Размещено на http://www.allbest.ru/

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Эндотелио- и кардиопротективные эффекты сочетанного применения ингибитора аргиназы L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" (экспериментальное исследование)

Бабко Анна Владимировна

Белгород - 2011

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Шапошников Андрей Александрович

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Резников Константин Михайлович

Ведущая организация: ОАО "Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ" (ВНЦ БАВ)

Защита состоится 22 декабря 2011 г. в 13.00 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.015.13 при Белгородском государственном национальном исследовательском университете по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85, корп. 17, зал диссертационных советов.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор биологических наук В.И. Кочкаров

Список сокращений

АГ - артериальная гипертензия

АД - артериальное давление

АХ - ацетилхолин

ДАД - диастолическое артериальное давление

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ЛЖД - левожелудочковое давление

НП - нитропруссид натрия

САД - систолическое артериальное давление

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭД - эндотелиальная дисфункция

eNOS - эндотелиальная синтетаза оксида азота

L-NAME - N-нитро-L-аргинин метиловый эфир

NO - оксид азота

+dp/dt - максимальная скорость увеличения левожелудочкового давления

- dp/dt - максимальная скорость снижения левожелудочкового давления

Статистические показатели

р - уровень статистической значимости

* - достоверность различий, p<0,05

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Изучение роли эндотелия в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний привело к пониманию концепции о нем как о мишени для профилактики и лечения данных патологий.

Эндотелиальная дисфункция (ЭД) рассматривается как предиктор целого ряда заболеваний, в том числе артериальной гипертензии (АГ), ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, а также патогенетическим компонентом органных повреждений при сахарном диабете, гипоэстрогенных и других состояниях.

Этому способствуют такие модифицируемые факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний, как курение, гипокинезия, солевая нагрузка, различные интоксикации, нарушения углеводного, липидного, белкового обменов, инфекция и др. артериальный гипертензия ишемический

При этих заболеваниях эндотелий сосудов предстает в роли первоочередного органа-мишени, поскольку участвует в регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, миграции клеток крови в сосудистую стенку, синтезе факторов воспаления и их ингибиторов, осуществляет барьерные функции.

Среди изобилия биологически активных веществ, вырабатываемых эндотелием, важнейшим является оксид азота - NO. Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка NO с помощью эндотелиальной NO-синтетазы (eNOS) из L-аргинина. Это необходимо для поддержания нормального базального тонуса сосудов. В то же время, NO обладает ангиопротективными свойствами, подавляя пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов и моноцитов, и предотвращая тем самым патологическую перестройку сосудистой стенки (ремоделирование), прогрессирование атеросклероза.

ЭД проявляется снижением образования и биодоступности NO, при одновременном повышении уровня супероксид-аниона и продукции мощных вазоконстрикторов, что приводит к дисбалансу медиаторов, обеспечивающих в норме эндотелийзависимые процессы.

В свою очередь, оценка ЭД как основного патогенетического звена сердечно-сосудистых заболеваний, требует пересмотра терапевтических стратегий с целью профилактики или уменьшения повреждений сосудистой стенки.

В то же время, в современной фармакологии и клинической практике отсутствуют препараты целенаправленного эндотелиопротективного действия, а в большинстве случаев используются эндотелиотропные эффекты препаратов основных групп: ингибиторов АПФ, антагонистов кальция, бета-адреноблокаторов, статинов и др.

В рамках развиваемой в последние годы в нашей лаборатории таргетной стратегии воздействия на систему "L-аргинин-eNOS" исследованы эндотелиопротективные эффекты донаторов NO (Покровский М.В., Корокина Л.В, 2004), предотвращение ингибирующего воздействия асимметричного диметиларгинина (АДМА) (Покровская Т.Г. и соавт., 2007, 2009), предотвращение "разобщения eNOS" антиоксидантами (Покровский М.В., Даниленко Л.М., 2007), тетрагидробиоптерином, фолатами и др. (Корокин М.В., Покровский М.В. и соавт., 2010), активация eNOS резвератролом (Кочкаров В.И., Покровский М.В., 2009) и т.д.

Представляется, что пути фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции могут быть существенно дополнены за счет использования ингибиторов аргиназ.

Как известно, аргиназа является центральным ферментом цикла образования мочевины, который подвергает гидролизу L-аргинин (до мочевины и L-орнитина). Последние исследования обнаружили аргиназу в сосудистой стенке и установили ее участие в процессе регуляции синтеза NO и развитии сердечно-сосудистой патологии. Аргиназа ингибирует процесс производства NO посредством нескольких потенциальных механизмов, включающих:

- конкуренцию/антагонизм с eNOS в отношении субстрата L-аргинина;

- разрыв (uncoupling) eNOS, приводящий к генерации скевинжера NO - супероксида и пероксинитрита;

- подавление трансляции и стабильности белка индуцибильной iNOS;

- ингибирование активности iNOS посредством генерации мочевины;

- сенсибилизации eNOS к ее эндогенному ингибитору - асимметричному диметиларгинину (АДМА).

