛНР с введением кККК (режим криоконсервирования 1). Анализ проводимой терапии у кролей осуществляли на 1, 3, 7, 14 и 21 сутки.

Для исследования концентрации ростовых факторов готовили осветлённый гомогенат из роговицы кроля, освобожденный центрифугированием от измельченных остатков ткани и клеток. Для его получения брали 50 мг ткани роговицы глаза, измельчали в пробирке «Эппендорф» объёмом 1, 5 мл с помощью микро-гомогенизатора Поттера в физиологическом растворе на фосфатном буфере с рН 7, 4 с добавлением 1 мМоля ингибитора протеаз фенилметилсульфонилфлуорида. Соотношение ткань - раствор составляло 1:10. После получения гомогената его осветляли центрифугированием при 3000 g в течение 10 минут. Надосадок собирали в отдельную пробирку для дальнейшего измерения содержания BDNF и TGF-1b.

Для исследования концентрации ростовых факторов BDNF и TGF-1b использовали высокочувствительные тест-системы, в частности, для измерения TGF-1b тест-систему производства “DRG”, с чувствительностью 2 пг/мл, для измерения BDNF тест-систему “R&D Systems” Quantikine, с чувствительностью 20 пг/мл. Важным является использование нами тест-систем для измерения человеческих клеточных факторов роста, а не лабораторного животного, в данном случае кроля, так как при введении клеточного препарата в орган зрения использовали препарат из кордовой крови человека. Все измерения проводили согласно инструкции производителя, методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием полуавтоматического спектрофотометра для 96-луночных планшетов с вертикальным лучом StatFax 2400 (США). Из пробирки осветленного гомогената дозатором брали 0, 1 мл и переносили в лунки планшета, в котором в дальнейшем проводили реакцию связывания TGF-1b и BDNF с пришитыми на дне лунок антителами, специфически взаимодействующими по принципу антиген-антитело. В дальнейшем проводили добавление вторичных антител и запускали ферментативную реакцию, которая давала окрашенный продукт. Измерение этого окрашенного продукта реакции проводили по данным предварительно настроенной калибровочной кривой.

Статистическую обработку полученных результатов проводили параметрическим методом с помощью t-критерия Стьюдента или непараметрическим методом Манна-Уитни.

После введения в зону лимба суспензии ЯКККЧ у кролей групп 2 и 3 наблюдали повышение содержания в ткани роговицы ростовых факторов BDNF, TGF-1b. по сравнению с контрольной группой 1 (табл. 1).

Таблица 1 - Содержание факторов роста в роговице кроликов после введения ЯКККЧ

Очевидно, что такое нарастание содержания ФР в первый период после размораживания и введения ЯКККЧ в роговицу связано с повышенной проницаемостью клеток, подвергнутых замораживанию. В дальнейшем, в срок наблюдения до 21 суток от момента введения в роговицу ЯКККЧ, степень нарастания концентрации ФР по сравнению с контрольной группой увеличивалась в 3 раза для BDNF и в 4 раза для TGF-1b.

Поскольку, нами отмечено присутствие ЯКККЧ в роговице в этот срок наблюдения, возможно по сравнению с контрольной группой наличие факторов роста в ткани глаза можно связать с ЯКККЧ. Исходя из полученных данных можно предположить, что введение ЯКККЧ независимо от метода криоконсервирования К1 или К2 способствуют поступлению ФК, необходимых для регенерации поврежденного лимба и роговицы. Очевидно, ЯКККЧ, введенные в зону лимба, поставляют биологически активные вещества (BDNF, TGF-1b), причем эффект более выражен при развитии такой патологии, как ЛНР. Характер накопления ФК в тканях роговицы не отличается при введении ЯКККЧ, криоконсервированных в режиме 1 (К1), так и в режиме 2 (К2). Количество биологически активных веществ, обнаруживаемых в зоне лимба в срок до 21 суток от момента введения повышается с увеличением времени пребывания ЯКККЧ в роговице у кролей, и существенно выше на 21-е сутки, чем у кролей с развитием ЛНР. Таким образом, снижение содержания декстрана в среде замораживания не приводит к существенному снижению жизнеспособности ККЧ после криоконсервирования по сравнению со стандартным методом получения и замораживания в среде с декстраном (К1).

Поддержание постоянства любой эпителиальной структуры, в том числе роговичного эпителия, обеспечивается популяцией СК, которые представляют собой уникальный источник регенерации клеток, как в физиологических условиях, так и при различных заболеваниях или травмах глаза [11]. В случае тотальной ЛНР необходима пересадка ауто- либо аллогенных СК. В настоящее время многие исследования направлены на выяснение механизмов регуляции процессов дифференцировки стволовых клеток. [12].

