Продукция цитокинов и активность фагоцитирующих клеток цельной крови у военнослужащих по призыву с внебольничной пневмонией и их коррекция в эксперименте

Размещено на http://www.allbest.ru/

Тульский государственный университет

ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ И АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ У ВОЕННОСЛУЖАЩИХ ПО ПРИЗЫВУ С ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИЕЙ И ИХ КОРРЕКЦИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Бондарь С.С.

Аннотация

В исследовании обсуждается состояние иммунной регуляции и способы ее коррекции у военнослужащих по призыву, больных внебольничной пневмонией в стадию реконвалесценции. У обследованных больных, в сравнении со здоровыми лицами, выявлено повышение сывороточной концентрации ИЛ-2 в 6,3 раза (р=0,0035), ИЛ-10 на 31,5% (р=0,047), ИФН-г - в 4,5 раза (р=0,011). Митоген-стимулированная продукция цитокинов клетками цельной крови реконвалесцентов ВП, в сравнении со здоровыми лицами, характеризовалась увеличением уровня ИЛ-1в в 1,5 раза (р=0,047), ИФН-г - в 1,4 раза (р=0,048), ИЛ-8 на 32,6% (р=0,018), снижением продукции ИЛ-10 на 38,4% (р=0,047), РАИЛ-1 на 30% (р=0,034) и ИЛ-2 на 2,1% (р=0,37).На этом фоне, в сравнении со здоровыми лицами, отмечалось снижение фагоцитарного индекса на 15,7% (р=0,048), фагоцитарного числа - на 18,7 % (р = 0,043). Микроволновое излучение частотой 1ГГц сопровождается нормализацией активности фагоцитов цельной крови на фоне снижения продукции клетками ИЛ-10 и повышения ИЛ-2. В отношении стимулированных клеток цельной крови, микроволны способствуют повышению продукции ИЛ-10 и снижению - ИЛ-2.

Ключевые слова: пневмония, цитокины, микроволны, ИЛ-1, ИЛ-10.

Annotation

Bondar S.S.

THE PRODUCTION OF CYTOKINES AND THE ACTIVITY OF PHAGOCYTIC CELLS IN WHOLE BLOOD IN MILITARY MEN ON AN APPEAL FOR COMMUNITY-ACQUIRED PNEUMONIA AND THEIR CORRECTION IN THE EXPERIMENT

The study discusses the state of the immune regulation and the ways of its correction in military, patients with community-acquired pneumonia in the stage of convalescence. In examined patients in comparison with healthy individuals revealed increased spontaneous production by whole blood cells interleukins IL-2, IL-10, IFN-г. In convalescents also revealed a significant increase in mitogen-stimulated production of cytokines and reduced phagocytic function of the cells.

Microwave radiation at a frequency of 1 GHz accompanied by a normalization of activity of phagocytes of whole blood with the decline of cells to produce IL-10 and enhancing IL-2. In relation to stimulated cells in whole blood, the microwaves increase the production of IL-10 and decrease IL-2.

Keywords: pneumonia, cytokines, microwave, IL-1, IL-10.

Введение

Внебольничная пневмония (ВП) является актуальной проблемой военной и экстремальной медицины, важность которой определяется с одной стороны высокой заболеваемостью, связанной с воздействие на организм экстремальных физических факторов - переохлаждения, перегрузок, психологических стрессов, а с другой - высокой вероятностью неблагоприятного клинического исхода, несмотря на использование новых антибиотиков [1, 18].

В формировании исходов заболевания, важное значение играет состояние клеточной реактивности, на фоне которой развивается заболевание, в частности, продукции клетками информационных молекул, опосредующих межклеточные взаимодействия - цитокинов [2, 19, 20]. При этом, сниженная клеточная реактивность, впрочем, как и повышенная, определяет атипичное и затяжное течение заболевания [3]. В этих случаях одним из путей улучшения исходов ВП является восстановление реактивности иммунокомпетентных клеток с обеспечением баланса активирующих и тормозящих влияний на эффекторные и регуляторные звенья иммунной системы [4, 5].

В последнее время в литературе появились сообщения о биологическом действии низкоинтенсивного резонансного микроволнового излучения частотой 1 ГГц, способного регулировать внутриклеточные молекулярные процессы, за счет изменения степени фосфорилирования ключевых внутриклеточных факторов - протеинкиназ [6, 7, 8].