Повышенная активность аргиназы ингибирует опосредованный еNOS синтез NO. Это может способствовать развитию и усугублению эндотелиальной дисфункции при гипертензии, старении, ишемии/реперфузии и диабете. Кроме того, аргиназа изменяет направление метаболизма L-аргинина на L-орнитин, а также на образование полиаминов и L-пролина, являющихся важными для роста гладкомышечных клеток и синтеза коллагена, следовательно, индуцирование аргиназы может вызывать аберрантное ремоделирование стенок сосудов и образование неоинтимы.

Таким образом, в научно-фундаментальном аспекте аргиназа может рассматриваться как новая многообещающая "фармакологическая мишень", ингибирование которой вероятно окажется эффективным способом коррекции эндотелиальной дисфункции и профилактики и лечения ассоциированных с ней заболеваний.

Цель исследования: провести комплексное изучение эндотелио- и кардиопротективного действия ингибитора аргиназы L-норвалина, препарата "Блоктран ГТ" (50 мг лозартана калия + 12,5 мг гидрохлоротиазида) и сочетанного применения L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" при моделировании L-NAME- и гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

Задачи исследования:

1. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность монотерапии L-норвалином при моделировании L-NAME-индуцированной ЭД в эксперименте с использованием функциональных проб и биохимических маркеров.

2. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность комбинированного препарата "Блоктран ГТ" (50 мг лозартана калия + 12,5 мг гидрохлоротиазида) и его компонентов при моделировании L-NAME-индуцированной ЭД.

3. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" при моделировании L-NAME-индуцированной ЭД.

4. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность монотерапии L-норвалином при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной ЭД в эксперименте с использованием функциональных проб и биохимических маркеров.

5. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность комбинированного препарата "Блоктран ГТ" (50 мг лозартана калия + 12,5 мг гидрохлоротиазида) и его компонентов при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

6. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

7. Провести интегральный векторный анализ для комплексной оценки функциональных характеристик сосудистой реактивности, нитроксидергической системы, показателей сократимости миокарда с последующим расчетом вероятностного процента эндотелиопротекции на модели гипергомоцистеин-индуцированного дефицита оксида азота в сочетании L-норвалин + "Блоктран ГТ".

Научная новизна исследования. В работе впервые показано, что ингибитор аргиназы L-норвалин 10 мг/кг оказывает эндотелиопротективное действие на модели L-NAME- и гипергомоцистеин-индуцированного дефицита NO при однократном внутрижелудочном введении в течение 7 суток. Препарат "Блоктран ГТ" (50 мг лозартана калия + 12,5 мг гидрохлоротиазида) также обладает эндотелиопротективными эффектами на выбранных моделях патологии. Сочетанное использование ингибитора аргиназы L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" показало положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в максимальном приближении исследуемых показателей функции сосудистого эндотелия к таковым показателям интактных животных.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность сочетанного применения ингибитора аргиназы L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" для коррекции L-NAME- и гипергомоцистеин-индуцированной ЭД в эксперименте. Показано, что их совместное использование позволяет улучшать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид натрия (эндотелийнезависимая вазодилатация) с уменьшением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), который в 5 раз увеличивается при L-NAME-индуцированной ЭД и в 3 раза при гипергомоцистеин-индуцированной ЭД, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Тоtal NO, концентрация гомоцистеина).

Проведены целенаправленные доклинические исследования эндотелиопротективных эффектов препарата "Блоктран ГТ" (производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства", г. Курск) при ЭД.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания L-норвалина, препарата "Блоктран ГТ", а также сочетанного применения L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ".

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения антигипертензивной и эндотелиопротективной активности препарата "Блоктран ГТ" производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства" (г. Курск) используются в лекционных курсах кафедры фармакологии ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России, кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ФГАОУ ВПО "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" и кафедры фармакологии, клинической фармакологии и фармации медицинского института ФГБОУ ВПО "Орловский государственный университет".

Личный вклад автора. Автором проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, проведены серии экспериментов, получены и обобщены результаты исследования, проведена статистическая обработка и анализ полученных данных.

В публикациях № 1, 2 автором лично проведено моделирование дизайна исследования, в публикации № 3 - научное обоснование и обобщение полученных результатов, № 4 - статистическая обработка полученных результатов.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России в 2010-2011гг., ФГАОУ ВПО "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" в 2011 г., ГБОУ ВПО ВолГМУ Минздравсоцразвития России в 2011 г. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, анатомии человека, инфекционных болезней и эпидемиологии, НИИ Экологической медицины ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России, фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ФГАОУ ВПО "Белгородский государственный национальный исследовательский университет". По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 работы в журналах, рекомендуемых ВАК для диссертационных работ.

