Влияние экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на динамику некоторых патологических процессов ЦНС в эксперименте

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Влияние экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на динамику некоторых патологических процессов ЦНС в эксперименте

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

КОНИЕВА АЛИНА АЛАНБЕКОВНА

Москва - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

академик РАМН, профессор Владимир Никитич Ярыгин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Татьяна Клеониковна Дубовая

доктор медицинских наук, профессор Сергей Андреевич Гусев

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава

Защита состоится «27» сентября 2010 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «7» июля 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор А.И. Щёголев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Клеточная терапия в настоящее время рассматривается как перспективный и многообещающий метод лечения тяжелых заболеваний. Среди них важное место занимают цереброваскулярные и травматические поражения ЦНС, создающие острую медико-социальную проблему, наносящую огромный экономический ущерб обществу. Инсульт, как наиболее частая форма острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК), ежегодно в мире поражает от 5,6 до 6,6 млн человек. В течение первого года смертность от инсульта составляет около 50% заболевших. Инсульт является основной причиной инвалидизации больных, т.к. у 80% выживших имеются ограничения трудоспособности в связи с сохраняющимися двигательными нарушениями. Более того, за последнее десятилетие наметилась тенденция к «омоложению» инсульта. Так, в последние годы не менее 20% ОНМК диагностируется у лиц трудоспособного возраста. Это делает рассматриваемую патологию общественно значимой.

Травматическая болезнь спинного мозга (ТБСМ) приобрела чрезвычайную актуальность в связи с ростом технического прогресса, что привело к резкому увеличению частоты травматических поражений позвоночника и спинного мозга. По данным ВОЗ число больных с поражением спинного мозга составляет около 30 человек на 100 000 населения. В России численность больных с последствиями ТБСМ составляет порядка 8 тысяч человек. При этом зачастую пострадавшими являются социально-активные, работоспособные люди. В подавляющем большинстве случаев последствием тяжелых повреждений спинного мозга является инвалидизация пациентов, что ведет за собой стойкую утрату трудоспособности и, как следствие, значительные социальные и экономические потери.

Существующие на сегодняшний день протоколы нейрохирургической коррекции и медикаментозной терапии цереброваскулярных заболеваний и травматических повреждений не способны обеспечить полное восстановление структуры и функции ЦНС и направлены лишь на предотвращение гибели нейронов, окружающих очаг поражения, развивающейся вследствие запуска каскада патобиохимических реакций. Многочисленные экспериментальные исследования возможностей клеточной терапии в лечении данных заболеваний внушают большие надежды. В связи с этим, использование возможностей регенеративной медицины и, в частности, клеточной терапии как методов, стимулирующих структурно-функциональное восстановление ЦНС, является чрезвычайно актуальным, а дальнейшее исследование механизмов действия стволовых клеток приобретает особую научно-практическую значимость.

Цель исследования: изучение влияния экзогенных мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека на восстановительные процессы в условиях экспериментального ишемического инсульта и спинальной травмы; исследование распределения трансплантированных клеток в организме животных.

Задачи исследования:

1. Разработать метод эффективного мечения мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека магнитными флуоресцентными микросферами и проанализировать влияние этих микрочастиц на физиологические функции клеток in vitro;

2. Изучить распределение меченых человеческих МСК после интраспинальной трансплантации животным с травмой спинного мозга;

3. Изучить распределение меченых человеческих МСК после внутривенной трансплантации животным с экспериментальным ишемическим инсультом;

4. Оценить эффективность действия трансплантированных человеческих МСК на восстановление локомоторных функций по шкале BMS у мышей после травмы спинного мозга;

5. Оценить неврологический статус крыс с экспериментальным ишемическим инсультом после трансплантации человеческих МСК в тестах «Открытое поле» и «Крестообразный лабиринт»;

6. Методом магнитно-резонансной томографии проследить за динамикой изменения очага ишемии в головном мозге крыс после трансплантации человеческих МСК;

7. Охарактеризовать клеточные механизмы действия МСК после их трансплантации мышам с травмой спинного мозга и крысам с ишемическим инсультом.