Учитывая необходимость дальнейшего совершенствования лечебной тактики у пациентов с ВП, в частности, внедрения в клинику технологий модуляции активности иммунокомпетентных клеток, представляется актуальным исследование цитокин-продуцирующей и фагоцитарной функции клеток цельной крови у пациентов с ВП и возможности использования микроволн низкой интенсивности для их модуляции.

Целью исследования являлось изучение уровня цитокинов в сыворотке цельной крови у больных ВП и оценка биологических эффектов микроволнового излучения частотой 1 ГГц на цитокин-продуцирующую функцию и активность фагоцитоза клеток цельной крови у больных ВП.

Материалы и методы исследования

внебольничный пневмония цитокин микроволновый

Материалом исследования служили образцы венозной крови 30 курсантов мужского пола в возрасте 18-23 лет из числа лиц, проходящих военную службу в Региональном учебном центре боевой подготовки ракетных войск и артиллерии (г. Саратов), находившихся на лечении в пульмонологическом отделении госпиталя с ВП нетяжелого течения. Группа контроля состояла из 30 здоровых доноров крови, сопоставимых по полу и возрасту основной группе.

Критериями включения пациентов в исследования являлось: рентгенологически подтвержденная характерная пневмоническая инфильтрация в пределах 1-2 сегментов одной доли легкого, поступление больных в стационар не позднее 3-х суток от начала заболевания. Критерием исключения являлось обострение хронической сопутствующей патологии, дефицит массы тела. Кровь для исследования забиралась на 17-21 сутки заболевания при условии нормализации клинико-лабораторных показателей (нормализация температуры тела, биохимических показателей, гемограммы).

Исследование проводили с использованием наборов для культивирования клеток цельной крови «Цитокин-Стимул-Бест» (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск) в условиях спонтанной и стимулированной их активности. В состав наборов входят флаконы со стерильной питательной средой DMEM, содержащая гепарин 2,5 Ед/мл, и гентамицин 100 мкг/мл, а так же флаконы со стерильным комплексным лиофилизированным митогеном, содержащим фитогемагглютинин (4 мкг), конканавалин А (4 мкг) и липополисахарид (2 мкг).

В проведенном исследовании оценивалась продукция клетками цельной крови интерлейкинов (ИЛ): ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-10, рецепторного антагониста интерлейкина-1 (РАИЛ-1) и интерферона-гамма (ИФН-г). Оценка фагоцитарной функции клеток цельной крови проводилась с использованием наборов Phagotest (Glycotope Biotechnology, США) путем определения фагоцитарного числа (ФЧ) и фагоцитарного индекса (ФИ).

В качестве источника электромагнитного излучения был использован серийно выпускаемый аппарат физиотерапии «Акватон 02» (регистрационное удостоверение № ФСР 2011/10939) [9-11].

При проведении исследования были сформированы 3 группы. 1-я группа (1) включала образцы цельной крови, больных ВП, приготовленные путем внесения 1 мл цельной венозной крови пациента во флакон, содержащий 4 мл среды DMEM, в которой исследовалась спонтанная клеточная активность (продукция цитокинов). 2-я группа формировалась путем внесения 1 мл разбавленной крови пациентов ВП средой DMEM, во флакон, содержащий митоген. 3-я группа - включала образцы крови практически здоровых лиц, разбавленная средой DMEM. В каждой группе исследовалась спонтанная и стимулированная излучением продукция цитокинов.

Мощность облучения образцов крови составляла 20 нВт/см², при этом экспозиция облучения составила 45 минут с последующей 24-ти часовой инкубацией при 37 ⁰С. По окончании инкубации клетки осаждались центрифугированием (3000 G) в течение 10 минут, с отбором супернатанта для проведения анализа. Анализ проводился на автоматическом иммуноферментном анализаторе Personal LAB (Adaltis Italia S.p.A., Италия) с использованием реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Статистическая обработка проводилась с помощью программы Statistica 7.0. В процессе исследования рассчитывалось среднее значение (х), медиана (Ме), 25 и 75 процентили выборки (25%; 75%). Для сравнения средних значений в группах с повторными измерениями использовали критерий Вилкоксона, для остальных сравнений - Н-тест Краскела-Уоллеса.