Положения, выносимые на защиту

1. Лозартан калия (8 мг/кг), гидрохлоротиазид (2 мг/кг), "Блоктран ГТ" (лозартан калия 8 мг/кг + гидрохлоротиазид 2 мг/кг) однократно в течение 7 суток внутрижелудочно оказывают эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной ЭД.

2. L-норвалин (10 мг/кг), сочетанное использование L-норвалина (10 мг/кг) и препарата "Блоктран ГТ" (лозартан калия 8 мг/кг + гидрохлоротиазид 2 мг/кг) однократно в течение 7 суток внутрижелудочно оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной ЭД.

3. Лозартан калия (8 мг/кг), "Блоктран ГТ" (лозартан калия 8 мг/кг + гидрохлоротиазид 2 мг/кг) однократно в течение 7 суток внутрижелудочно оказывают эндотелио- и кардиопротективное действие на модели гипергомоцистеин-индуцированной ЭД. Гидрохлоротиазид (2 мг/кг) обладает умеренным эндотелио- и кардиопротективным действием на модели гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

4. L-норвалин (10 мг/кг), сочетанное использование L-норвалина (10 мг/кг) и препарата "Блоктран ГТ" (лозартан калия 8 мг/кг + гидрохлоротиазид 2 мг/кг) однократно в течение 7 суток внутрижелудочно оказывают выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 206 источников, из них 87 отечественных и 119 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 21, рисунков - 26, схем - 4.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Моделирование L-NAME-индуцированной ЭД и ее коррекцию исследуемыми препаратами осуществляли на семи группах (n=10) самцов белых крыс линии Wistar массой 230-270 г. Блокатор eNOS N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно, внутрибрюшинно, один раз в сутки, в течение семи дней, в дозе 25 мг/кг. Интактным животным ежедневно, один раз в сутки, в течение семи дней внутрижелудочно вводили 1% крахмальный раствор в дозе 10 мл/кг.

Моделирование гипергомоцистеин-индуцированной ЭД и ее коррекцию исследуемыми препаратами осуществляли на семи группах (n=10) самцов белых крыс линии Wistar массой 230-270 г. С целью моделирования гипергомоцистеин-индуцированной ЭД аминокислоту метионин (ОАО "Полисинтез", г. Белгород) вводили внутрижелудочно в дозе 3 г/кг/сутки в течение семи дней. Раствор для внутрижелудочного введения метионина готовили ex tempore с помощью полисорбата ТВИН 80 и 1% крахмального раствора. В качестве контроля использовали данные, полученные при внутрижелудочном введении эквивалентного количества полисорбата 10% раствора ТВИН 80 и 1% крахмального раствора.

На восьмые сутки от начала эксперимента животных наркотизировали (хлоралгидрат 300 мг/кг). На первом этапе катетер вводили в левую сонную артерию и регистрировали систолическое (САД) и диастолическое (ДАД) артериальное давление, частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Помимо измерения артериального давления (АД), проводили ряд функциональных тестов с последующей оценкой изменения параметров гемодинамики (САД, ДАД, ЧСС): эндотелийзависимая вазодилатация (ЭЗВД) в ответ на внутривенное введение раствора ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг (Laursen J.B., 1997), а также эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНВД) в ответ на внутривенное введение раствора нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг (Галаган М.Е., 1991).

Степень ЭД у экспериментальных животных, а также степень ее коррекции исследуемыми препаратами оценивали по расчетному коэффициенту ЭД (КЭД). КЭД является отношением площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ.

На втором этапе у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании, проводили исследование сократимости миокарда. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика Р 23ID "Gould", США, АЦП L-154 регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), ЧСС и интенсивность функционирования структур (ИФС) - произведение ЧСС и ЛЖД (мм рт. ст. х уд. мин).

Измерения производились и обрабатывались посредством датчика и аппарата для инвазивного измерения показателей гемодинамики "Biopac" (США), и компьютерной программы AsqKnowledge 3.8.2.

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1·10-5моль/л, из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного). При проведении данной пробы проводилась оценка максимального подъема ЛЖД в ответ на введение адреналина (Меерсон Ф.З., 1980).

2. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 секунд). После проведения данной пробы рассчитывался показатель исчерпания миокардиального резерва (выраженный в процентах), равный отношению прироста ЛЖД на 5 секунде пережатия аорты к приросту ЛЖД на 25 секунде пережатия аорты (Меерсон Ф.З., 1980).

3. Трехминутная гипоксия посредством выключения аппарата искусственной вентиляции легких с последующей реоксигенацией (Пашин Е.Н., 1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использованы модификация метода определения стабильных метаболитов NO (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., 2005) и определение концентрации гомоцистеина методом иммунотурбодиметрии с помощью набора фирмы Pliva-Lachema Diagnostika s.r.o.