Научная новизна. Подобрана методика эффективного мечения мезенхимальных стволовых клеток магнитными флуоресцентными микрочастицами, что позволило визуализировать МСК после трансплантации животным как прижизненно, с помощью МРТ, так и постмортально, с использованием флуоресцентной микроскопии. Детально изучены возможные нежелательные эффекты этих частиц на функциональное состояние клеток в культуре.

Впервые изучены механизмы действия мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из плаценты человека, на эндоваскулярной модели инсульта у крыс и на модели позвоночно-спинномозговой травмы у мышей. Показано восстановление неврологического дефицита у животных в обоих случаях повреждения ЦНС после трансплантации человеческих плацентарных клеток. Впервые выявлена миграция меченых клеток в гиппокамп обоих полушарий мозга, как при инсульте, так и при спинальной травме. Также установлен факт дифференцировки МСК плаценты человека в нейрональном направлении после трансплантации грызунам с моделью инсульта и спинальной травмы.

При помощи МРТ показано достоверное уменьшение очага ишемии у опытных крыс, по сравнению с контрольными животными. Впервые была показана временная характеристика распределения меченых клеток в организме крыс с инсультом, свидетельствующая о том, что МСК проникают в мозг через сосуды, вокруг которых концентрируются в течение первых 7 дней. Затем происходит их миграция в зону ишемии, где они достигают максимальной концентрации к концу 3 недели. Впервые определена стимуляция эндогенного нейрогенеза под влиянием трансплантации МСК, выделенных из плаценты человека, у крыс с ишемией головного мозга.

Практическая значимость. Результаты исследования позволяют расширить и дополнить существующие представления о клеточной терапии заболеваний центральной нервной системы. Данная работа является частью обширных доклинических исследований терапии цереброваскулярных заболеваний и травматических поражений спинного мозга и вносит определенный вклад в подготовку клинических испытаний и, в дальнейшем, внедрения в практическую медицину. Активное изучение механизмов действия МСК в доклиническом формате является залогом эффективного и безопасного применения их в будущем.

Внедрение в практику. Методические рекомендации по выделению мезенхимальных стволовых клеток из экстраэмбриональных органов, их культивированию и дифференицровке в условиях in vitro использованы при выполнении научной работы в группе липидных модуляторов иммунитета отдела иммунологии ИБХ РАН, а методические рекомендации по мечению МСК плаценты человека внедрены в практику лаборатории клеточной биологии ИБМХ им. В.Н.Ореховича.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 9-м международном семинаре по магнитному резонансу (г. Ростов-на-Дону, 2008), на научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (г. Москва, 2008), на итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (г. Москва, 2008), на 6-м Всемирном конгрессе по инсульту (г. Вена, 2009), на 2-ой ежегодной европейской конференции «Stem Cells & Regenerative Medicine» (г. Эдинбург, 2009), на российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение» (г. Пятигорск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включая 5 таблиц и 42 рисунка. Список литературы включает 243 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из плаценты человека. Выделение МСК из тканей плаценты человека производили ферментативным способом. Для получения клеток использовали фрагмент ткани плаценты после нормальных родов вблизи пупочного канатика. После промывания его раствором Хэнкса (ПанЭко, РФ), содержащим антибиотики, и механического воздействия, полученную взвесь инкубировали в 0,1%-ном растворе коллагеназы I_го типа (Gibco, США) в течение 30 мин при 37C. По окончании инкубации суспензию отмывали раствором Хэнкса (5 мин, 300 g). Осадок ресуспендировали в DMEM-F12 (Gibco, США) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, США), 100 мкг/мл стрептомицина, 100 U/мл пенициллина, 2 мМ L-глютамина (все - Gibco, США), и суспензию помещали в культуральные флаконы (площадью 75 см² с фильтром (Greiner, Германия)). Культивирование проводили в СО₂_инкубаторе со следующими параметрами: 37є С, 5 % СО₂, 80 % влажности. При достижении 80-90% конфлюентности, клетки снимали с пластика раствором трипсина-версена (ПанЭко, РФ) (в соотношении 1:1) и рассаживали в концентрации 2,5Ч10⁵клеток/флакон. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Мечение МСК магнитными флуоресцентными микрочастицами. Для мечения МСК использовали магнитные флуоресцентные (л_ex = 480 нм, л_em = 520 нм) микрочастицы диаметром 0,96 мкм (Bangs lab. Inc., США). По достижении 80-90% конфлюентности к культуре МСК добавляли суспензию частиц (5 мкл стоковой суспензии на 1 мл культуральной среды). Клетки инкубировали с частицами 24 часа в СО₂-инкубаторе. Эффективность мечения оценивали на проточном цитофлуориметре EPICS Coulter XL. Для каждого образца регистрировали не менее 1х10⁴ событий. Обработку полученных результатов проводили в программе WinMDI.