Результаты исследования

В таб.1 представлены результаты оценки продукции цитокинов клетками цельной крови в группах.

Таблица 1

Содержание цитокинов в группах (пг/мл)

Анализ результатов исследования выявил сохранение у реконвалесцентов ВП высокой продукции клетками ИЛ-2, ИЛ-10 и ИФН-г, несмотря на нормализацию клинико-лабораторных показателей и разрешение инфильтративных изменений в легких. При этом продукция ИЛ-2 превышала контрольную в 6,3 раза (р=0,0035), ИЛ-10 на 31,5% (р=0,047), ИФН-г - в 4,5 раза (р=0,011). Таким образом, реконвалесценция ВП сопровождается сохранением активации клеточного звена иммунитета.

На этом фоне облучение сопровождалось ростом спонтанной продукции ИЛ-2 на 26,2% (р=0,042), ИЛ-8 на 18,9% (р=0,047), а так же снижением продукции ИЛ-10 на 14,7% (р=0,052) и РАИЛ-1 на 5,5% (р=0,19). При этом облучение сопровождалось более сильным ограничением максимальных значений продукции ИЛ-10, в виде снижения концентрации цитокинов, находящейся в диапазоне 4-го квартиля, практически не изменяя уровень ИЛ-10, находящийся в диапазоне 1-го квартиля.

Особенности митоген-стимулированной продукции цитокинов у реконвалесцентов ВП заключаются в увеличении продукции ИЛ-1в сверх уровня контрольной группы в 1,5 раза (р=0,047), ИФН-г - в 1,4 раза (р=0,048), ИЛ-8 на 32,6% (р=0,018), а так же снижении продукции ИЛ-10 на 38,4% (р=0,047), ИЛ-2 на 2,1% (р=0,37), РАИЛ-1 на 30% (р=0,034).

Таким образом, у реконвалесцентов ВП имеет место нарушение реактивности клеток цельной крови, с тенденцией к ослаблению противовоспалительных влияний и усилением продукции цитокинов острой фазы.

Проводимое на этом фоне облучение сопровождалось увеличением продукции ИЛ-10 на 51,5% (р=0,039), а ИФН-г на 12,7% (р=0,047) достигающих значений здоровых лиц. Прирост митоген-стимулированной продукции РАИЛ-1 под влиянием облучения составил 3,7% (р=0,32), ИЛ-1в - 8,9% (р=0,18), при снижении продукции ИЛ-8 на 5,3% (р=0,29).

Анализ фагоцитарной функции мононуклеаров выявил снижение активности фагоцитоза, как у здоровых лиц, так и у реконвалесцентов (таб.2).

Таблица 2

активность фагоцитоза в группах

При должных значениях ФИ у здоровых лиц - 95%, в контрольной группе отмечено снижение данного показателя на 14,7%, в основной группе на 26,3% [12]. При этом ФИ в основной группе на 15,7% (р=0,048) был ниже, чем в группе контроля, а ФЧ - на 18,7 % (р = 0,043).

Под влиянием облучения отмечалось повышение показателей, как у здоровых лиц, так и больных ВП. Так, в группе контроля прирост ФЧ составил 98,1% (р=0,01), в основной группе - 133% (р=0,0006). Соответствующее повышение ФИ у здоровых и больных ВП составило 13,9% (р=0,02) и 37,9% (р=0,005) соответственно.

Обсуждение результатов

Анализ полученных результатов свидетельствует о низкой спонтанной продукции у реконвалесцентов ИЛ-1в, соответствующей здоровым лицам, сочетающейся с повышенным уровнем ИЛ-10. Принимая за 100% реактивность клеток, находящихся в условиях митогенной стимуляции, можно говорить об исходно низкой спонтанной активности клеток цельной крови, в отношении ряда цитокинов. Так, спонтанная реактивность клеток в отношении продукции ИЛ-1в составляет 0,98%, а ИЛ-8 0,36% от стимулированной митогеном (принимаемой за 100%). Уровень спонтанной продукции ИЛ-10, при этом, составлял 16,4% от максимального.

Анализ биологического действия микроволн на спонтанную активность клеток цельной крови при ВП свидетельствует о повышении продукции ИЛ-1в, с 0,98% до 2% от потенциально возможного.