Интегральный векторный анализ гемодинамических и биохимических показателей в комплексной оценке эндотелио- и кардиопротективных эффектов исследуемых препаратов. Для комплексной оценки функциональных характеристик сосудистой реактивности, сократимости миокарда и нитроксидергической системы на основе интегрального анализа всего спектра проводимых исследований, мы представили значение каждого показателя в виде вектора. Все вектора, каждый из которых соответствовал определенной нагрузочной пробе, были построены на плоскости в прямоугольной декартовой системе координат 0ху, полюсом для всех векторов было выбрано начало прямоугольной декартовой системы координат, полярной осью служило положительное направление оси 0у, длина вектора равнялась величине шести показателей комплексного функционального и биохимического исследования в изучаемых группах. Направление каждого вектора задавалось жестко, первый вектор - САД (систолическое артериальное давление) совпадал с осью 0у, последующие вектора располагались по часовой стрелке, угол между соседними векторами составлял 60°. Следующими векторами соответственно обозначены показатели - ДАД - диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции; Total NO - суммарное количество нитратов и нитритов; Гц - концентрация гомоцистеина; ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия). Координаты вектора каждой нагрузочной пробы изначально выражались как полярные (со, цо), где со - полярный радиус, цо - полярный угол, переход от полярных координат к прямоугольным (хо, yо) осуществлялся по формулам: хо = со соs цо, yо = со sin цо.

Площадь векторной диаграммы рассчитывали по формуле:

где S - площадь векторной диаграммы, хi и уi-- прямоугольные координаты соответствующих векторов, n - количество векторов.

Различия между соответствующими функциональными и биохимическими показателями при проведении исследований между изучаемыми группами животных отражаются площадью диаграмм, образованной соединением конечных точек векторов вышеуказанных показателей.

Дизайн эксперимента. Исследована эндотелио- и кардиопротективная активность ингибитора аргиназы L-норвалина, препарата "Блоктран ГТ" и его компонентов (лозартан калия и гидрохлоротиазид) и сочетанного применения L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ"

Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на лабораторных крысах.

При выборе дозы препарата "Блоктран ГТ" (производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства", г. Курск) мы опирались на максимальные суточные дозы данного препарата и его компонентов. Данный подход был выбран в связи с тем, что при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции показатели артериального давления соответствовали клиническому понятию значительной артериальной гипертензии. Максимальная терапевтическая доза лозартана калия составляет 100 мг/сутки, максимальная гипотензивная доза гидрохлоротиазида - 25 мг/сутки, максимальная терапевтическая доза препарата "Блоктран ГТ" - 2 таблетки/сутки (100 мг лозартана калия и 25 мг гидрохлоротиазида). Следовательно, после расчета дозировок исследуемых препаратов с учетом соотношения поверхности тела биологического объекта к его массе по общепринятой формуле межвидового переноса доз, с использованием коэффициентов пересчета в зависимости от массы тела по Freireich М. at al. и Улановой И.П. и др., дозировка лозартана калия составила 8 мг/кг, гидрохлоротиазида 2 мг/кг, что соответствует 0,16 таблетки/кг препарата "Блоктран ГТ".

L-норвалин (WIRUD GmgH, Hamburg) вводился в дозе 10 мг/кг внутрижелудочно, что соответствует данным доступной литературы и выявляет способность ингибировать фермент аргиназу.

При комбинированном использовании L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" при L-NAME- и гипергомоцистеин-индуцированной ЭД использовались те же дозы, пути введения, и такая же продолжительность применения.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней арифметической (+m) и вероятности возможной ошибки (Р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные, начиная с р<0,05. Для расчетов использовали программу для статистического анализа Microsoft Excel 7.0.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов лозартана калия, гидрохлоротиазида, препарата "Блоктран ГТ" при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Ежедневное, в течение семи дней, внутрибрюшинное введение L-NAME привело к статистически значимому повышению АД (рис. 1). Обнаружено, что введение лозартана калия и препарата "Блоктран ГТ" в отличие от монотерапии гидрохлоротиазидом приводило АД к заданным значениям при моделировании L-NAME-индуцированной ЭД (рис. 1).

На фоне применения исследуемых препаратов КЭД составил: лозартан калия - 2,1±0,2; гидрохлоротиазид - 2,5±0,2; "Блоктран ГТ" - 1,4±0,1.

Исследуемые препараты предотвращали повышение адренореактивности у животных с моделированием L-NAME-индуцированной патологии. Так, в группе L-NAME + лозартан калия ЛДЖ составило 209,64,0, L-NAME + гидрохлоротиазид - 216,96,8, L-NAME + "Блоктран ГТ" - 190,46,2, тогда как в группе L-NAME - 247,34,8, а у интактных - 199,28,3 мм рт.ст. (рис. 1)

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением исследуемые препараты предотвращали исчерпание миокардиального резерва. Так, на 25 секунде проведения пробы данный показатель в контрольной группе животных составил 83,6±4,6%. В группе животных, получавших L-NAME, - 66,0±4,3%. Тогда как результат у животных, получавших "Блоктран ГТ" составил 80,2±3,5%, а у животных с введением лозартана калия и гидрохлоротиазида - 79,2±5,0% и 77,7±3,5%, соответственно (рис. 1).