Оценка уровня пролиферации МСК, меченых магнитными микрочастицами. МСК культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах (1000 клеток на лунку) с последовательными разведениями частиц (от 25 до 2,5 мкл стоковой суспензии частиц на 1 мл культуральной среды). Клетки инкубировали 3 дня, затем удаляли супернатант и добавляли по 30 мкл/лунку раствора MTT (исходная концентрация 5 мг/мл) (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид) (Sigma, США) для определения пролиферации клеток колориметрическим способом. После завершения инкубации (2-4 ч) добавляли 100 мкл DMSO (ПанЭко, РФ) на лунку. Оптическое поглощение измеряли через 15 мин на приборе Multiscan (Titertek, Швейцария) при длине волны 540 нм. Эксперимент был выполнен в 3-х повторах. Обработку статистических данных производили в программе Microsoft Excel.

Анализ клеточной гибели в PI-тесте. МСК метили магнитными частицами, как описано выше, и культивировали в течение 3 сут. Затем клетки снимали с пластика раствором трипсина/версена (1:1), дважды отмывали раствором Хэнкса и проводили фиксацию и пермеабилизацию ледяным 70 %-ным этанолом не менее 1 ч при 4?С. После этого клетки дважды отмывали в PBS (ПанЭко, РФ) центрифугированием (5 мин, 300 g), осадок ресуспендировали в растворе пропидиум иодида (PI) (конечная концентрация 25 мкг/мл), приготовленном на основе PBS и содержащем 10 мкг/мл РНКазы (Sigma, США). Оценку клеточной гибели проводили на проточном цитофлуориметре EPICS Coulter XL. Для каждого образца регистрировали не менее 1х10⁴ событий. Обработку полученных результатов проводили в программе WinMDI. На гистограммах учитывали долю гиподиплоидных клеток, обладающих более низкой флуоресценцией.

Нейрональная дифференцировка МСК in vitro. Клетки рассаживали в 24-луночных планшетах на покровные стекла в концентрации 2,5 тыс/лунку и метили их микрочастицами, как описано выше. В течение суток проводилась предварительная индукция дифференцировки путем замены обычной культуральной среды на среду, содержащую 1 % FBS и 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF). Контрольные клетки культивировали в той же среде, не содержащей bFGF. Инкубация проводилась при 37⁰С в атмосфере 5% СО₂. Через сутки индукционную среду заменяли на дифференцировочную следующего состава: DMEM F-12, 1мM RA (ретиноевая кислота), 20 нг/мл bFGF, 20 нг/мл EGF, 100 нг/мл NGF, 10 нг/мл NT-3, 5 мг/мл инсулина, 1 мM гидрокортизона, 1 мM прогестерона (все - Sigma, США), пенициллин, стрептомицин, L-глютамин. Клетки культивировали в течение 4 недель в СО₂_инкубаторе со сменой среды 2 раза в неделю. Контрольные клетки культивировали в среде DMEM F-12 с добавлением пенициллина, стрептомицина, L-глютамина, но без факторов дифференцировки.