Как известно, воздействие на клетку митогенов, а так же бактериальных компонентов, как известно, резко повышает реактивность клетки, вплоть до максимально возможного уровня. Такие условия в организме возникают, например, при мощной бактериальной инвазии. В этих условиях однократное кратковременное воздействие на клетки микроволн способствует ограничению максимальной продукции ИЛ-1в (с 4670,5 пг/мл до 2781,0 пг/мл), составляющего 70% при облучении, оказывая нормализующее влияние на реактивность.

Принимая во внимание тот факт, что эффекты микроволн модифицируют продукцию клетками таких цитокинов, как ИФН-г и ИЛ-10, а так же учитывая зависимость биологических эффектов от исходного функционального состояния клеток, очевидно, что одной из точек приложения рассматриваемого физиотерапевтического фактора является JAK-STAT-сигнальный путь, и, в частности, протеинкиназа JAK1 и транскрипционный фактор STAT1, активируемые семейством gp-130 цитокинов (ИЛ-10, ИФН-г и др.) [13, 14].

Влияние облучения на продукцию ИЛ-1в, возможно, обусловлено модификацией функциональной активности сигнальных путей, включающих в себя мембранные толл-подобные, либо внутриклеточные NLR рецепторы [15-17].

При этом оценка эффектов излучения, в частности, характер изменений митоген-стимулированной продукции цитокинов, позволяет говорить о том, что микроволны проявляют самостоятельное модулирующее влияние на функционирование МАРК/SAPK-сигнального пути [21].

Выводы

1. У реконвалесцентов ВП, в сравнении со здоровыми лицами, отмечается повышенная в 6,3 раза (р=0,0035) продукция ИЛ-2, в 4,5 раза (р=0,011) - ИФН-г, на 31,5% (р=0,047) - ИЛ-10. У реконвалесцентов имеет место повышенная реактивность клеток, в частности, усиление в сравнении с контролем митоген-стимулированой продукции ИЛ-1в в 1,5 раза (р=0,047), ИФН-г - в 1,4 раза (р=0,048), ИЛ-8 на 32,6% (р=0,018), сочетающееся со снижением стимулированной продукции ИЛ-10 на 38,4% (р=0,047), РАИЛ-1 на 30% (р=0,034) и ИЛ-2 на 2,1% (р=0,37).

2. Выявленные особенности реактивности клеток реконвалесцентов ВП ассоциированы со снижением фагоцитарного индекса на 15,7% (р=0,048). Таким образом, на фоне нормализации клинико-лабораторных показателей у пациентов, перенесших ВП сохраняются проявления иммунной дезрегуляции.

3. Воздействие резонансных микроволн клетки цельной крови реконвалесцентов ВП сопровождалось ростом спонтанной продукции ИЛ-2 на 26,2% (р=0,042), снижением продукции ИЛ-10 на 14,7% (р=0,052). Митоген-стимулированная продукция ИЛ-10 под влиянием облучения возрастала на 51,5% (р=0,039), продукция ИФН-г на 12,7% (р=0,047), продукции РАИЛ-1 возрастала на 3,7% (р=0,32), ИЛ-1в - 8,9% (р=0,18). Облучение способствовало снижению продукции ИЛ-8 на 5,3% (р=0,29).

4. Облучение цельной крови сопровождается активацией и нормализацией исходно сниженной фагоцитарной функции клеток цельной крови, что указывает на нормализацию клеточной реактивности под влиянием резонансных микроволн частотой 1 ГГц.

Литература

1. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С., Тюрин И.Е., Рачина С.А. Внебольничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике. М., 2010. 106 с.

2. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2008. 552 с.

3. Лебедева М.Н., Грищенко А.В. Особенности течения повторных внебольничных пневмоний у военнослужащих по призыву // Военно-медицинский журнал. Т. 330. № 7. С. 24 - 28.

4. Роль молекулярно-волновых процессов в природе и их использование для контроля и коррекции состояния экологических систем / В.И. Петросян, Н.И. Синицын, В.А. Ёлкин и др. // Биомедицинская радиоэлектроника. 2001. №5-6. С. 62-129.

5. Системные подходы в биологии и медицине (системный анализ, управление и обработка информации) / В.И. Стародубов и др. под ред. А.А. Хадарцева, В.М. Еськова, А.А. Яшина, К.М. Козырева. Тула: ООО РИФ «ИНФРА», 2008. 372 с.