Моделирование L-NAME-индуцированной ЭД привело к уменьшению концентрации стабильных метаболитов оксида азота в 1,9 раза. Следует отметить, что статистически значимого увеличения концентрации стабильных метаболитов оксида азота для исследуемых препаратов не обнаружено (рис.1).

Таким образом, результаты функциональных проб и биохимических исследований выявили усиление эндотелио- и кардиопротективного действия препарата "Блоктран ГТ", по сравнению с монотерапией лозартаном калия и гидрохлоротиазидом при моделировании L-NAME-индуцированной ЭД.

АДКЭД

Проба на адренореактивность

Нагрузка сопротивлением

Концентрация стабильных метаболитов NO

Рис. 1. Функциональные и биохимические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание: 1 - интактные, 2 - L-NAME, 3 - лозартан калия, 4 - гидрохлоротиазид, 5 - "Блоктран ГТ", * - p < 0,05 в сравнении с интактными, **- р < 0,05 в сравнении с L-NAME.

2. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов сочетанного применения L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Обнаружено, что использование L-норвалина достоверно не снижало АД. Препарат "Блоктран ГТ" и сочетанное введение L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" приводили к достоверному снижению цифр АД в сравнении с группой животных, не получавшей лечения (рис. 2).

L-норвалин и "Блоктран ГТ" в качестве монотерапии обладали эндотелиопротективным действием, выразившемся в предотвращении повышения КЭД. Комбинированное применение L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" привело к оптимальному снижению КЭД, значение которого в указанной группе приближалось к таковому у животных интактной группы (рис. 2).

АД

КЭД

Проба на адренореактивность

Нагрузка сопротивлением

Концентрация стабильных метаболитов NO

Рис. 2. Функциональные и биохимические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание: 1 - интактные, 2 - L-NAME, 3 - L-норвалин, 4 - "Блоктран ГТ", 5 - L-норвалин+"Блоктран ГТ", * - p < 0,05 в сравнении с интактными, ** - р < 0,05 в сравнении с L-NAME.

L-норвалин снижал КЭД на фоне L-NAME-индуцированной патологии, не приводя цифры давления к заданному уровню. Это, с одной стороны, свидетельствует о том, что КЭД имеет самостоятельное значение, а с другой - то, что L-NAME-индуцированная АГ на седьмые сутки вовлекает в патогенетический процесс не только нитроксидергическую систему, но и все элементы гуморального и нейрогенного контуров регуляции системы кровообращения.

При проведении пробы на адренореактивность установлено статистически значимое уменьшение максимального ЛЖД в сериях экспериментов с препаратом "Блоктран ГТ" и сочетанным использованием L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" (рис. 2).

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением наиболее выраженное предотвращение исчерпания миокардиального резерва обнаружено в группах животных, получавших L-норвалин в качестве монотерапии (87,64,3%) и комбинацию L-норвалин+"Блоктран ГТ" (81,43,2%) (рис. 2).

В группе животных, получавших комбинацию L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ", обнаружено статистически значимое увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота (рис. 2), что наряду с нормализацией эндотелийзависимой вазодилатации говорит о выраженном эндотелиопротективном действии исследованной комбинации.

Таким образом, комбинацию L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO следует рассматривать как оправданную и рекомендовать к широкому клиническому изучению.

3. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов лозартана калия, гидрохлоротиазида, препарата "Блоктран ГТ" при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Обнаружено, что ежедневное введение метионина в дозе 3 г/кг не вызывает достоверного изменения АД (рис. 3). Внутрижелудочное введение исследуемых препаратов также не влияло на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД (рис. 3).

Исследуемые препараты достоверно снижали КЭД по сравнению с группой животных, не получавших лечения. Наиболее выраженное эндотелиопротективное действие оказывал "Блоктран ГТ", КЭД которого был наиболее приближен к значению КЭД контрольной группы (рис. 3).

Проба на адренореактивность характеризовалась выраженным приростом абсолютных значений ЛЖД. В группе животных, получавших метионин в дозе 3 г/кг, этот показатель составил 238,1±9,2 мм рт. ст. (рис. 3)

Анализ полученных экспериментальных данных позволил установить статистически значимое уменьшение максимального ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность во всех сериях экспериментов с лозартаном калия, гидрохлоротиазидом, препаратом "Блоктран ГТ". Максимальное предотвращение повышения адренореактивности, вызванного гипергомоцистеин-индуцированной ЭД, выявлено при использовании препарата "Блоктран ГТ" (рис. 3).

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением наиболее выраженное предотвращение исчерпания миокардиального резерва обнаружено в группе животных, получавших "Блоктран ГТ" (82,02,8). Гидрохлоротиазид статистически значимо не влиял на исчерпание миокардиального резерва (рис. 3).