Анализ экспрессии нейрональных маркеров мезенхимальными стволовыми клетками, выделенными из плаценты человека. Иммуноцитохимическую оценку экспрессии нейрональных маркеров мезенхимальными стволовыми клетками проводили через 4 недели после индукции дифференцировки. МСК дважды промывали раствором PBS, pH 7.4, и фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида (pH 7.4) (Sigma, США) в течение 20 мин при комнатной температуре. После фиксации клетки дважды отмывали PBS и проводили пермеабилизацию 0,6%-ным раствором сапонина (Sigma, США), в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем клетки трижды отмывали PBS. Блокирование неспецифического связывания проводили в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 1% FBS (HyClone, США), 0.1% Tween 20 (Sigma, США). Далее клетки инкубировали с мышиными антителами к человеческим нейрональным маркерам NSE и GFAP (все - 1:100, Chemicon, США) в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего проводили две отмывки, как описано выше. Затем клетки инкубировали с антивидовыми антителами (1:100), мечеными родамином (л_ex = 550 нм, л_em = 570 нм) в течение 40-60 мин при комнатной температуре, дважды отмывали их в PBS, содержащем 1% FBS, 0.1% Tween 20. Ядра клеток докрашивали DAPI (1 мкг/мл PBS) (Sigma, США). Визуализацию клеток и получение изображений проводили на флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 с использованием цифровой камеры AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия).

Моделирование спинальной травмы. В исследовании были использованы 44 взрослые (2-3 месяца) самки мышей линии С57Bl/6 серии №26 (питомник лабораторных животных ГУ НЦБМТ РАМН). Выполняли ламинэктомию 6-8 грудных позвонков (Т6-Т8), обнажая дорсальную поверхность спинного мозга. Для создания стандартизованного ушиба спинного мозга использовали металлический стерильный импактор, цилиндрической формы и окончанием в виде конуса, весом 1 г. Прицельное падение импактора на обнаженную зону спинного мозга проводили однократно с высоты 13 см. Опытным животным (n=21) в область травмы непосредственно после ушиба вводили меченые флуоресцентными микрочастицами МСК плаценты человека (1 млн в 0,1 мл физ. раствора). Контрольной группе (n=23) в область травмы аналогичным образом вводили 0,1 мл физиологического раствора. Протокол экспериментов с животными был рассмотрен и утвержден Этическим комитетом при РГМУ.

Анализ восстановления локомоторных функций у мышей с травмой спинного мозга. Оценка восстановления локомоторной функции проводилась непосредственно после операции, а также через 1, 3, 7, 14, 19, 21, 25 и 30 суток в тесте открытое поле с использованием шкалы BMS, в которой учитывали активность и объем движений в суставах, участие конечности в акте движения, позицию, положение по отношению к туловищу, координацию функции передних и задних конечностей, а также способность удерживать стабильное положение тела. Шкала разделена на 10 баллов от 0 до 9, где 0 баллов - полный паралич конечностей, а 9 - отсутствие дефицита локомоторной активности.

Гистологическое окрашивание тканей спинного мозга мышей. На 30 сутки после создания травмы спинного мозга мышей забивали методом цервикальной дислокации и выделяли фрагменты позвоночного столба длиной 3 см, включающие зону травмы и неповрежденные сегменты выше и ниже травмы. Фрагменты позвоночного столба освобождали от мягких тканей и убирали остистые отростки. Полученные образцы ткани спинного мозга фиксировали в 2,5%-ном растворе формальдегида в течение 24 часов. Затем проводили импрегнацию 1% OsO₄ (Sigma, США), обезвоживали в спиртах и заключали в аралдит. Срезы фотографировали с помощью цифровой фотокамеры и проводили двумерную реконструкцию ткани, используя программу PhotoStitch (Canon, Япония).

Иммуногистохимический анализ криосрезов спинного и головного мозга мышей с травмой спинного мозга. Извлеченные органы быстро замораживали в парах азота и хранили при -80?С. Продольные серийные срезы (10 мкм) спинного мозга, а также серийные фронтальные срезы головного мозга производили на криотоме Microm HM560 (Carl Zeiss, Германия). Криосрезы фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида, дважды отмывали PBS и докрашивали DAPI (1 мкг/мл). Для иммуногистохимической окраски фиксированные срезы спинного мозга отмывали PBS, блокировали в течение 30 мин в PBS, содержащем 0.5% бычьего сывороточного альбумина, 2% нормальной козьей сыворотки, 0.05% Tween 20, 0.01% мертиолята. После отмывки инкубировали с первичными антителами против человеческого нейроспецифического пептида (NeuN) (1:100) в течение 1 часа, затем трижды промывали PBS. Инкубировали срезы со вторичными анти-видовыми антителами, мечеными родамином (1:200, все - Chemicon, США), в течение часа с последующими отмывками в растворе PBS. Ядра клеток докрашивали раствором DAPI (1 мкг/мл). Анализ окрашенных криосрезов проводили на флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 с использованием цифровой камеры AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия).