Можно предположить, что в этом случае происходит активация клеток эпителия роговицы и СК лимба вследствие влияния на них биологически активных веществ ЯКККЧ - BDNF и TGF-1в. Известно, что BDNF принадлежит к классу цитокинов, семейству ФР и подсемейству нейротрофинов и обладает выраженными нейрозащитными свойствами, угнетает клеточный апоптоз, препятствует гибели нейронов и cтимулирует рост холинергических нервных волокон [3]. При экспериментальной ЛНР происходит резкое снижение содержания BDNF во внутриглазных структурах, поэтому важна компенсация его содержания, которую способны обеспечить, по всей видимости, ЯКККЧ. TGF-1в оказывает множественные влияния на различные типы клеток и участвует в регуляции роста клеток, их дифференцировке и апоптозе, а также в модуляции ИС, способствует заживлению ран. Наиболее важной следует считать его участие в регенерации тканей. Установлено, что TGF-1в активирует хемотаксис воспалительных клеток и синтез экстрацеллюлярного матрикса [5].

Уже с первых суток после введения кЯКККЧ обеспечивают цитопротекцию и регенерацию клеток роговицы и лимба, в независимости от метода криоконсервирования, сохраняют свою целостность и после введения в орган зрения имеют нарастающий характер нарабатывания BDNF, TGF-1b, с постепенным возрастанием их концентрации до 21-х суток. Повышение секреции ростовых факторов после введения кЯКККЧ животным в экспериментальной модели ЛНР ускоряют процессы регенерации клеток лимба, эпителия и стромы роговицы. Полученные результаты экспериментального исследования позволяют рекомендовать применение кЯКККЧ в широкой офтальмологической практике при лечении ЛНР.

криоконсервированный ядросодержащий кордовый кровь

Литература

1. Абдулкадыров К.М. Заготовка плацентарной крови. Особенности ее клеточного состава и гемопоэтического потенциала / К.М. Абдулкадыров, Н.А. Романенко // Трансфузиология.- 2003.- Т.4, №1.- С. 44-46.

2. Бабийчук Л.А., Грищенко В.И., Зубов П.М., Зубова О.Л., Рязанцев В.В., Бабийчук Л.В., Кудокоцева О.В., Любчич С.А. Структурно-функциональное состояние и жизнеспособность ядросодержащих клеток пуповинной крови после криоконсервирования // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.- 2010. - №3. - C. 77-81

3. Головко А.И.. Нейротрофические факторы головного мозга. Нейрохимические и наркологические аспекты. // Нейрохимия.- 2008.- Т.25.-№4.- C. 261-271

4. Милюдин Е.С. Экспериментальная модель недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия. Вестник СамГУ - Естественнонаучная серия. 2006. №9 (49). - С. 219 - 226

5. Никитин Н.А, , Ш.Р. Кузбеков. Роль TGFв в офтальмологии.// Цитокины и воспаление.- 2009. Т. 8.- № 1. - С. 3-9

6. Пат. 92227 Україна, МПК А 01 N 1/02. Спосіб кріоконсервування ядровмісних клггин кордової крові, у тому числі стовбурових гемопоетичних клігин / Л.О. Бабійчук, В.І. Грищенко, Т.М. Гуріна та iн.; заявник та патентовласник Інститут проблем кріобюлогн i кріомедицини НАН України. - №200814009; заявл. 05.12.2008; опубл. 11.10.2010, Бюл.№19, 2010.

7. Broxmeyer H.E, Kurtzberg J., Gluckman E. et al. Umbilical cord blood hematopoietic stem and repopulation cells in human clinical transplantation// Criobiology.- 1995.-Vol.32, №6.- P. 511-515

8. Dua HS, Azuara-Blanco A. Limbal stem cells of the corneal epithelium.Surv Ophthalmol.2000 - №44(5) - P. 415-425.

9. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation// Experimental hematology.- 2000.-Vol.28.-Pt.11.-P.1197-1205

10. Tseng SCG.Concept and application of limbal stem cells // Eye. - 1989.--№57 - P. 201-209.

11. Lavker, R. Corneal epithelial stem cells at the limbus: looking at some old problems from a new angle // Experimental eye research. - 2004. - Vol. 78.- P. 433-446.

12. Miri A, Al-Deiri B, Dua HS. Long-term outcomes of autolimbal and allolimbal transplants.Ophthalmology. - 2010. - №117(6). - P. 1207-1213.

Размещено на Allbest.ru