Результаты определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови позволили установить достоверное повышение уровня гомоцистеина в группе экспериментальных животных, получавших метионин в дозе 3 г/кг, по сравнению с контрольной группой животных, в 6,2 раза. Применение лозартана калия, а также препарата "Блоктран ГТ" привело к статистически значимому снижению концентрации гомоцистеина в соответствующих группах экспериментальных животных (рис. 3). Однако, уровень гомоцистеина в сыворотке крови животных указанных групп оставался в 2,5 раза выше таковых значений контрольной группы животных.

Обнаружено, что лозартан калия и препарат "Блоктран ГТ" оказывали статистически значимое влияние на увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота (рис. 3).

АД

КЭД



Проба на адренореактивность

Нагрузка сопротивлением

Концентрация стабильных метаболитов NO. Концентрация гомоцистеина

Рис. 3. Функциональные и биохимические показатели при моделировании гипергомоцистеин-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание: 1 - ТВИН 80, 2 - метионин, 3 - лозартан калия, 4 - гидрохлоротиазид, 5 - "Блоктран ГТ", * - p < 0,05 в сравнении с группой животных, получавших 10% ТВИН 80; ** - р < 0,05 в сравнении с группой животных, получавших метионин.

Таким образом, результаты функциональных проб и биохимических исследований выявили усиление эндотелио- и кардиопротективного действия препарата "Блоктран ГТ", по сравнению с монотерапией лозартаном калия и гидрохлоротиазидом при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

4. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов сочетанного применения L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Обнаружено, что изучаемые препараты не влияли на исходные показатели гемодинамики и значения САД и ДАД (рис. 4).

АД

КЭД



Проба на адренореактивность

Нагрузка сопротивлением

Концентрация стабильных метаболитов NO. Концентрация гомоцистеина

Рис. 4. Функциональные и биохимические показатели при моделировании гипергомоцистеин-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание: 1 -ТВИН 80, 2 - метионин, 3 - L-норвалин, 4 - "Блоктран ГТ", 5 - L-норвалин+"Блоктран ГТ", * - p < 0,05 в сравнении с группой животных, получавших 10% ТВИН 80; ** - р < 0,05 в сравнении с группой животных, получавших метионин.

Исследуемые препараты достоверно снижали КЭД по сравнению с группой животных, не получавших лечения. Наиболее выраженное эндотелиопротективное действие оказывала комбинация L-норвалин+"Блоктран ГТ", КЭД которой был наиболее приближен к значению КЭД контрольной группы (рис. 4).

Анализ полученных экспериментальных данных позволил установить статистически значимое уменьшение максимального ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность во всех сериях экспериментов с L-норвалином, препаратом "Блоктран ГТ" и комбинацией L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ". Максимальное предотвращение повышения адренореактивности, вызванного гипергомоцистеин-индуцированной ЭД, выявлено при использовании L-норвалина и комбинации L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" (рис. 4).

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением в группах животных, получавших исследуемые препараты, миокардиальный резерв был достоверно выше, чем в группе животных, получавших только метионин, и приближался к значению миокардиального резерва контрольной группы животных (рис. 4).

Применение препарата "Блоктран ГТ" и комбинации L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" привело к статистически значимому снижению концентрации гомоцистеина в соответствующих группах экспериментальных животных (рис. 4).

Обнаружено, что препарат "Блоктран ГТ" и комбинация L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" оказывают статистически значимое влияние на увеличение концентрации стабильных метаболитов оксида азота (рис. 4).

Таким образом, комбинацию L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" на модели гипергомоцистеин-индуцированного дефицита NO следует рассматривать как оправданную и рекомендовать к широкому клиническому изучению.

5. Интегральный векторный анализ гемодинамических и биохимических показателей в комплексной оценке эндотелио- и кардиопротективной активности сочетанного применения L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ".

Исследуемые препараты оказывали выраженный антигипертензивный эффект на модели L-NAME-индуцированной ЭД, характеризующейся развитием стойкой АГ.

При моделировании гипергомоцистеин-индуцированной ЭД не наблюдалось развития АГ и исследуемые препараты не влияли на исходные показатели гемодинамики. Поэтому для данной модели патологии нами был проведен интегральный векторный анализ гемодинамических и биохимических показателей. Он представляет собой визуальную комплексную характеристику состояния сердечно-сосудистой системы, отражая отличия между группами в степени изменения параметров АД, КЭД, исчерпании миокардиального резерва, NO-продуктивной активности эндотелия, а также способности снижать уровень гомоцистеина. Векторные значения выбранных показателей были представлены в процентном отношении от соответствующих значений контрольной группы животных, принятых за 100%, площадь векторной диаграммы выражалась в условных единицах (усл. ед.).