Экспериментальные животные и модель инсульта. Работа выполнена на белых крысах-самцах линии Вистар, с исходной массой 260-300 г. Животных наркотизировали хлоралгидратом в дозе 300 мг/кг веса внутрибрюшинно. Для эндоваскулярной окклюзии средней мозговой артерии (СМА) использовали нейлоновую нить 4-0 с силиконовым наконечником диаметром 0,25 мм, которую через катетер из наружной сонной артерии вводили во внутреннюю сонную артерию, продвигая ее "вслепую" до места отхождения СМА (на 17--20 мм). Контролируемая продолжительность окклюзии СМА составляла 1 час, после чего нить удаляли. Опытной группе животных (n=22) через 24 ч после операции внутривенно вводили МСК, меченые магнитными микрочастицами (2 млн клеток в 1 мл физиологического раствора в бедренную вену). Контрольной группе животных (n=24) вместо МСК аналогичным образом инъецировали физиологический раствор в объеме 1мл. Протокол экспериментов с животными был рассмотрен и утвержден Этическим комитетом при РГМУ.

Поведенческое тестирование крыс с экспериментальным ишемическим инсультом. Оценку неврологического статуса у животных проводили по модифицированной шкале mNSS (modified Neurological Stroke Scale). Оценивали сенсорную и рефлексную деятельность по рефлексу с ушной раковины, роговичному рефлексу, старт-рефлексу. Каждый показатель оценивался от 1 до 3 баллов, в зависимости от степени выраженности. Исследование интегративной деятельности мозга животных оценивали по их поведению в тестах "Открытое поле", где фиксировали горизонтальную и вертикальную активность животного, а также в тесте "Крестообразный лабиринт", где в течение 3 минут регистрировали общее время нахождения животного на свету, а также количество выглядываний из закрытых концов лабиринта.

Магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга крыс. МРТ головного мозга экспериментальных животных проводили на 1-е, 7-е, 14-е, 21-е сутки после операции с помощью установки BioSpec 70/30 (Bruker, Германия) с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 мТл/м. Для передачи РЧ-сигнала использовали линейный трансмиттер с внутренним диаметром 72 мм, для детекции РЧ-сигнала - поверхностную приемную катушку для мозга крысы. Для оценки ишемического очага и визуализации МСК, меченых магнитными микрочастицами были использованы следующие импульсные последовательности:

· режим Т2-ВИ - импульсная последовательность на основе спинового эха RARE со следующими параметрами: TR = 6000 мс, TE = 63,9 мс, толщина среза 0,5 мм, разрешение 0,164 x 0,164 мм/пиксел;

· для получения Т2*-ВИ (сильная чувствительность к локальной неоднородности магнитного поля) - импульсная последовательность на основе градиентного эха - SNAP, со следующими параметрами: TR = 113 мс, TE = 13 мс, толщина среза 1 мм, разрешение 0,156 x 0,156 мм/пиксел.

Анализ МР-изображений проводили в программе Image J.

Иммуногистохимический анализ распределения меченых человеческих МСК в организме крыс. Экспериментальных животных декапитировали на фоне хлоралгидратного наркоза на 1, 5, 12 и 19 сутки после введения МСК (т.е. на 3, 7, 14 и 21 сутки после операции, соответственно). Сразу после этого извлекали головной мозг, легкие, печень, селезенку и костный мозг и замораживали в парах жидкого азота в течение 20 мин. Полученные образцы хранили при -80⁰С. Фронтальные серийные срезы головного мозга крыс, а также срезы внутренних органов, толщиной 10 мкм, готовили на криотоме Microm HM560 (Carl Zeiss, Германия). Криосрезы фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида. Фиксированные срезы докрашивали DAPI (1 мкг/мл). Для оценки возможной дифференцировки трансплантированных человеческих клеток в ишемизированном мозге крысы, фиксированные фронтальные срезы мозга окрашивали антителами, специфичными к человеческим нейрональным (NeuN) и глиальным (GFAP) белкам (разведение антител 1:100) по методике, описанной выше. Ядра докрашивали раствором DAPI (1 мкг/мл). Визуализацию тканей и получение изображений проводили на флуоресцентном микроскопе Axioplan 2 с использованием цифровой камеры AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия). Кроме того, срезы головного мозга крыс окрашивали антителами к ядерному белку Ki-67, маркеру пролиферирующих клеток (титр антител 1:100). В качестве вторичных антител использовали анти-видовые антитела, меченые пероксидазой хрена. Окрашивание проводили с использованием DAB системы визуализации (DakoCytomation, Дания).