6. Бецкий О.В. Пионерские работы по миллиметровой электромагнитной биологии, выполненные в ИРЭ РАН // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. 2003. №8. С. 11-20.

7. Петросян В.И. Резонансное излучение воды в радиодиапазоне // Письма в ЖТФ. Т.31, вып. 23. С. 29-33.

8. Молекулярные механизмы иммунореабилитации при использовании низкоинтенсивного СВЧ-излучения / И.В.Терехов, В.И.Петросян, Б.Л.Дягилев и др. // Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2011. Т.1. № 5. С. 34-37.

9. Исследование возможности использования нетеплового СВЧ-излучения в реабилитационном периоде у больных внебольничной пневмонией / И.В. Терехов, К.А. Солодухин, В.С. Никифоров // Физиотерапевт. 2011. №4. С. 12-17.

10. Способ терапевтического воздействия на биологические объекты электромагнитными волнами и устройство для его осуществления: пат. 2445134 Рос. Федерация: МПК: A61N500, A61N502/ Власкин С.В., Терехов И.В., Петросян В.И., Дягилев Б.Л., Дубовицкий С.А., Киричук В.Ф., Семиволос А.М. № 2010138921/14; заявл. 21.09.2010; опубл. 20.03.2012, Бюл. № 8. 20 с.: ил.

11. Влияние низкоинтенсивного СВЧ-облучения на внутриклеточные процессы в мононуклеарах при пневмонии / И.В. Терехов, К.А. Солодухин, В.С. Никифоров и др. // Медицинская иммунология. 2012. Т.14. №6. С. 541-544.

12. Мазуров Д.В., Дамбаева С. В., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного Киллинга фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии // Иммунология. №2. С. 7-5.

13. Особенности биологического действия низкоинтенсивного СВЧ-излучения на состояние противовирусной защиты клеток цельной крови при внебольничной пневмонии и у здоровых лиц / И.В. Терехов, С.С. Бондарь // Вестник новых медицинских технологий. 2015. Т. 22. № 2. С. 55-60.

14. Особенности биологического эффекта низкоинтенсивного СВЧ-облучения в условиях антигенной стимуляции мононуклеаров цельной крови / И.В. Терехов, К.А. Солодухин, В.С. Никифоров и др. // Физиотерапевт. №1. С. 26-32.

15. Особенности биологического действия низкоинтенсивного СВЧ-излучения на продукцию цитокинов клетками цельной крови при внебольничной пневмонии / И.В. Терехов, К.А. Солодухин, В.О. Ицкович и др. // Цитокины и воспаление. 2012. Т.11. №4. С. 67-72.

16. Функциональное состояние клеток цельной крови при внебольничной пневмонии и его коррекция СВЧ-излучением / И.В. Терехов, А.А. Хадарцев, В.С. Никифоров и др. // Фундаментальные исследования. 2014. №10 (4). С. 737-741.

17. Продукция цитокинов клетками цельной крови реконвалесцентов внебольничной пневмонии под влиянием низкоинтенсивного СВЧ-облучения / И.В. Терехов, А.А. Хадарцев, В.С. Никифоров В.С. и др. // Вестник новых медицинских технологий. [Электронный ресурс]. 2014. № 1. Публикация 2-57. Режим доступа: http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2014-1/4815.pdf. doi: 10.12737/5025.

18. Capelastegui A., Espaтa P.P., Bilbao A., Gamazo J., Medel F., Salgado J. et al., on behalf of Poblational Study of Pneumonia (PSoP) Group. Study of communityacquired pneumonia: incidence, patterns of care, and outcomes in primary and hospital care. J. Infect. 2010; 61: 364.

19. Kellum J.A., Kong L., Fink M.P. et al. Understanding the inflammatory cytokine response in pneumonia and sepsis. Arch. Intern. Med. 2007; 167: 1655.

20. Calbo E., Alsina M., Rodrнguez Carballeira M., Lite J., Garau J. The impact of time on the systemic inflammatory response in pneumococcal pneumonia. Eur. Respir. J. 2010; 35: 614-618.

21. Pearson G., Robinson F., Beers Gibson T., Xu B.E., Karandikar M., Berman K., Cobb M.H. Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions. Endocrine Reviews 2001; 22 (2): 153-83. doi:10.1210/er.22.2.153.

Размещено на Allbest.ru