В контрольной группе животных площадь векторной диаграммы составила 5,78, в группе с моделированием гипергомоцистеин-индуцированной ЭД - 12,19, в группе с дополнительным введением лозартана калия - 8,14, в группе гидрохлоротиазида - 9,94, препарата "Блоктран ГТ" - 7,62, L-норвалина - 9,55, а для комбинации L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" - 6,96 усл. ед. (рис. 5)



ТВИН 80 S = 5,78

Метионин S=12,19

Лозартан калия S = 8,14

Гидрохлоротиазид S = 9,94

"Блоктран ГТ" S = 7,62

L-норвалин S = 9,55

L-норвалин+"Блоктран ГТ" S = 6,96

Рис. 5. Площади векторных диаграмм функциональных и биохимических показателей при коррекции гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции лозартаном калия, гидрохлоротиазидом, препаратом "Блоктран ГТ", L-норвалином, сочетанным применением L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ".

Примечание: САД - систолическое артериальное давление; ДАД - диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции; Тotal NO - суммарное количество нитратов и нитритов; Гц - концентрация гомоцистеина; ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия).

Дальнейший анализ сочетанного применения L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" позволяет рассчитать дельту аддиции по формуле: ?адд= SL-норвалин - SL-норвалин+"Блоктран ГТ") и ее вероятностный процент (Pадд): Pадд=?адд /?мет * 100%. При проведении расчетов получаем следующие данные: ?адд= SL-норвалин - SL-норвалин+"Блоктран ГТ" = 9,55-6,96 = 2,59 (усл. ед); дельта гипергомоцистеин-индуцированной ЭД: ?мет = Sмет - Sконтроль=12,19-5,78 = 6,41 (усл. ед). После проведения соответствующих расчетов, вероятностный процент аддиции получается равным 40,4 %, что упрощенно, но интегративно описывает вклад L-норвалина при комбинированном использовании его с препаратом "Блоктран ГТ" для коррекции гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

Таким образом, наши исследования раскрывают перспективу целенаправленного и обоснованного использования ингибитора аргиназы L-норвалина как биологически активного вещества, повышающего величину эндотелиопротекции традиционной антигипертензивной терапии препаратом "Блоктран ГТ" в условиях L-NAME- и гипергомоцистеин-индуцированного дефицита оксида азота.

Выводы

1. L-норвалин (10 мг/кг) однократно в течение семи суток внутрижелудочно проявляет эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, выражающееся в снижении КЭД, предотвращении повышения адренореактивности и исчерпания миокардиального резерва. Монотерапия L-норвалином не достигала целевых значений АД.

2. Лозартан калия (8 мг/кг), гидрохлоротиазид (2 мг/кг), препарат "Блоктран ГТ" (лозартан калия 8 мг/кг + гидрохлоротиазид 2 мг/кг) однократно в течение семи суток внутрижелудочно как монотерапия проявляют эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной ЭД. Наиболее эффективное снижение КЭД обнаружено в группе животных, получавших "Блоктран ГТ". При исследовании концентрации стабильных метаболитов оксида азота обнаружено, что "Блоктран ГТ" статистически значимо увеличивает концентрацию стабильных метаболитов оксида азота, в сравнении с монотерапией лозартаном калия и гидрохлоротиазидом. При проведении нагрузочных проб обнаружено предотвращение повышения адренореактивности и исчерпания миокардиального резерва под влиянием лозартана калия, гидрохлоротиазида и препарата "Блоктран ГТ".

3. Сочетанное применение L-норвалина (10 мг/кг) и препарата "Блоктран ГТ" (лозартан калия 8 мг/кг + гидрохлоротиазид 2 мг/кг) однократно в течение семи суток внутрижелудочно оказывает выраженное эндотелиопротективное действие по сравнению с монотерапей L-норвалином и препаратом "Блоктран ГТ", что выражается в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания стабильных метаболитов оксида азота. По результатам нагрузочных проб выявлена способность данной комбинации предотвращать повышение адренореактивности и исчерпание миокардиального резерва.

4. L-норвалин (10 мг/кг) однократно в течение семи суток внутрижелудочно проявляет эндотелио- и кардиопротективное действие на модели гипергомоцистеин-индуцированного дефицита NO, выражающееся в снижении КЭД, предотвращении повышения адренореактивности и исчерпания миокардиального резерва и увеличении концентрации стабильных метаболитов оксида азота.

5. Лозартан калия (8 мг/кг), "Блоктран ГТ" (лозартан калия 8 мг/кг + гидрохлоротиазид 2 мг/кг) однократно в течение семи суток внутрижелудочно как монотерапия при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной ЭД оказывают эндотелиопротективное действие, выражающееся в снижении КЭД и нормализации сосудистых реакций. Лозартан калия и препарат "Блоктран ГТ" в изученных дозах статистически значимо предотвращают снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота и повышение концентрации гомоцистеина. Наиболее выраженное кардиопротективное действие обнаружено в группе животных, получавших препарат "Блоктран ГТ", что проявляется в снижении адренореактивности, предотвращении исчерпания миокардиального резерва. Гидрохлоротиазид (2 мг/кг) по совокупности функциональных и биохимических показателей обладает умеренным эндотелио- и кардиопротективным действием на модели гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