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Для сравнения межгрупповых показателей динамики восстановительных процессов использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. При нормальном распределении выборки для парных сравнений использовался t-критерий Стьюдента. Различия рассматривали как статистически значимые при значении уровня достоверности р<0,05.

мезенхимальный стволовой плацента трансплантация

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние магнитных микросфер на уровень пролиферации МСК в культуре. Поскольку используемые в работе микрочастицы состоят из оксида железа, который является токсичным для клеток, необходимо было оценить возможное влияние этих частиц на физиологические функции МСК в культуре. Кроме того, необходимо было выявить максимальную концентрацию частиц, при которой клетки эффективно метились бы и не подвергались токсическому воздействию. Для этого была проведена оценка влияния микрочастиц на уровень пролиферации клеток. Анализ пролиферативного потенциала МСК в присутствии различных концентраций магнитных флуоресцентных микрочастиц показал, что заметное снижение пролиферации клеток происходит при добавлении к культуре 15 мкл стоковой суспензии микрочастиц. Максимальная концентрация микрочастиц, которая не влияла на пролиферацию МСК плаценты человека, составила 5 мкл/мл (Рис.1). Имеено такая концентрация использовалась в дальнейших экспериментах для мечения клеток.

Рис. 1. Зависимость уровня пролиферации МСК от количества магнитных микрочастиц в среде. Ось Y - оптическая плотность при длине волны 540 нм; ось Х - количество микрочастиц в культуральной среде (мкл стоковой суспензии/мл культуральной среды).

Анализ гибели меченых микрочастицами МСК в культуре. Важной физиологической составляющей жизнедеятельности клеток, кроме пролиферативного потенциала, является спонтанная гибель клеток в культуре, связанная, в частности, с их старением.

Рис. 2. Гистограммы распределения уровня флуоресценции МСК в PI-тесте после их инкубации с микрочастицами (5 мкл/мл, 3 дня). А - контрольные (немеченые) МСК; Б - меченые МСК

Для того чтобы оценить влияние микросфер на этот процесс, МСК культивировали с микрочастицами (5 мкл/мл) в течение трех дней и оценивали уровень клеточной гибели в пропидиум иодидном тесте (PI тест). Результаты этого теста показали, что микрочастицы в выбранной концентрации (5мкл/мл) не повышали уровень спонтанной клеточной гибели в культуре по сравнению с контрольными клетками, культивируемыми без микросфер (Рис. 2).

Эффективность мечения МСК магнитными микрочастицами. По данным проточной цитофлюорометрии эффективность мечения мезенхимальных стволовых клеток магнитными флуоресцентными микрочастицами составляла порядка 90%. Тем не менее, со временем в процессе культивирования клеток происходила потеря ими магнитных частиц, в связи с экзоцитозом и распределением частиц между дочерними клетками при делении. Так, было показано, что число меченых клеток существенно снижалось после 4-го пассажа (оставалось не более 35% меченых клеток от общего числа клеток в культуре) (Рис. 3). Кроме того, количество метки на клетку также уменьшалось при пассировании. Однако полученный результат нисколько не отразился на дальнейшей работе, поскольку для трансплантации животным использовали клетки, меченые непосредственно перед экспериментом, а визуализацию трансплантированных клеток проводили не позднее 3-4 недель после введения.

Рис. 3. Уменьшение числа меченых клеток при пассировании в культуре. Ось Y - % меченых клеток, ось Х - число пассажей.

Нейрональная дифференцировка МСК in vitro. Через 4 недели после индукции нейрональной дифференцировки иммуноцитохимический анализ экспрессии нейрональных маркеров показал, что и меченые, и немеченые клетки проявляют признаки нейрональной дифференцировки, экспрессируя глиальный фибрилярный кислый белок (GFAP) - маркер астроглии, и нейронспецифичную энолазу (NSE) - маркер зрелых нейронов. МСК, культивируемые в среде без добавления факторов роста и гормонов, не экспрессировали ни NSE, ни GFAP (данные не представлены).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что загрузка МСК магнитными флуоресцентными микрочастицами не влияет на их основные физиологические функции (пролиферацию, спонтанную гибель и дифференцировку) в условиях in vitro, что позволяет использовать эти частицы в качестве метки в дальнейших экспериментах in vivo.

Спинальная травма.

Анализ функционального восстановления животных. У всех животных сразу после операции по созданию ушиба спинного мозга и в течение еще нескольких дней отмечались явления спинального шока, характеризующиеся вялыми параличами и выпадением сенсорной и рефлекторной функций задних конечностей, таким образом, средний балл по шкале BMS составлял 0 баллов. Уже к 7 суткам после операции и трансплантации МСК происходило достоверное увеличение объема движения в задних конечностях животных опытной группы (p<0,05). В дальнейшем у 83% животных опытной группы в той или иной степени восстанавливалась произвольная функция задних конечностей, в то время как в контрольной группе способность к произвольным движениям не выявлялась на протяжении всего времени наблюдения. Так, на 30 сутки средний балл опытной группы составил 4,33±0,41, что по шкале BMS соответствует произвольным движениям задних конечностей, участию их в ходьбе, способности опираться при ходьбе на задние конечности, а также положению конечности на подошвенной поверхности стопы. Большинство мышей контрольной группы оставались парализованными в течение всего срока эксперимента, и лишь у 17% отмечалась смена параплегии спастическим парезом с частичным восстановлением чувствительности задних конечностей. В контрольной группе средний балл по шкале BMS составил 1,33±0,67, что соответствует легкому непроизвольному движению в отдельных суставах задних конечностей (Рис. 4).

Рис. 4. Восстановление локомоторной функции задних конечностей по шкале BMS.

Гистологический анализ спинного мозга после трансплантации человеческих МСК. У животных контрольной группы в зоне травмы и вокруг нее формировался соединительнотканный рубец, через который на протяжении 30 суток не наблюдали прорастания аксонов.

У опытных животных через 30 суток после операции в зоне травмы наблюдали активный рост и миелинизацию нервных проводников (Рис. 5).

Рис. 5. А - косой срез миелинизированного нервного волокна в соединительнотканном рубце (показан стрелкой); Б - миелинизированные нервные волокна ниже уровня травмы через 30 дней после операции и трансплантации клеток плаценты. Двумерная реконструкция полутонких срезов (импрегнация тетраоксидом осмия).

Анализ миграции и нейрональной дифференцировки МСК после трансплантации в зону травмы спинного мозга. Через 30 дней после трансплантации человеческих МСК в зону повреждения спинного мозга большие скопления клеток обнаруживались в месте введения клеток. Кроме того, они распространялись в тканях спинного мозга в ростральном и каудальном направлениях от места повреждения. Незначительная часть трансплантированных клеток мигрировала вглубь ткани и расселялась в радиусе нескольких миллиметров от травмы. Через 30 дней после трансплантации эти клетки начинали экспрессировать маркер нейрональной дифференцировки NeuN. Таким образом, было показано, что часть введенных клеток плаценты выживает в тканях спинного мозга мыши, по крайней мере, в течение 1 месяца. При этом часть клеток приобретает признаки нейрональной дифференцировки. При исследовании серийных фронтальных срезов головного мозга животных опытной группы, оказалось, что через 30 дней после интраспинального введения человеческих клеток, большие скопления метки обнаруживаются в гиппокампе, в области зубчатой извилины (данные не представлены).

Ишемический инсульт.

Магнитно-резонансная томография. В эксперимент вошли животные, объем поражения головного мозга которых, по данным МРТ (в режиме Т₂-ВИ), на первые сутки составил в среднем 0,182±0,04 см³. Уже с 7 суток после инфаркта (и, соответственно, через 5 суток после трансплантации МСК), объем поражения мозга опытных крыс характеризовался более быстрым и полным регрессом.