6. Сочетанное применение L-норвалина (10 мг/кг) и препарата "Блоктран ГТ" (лозартан калия 8 мг/кг + гидрохлоротиазид 2 мг/кг) однократно в течение семи суток внутрижелудочно оказывает дополнительное эндотелиопротективное действие на модели гипергомоцистеин-индуцированного дефицита NO, что выражается в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания стабильных метаболитов оксида азота и повышения концентрации гомоцистеина. По результатам нагрузочных проб выявлена способность комбинации L-норвалина и препарата "Блоктран ГТ" предотвращать повышение адренореактивности и исчерпание миокардиального резерва.

7. Расчет вероятностного коэффициента аддиции показал, что комбинация L-норвалина (10 мг/кг) и препарата "Блоктран ГТ" (лозартан калия 8 мг/кг + гидрохлоротиазид 2 мг/кг) проявляет положительное фармакодинамическое взаимодействие на модели гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида в одной таблетке при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте / А.В. Бабко, М.В. Покровский, Е.Г. Терехова [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 4 (127). - С. 19-24. (Перечень ВАК)

2. Влияние сочетанного применения ингибитора аргиназы L-норвалина и фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида в одной таблетке на эндотелиальную дисфункцию при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / А.В. Бабко, М.В. Покровский, Е.Г. Терехова [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 4 (127). - С. 24-29. (Перечень ВАК)

3. Влияние фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида в одной таблетке на эндотелиальную дисфункцию при моделировании гипергомоцистеин-индуцированного дефицита оксида азота / М.В. Покровский, А.В. Бабко, М.В. Корокин [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 4 (127). - С. 151-156. (Перечень ВАК)

4. Кардио- и эндотелиопротективные эффекты ингибитора аргиназы L-норвалина при моделировании L-NAME индуцированного дефицита оксида азота / С.А. Цепелева, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - № 4 (127). - С. 185-188. (Перечень ВАК)

5. Роль ингибитора аргиназы в коррекции гомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции / С.А. Цепелева, М.В. Корокин, А.С. Белоус [и др.] // Молодежная наука и современность: материалы 76-й всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, Курск, 19-20 апр. 2011 г. / Курский гос. мед. ун-т, Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН, Рос. акад. естеств. наук; ред. кол.: В.А. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2011. - С. 298.

6. Эндотелио- и кардиотропные эффекты L-норвалина в эксперименте / С.А. Цепелева, А.С. Белоус, О.С. Гудырев [и др.] // Молодежная наука и современность: материалы 76-й всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, Курск, 19-20 апр. 2011 г. / Курский гос. мед. ун-т, Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН, Рос. акад. естеств. наук; ред. кол.: В.А. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2011. - С. 299.

7. Эндотелиопротективные эффекты фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции / А.В. Бабко, Е.Г. Терехова, М.В. Корокин [и др.] // Биотехнология и биомедицинская инженерия: сб. тр. IV всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Курск, 6-7 июня 2011 г. / Курский гос. мед. ун-т; под ред.: В.А. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2011. - С. 113.

8. Эндотелиопротективные эффекты сочетанного применения ингибитора аргиназы L-норвалина и фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота в эксперименте / А.В. Бабко, Е.Г. Терехова, М.В. Корокин [и др.] // Биотехнология и биомедицинская инженерия: сб. тр. IV всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Курск, 6-7 июня 2011 г. / Курский гос. мед. ун-т; под ред.: В.А. Лазаренко [и др.]. - Курск, 2011. - С. 114.

9. Бабко, А.В. Кардиопротективные эффекты фиксированной комбинации лозартана и гидрохлоротиазида при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции / А.В. Бабко, М.В. Корокин, Е.Г. Терехова // Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии: сб. материалов III всерос. науч.-практ. семинара для молодых ученых, Волгоград, 14-15 сент. 2011 г. / ВолГМУ. - Волгоград, 2011. - С. 22-23. - (прил к журн. "Вестник Волгоградского государственного медицинского университета").

10. Сравнительная оценка эндотелиопротективных эффектов L-норвалина при различных моделях эндотелиальной дисфункции / С.А. Цепелева, В.Ю. Цепелев, М.В. Корокин [и др.] // Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии: сб. материалов III всерос. науч.-практ. семинара для молодых ученых, Волгоград, 14-15 сент. 2011 г. / ВолГМУ. - Волгоград, 2011. - С. 77-78. - (прил к журн. "Вестник Волгоградского государственного медицинского университета").

11. Arginase inhibitor in the pharmacological correction of endothelial dysfunction / M. V. Pokrovskiy, M. V. Korokin, S. A. Tsepeleva [et al.] // Int. J. Hypertens. - 2011. - Vol. 2011. - Art. ID 515047.

Размещено на Allbest.ru