Таблица 1. Сравнительная динамика уменьшения очага ишемии, вызванного окклюзией СМА, в контрольной группе крыс и в группе животных, которым трансплантировали человеческие МСК.

Через 3 недели после окклюзии СМА средний объем очага ишемии у крысы экспериментальной группы был уже в 10,6 раз меньше (0,006 см³), чем у контрольного животного (0,064 см³) (Таблица 1).

Рис. 6. МРТ головного мозга опытного животного на 14 сутки после операции. Режим Т2*-ВИ. А - концентрация меченых МСК в области ишемии

. Участки концентрации трансплантированных МСК показаны стрелками. Б - треки МСК, меченых магнитными микрочастицами, в ипсилатеральном полушарии головного мозга опытной крысы.

В режиме Т2* - взвешенных изображений удалось зафиксировать в ишемизированном полушарии крысы меченые МСК, которые через 2 недели после операции формировали направленные «треки» и накапливались в районе очага инсульта (Рис. 6).

Оценка неврологического статуса. В первые сутки после операции при оценке неврологических отклонений у всех крыс с ишемическим инсультом наблюдались умеренные неврологические нарушения в виде вялости и замедленности движений. Средняя оценка по шкале mNSS составила 13,3±0,27 баллов, что соответствует поражению средней тяжести. В дальнейшем восстановление неврологического дефицита, связанное с собственными репаративными возможностями нервной системы крыс, происходило в обеих группах. Тем не менее, в опытной группе наблюдалось статистически достоверное улучшение показателей уже на 7 сутки после операции (достоверность отличий при сравнении опытной и контрольной групп при p<0,01), которое сохранялось на протяжении всего эксперимента (данные не представлены).

При исследованиях в тестах «Открытое поле» и «Крестообразный лабиринт» выявилось, что восстановление активности и ориентации в экспериментальной установке животных, перенесших трансплантацию МСК, более выражено и происходит быстрее, чем у животных контрольной группы (Рис. 7).

Рис. 7. Оценка функционального восстановления животных в поведенческих тестах.

Иммуногистохимический анализ криосрезов головного мозга и внутренних органов крыс с ишемическим инсультом после трансплантации человеческих МСК, меченых магнитными флуоресцентными микрочастицами. Анализ серийных фронтальных срезов головного мозга и внутренних органов показал, что в течение первых суток после трансплантации клетки распространяются в паренхиматозных органах (печень, селезенка, легкие, почки), а также в костном мозге, в то время как в головном мозге обнаруживаются лишь единичные меченые клетки (данные не представлены). Через 5 дней после внутривенного введения меченых МСК, они образовывали скопления в головном мозге преимущественно вокруг сосудов, в большей степени в ипсилатеральном полушарии. На второй неделе после трансплантации МСК, эти клетки формировали «треки», начинающиеся от периваскулярных зон скопления. В это время появлялись также незначительные их скопления в области ишемии, где они достигали максимальной концентрации к 3 неделе. Также на 3 неделе значительные скопления меченых клеток наблюдались в гиппокампе обоих полушарий (Рис. 8).

Рис. 8. А - периваскулярная локализация меченых магнитными флуоресцентными частицами МСК в ишемизированном полушарии крысы через 5 дней после трансплантации клеток. Б - формирование мезенхимальными стволовыми клетками «треков» в ишемизированном полушарии через 12 дней после трансплантации. В - скопление меченых МСК в гиппокампе ишемизированного полушария. Г - скопление меченых человеческих МСК в зоне ишемии через 21 после инсульта.

В головном мозге трансплантированные МСК проявляют несколько механизмов действия. В частности, иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга антителами к человеческому глиальному фибриллярному кислому белку - маркеру астроглии, а также нейрон-специфическому ядерному белку - маркеру нейронов, выявило, что некоторое число меченых клеток в зоне ишемии проявляет признаки нейрональной дифференцировки (Рис. 9).

Рис. 9. Экспрессия человеческими МСК нейрональных маркеров в периинфарктной зоне головного мозга крыс с ишемическим инсультом через 3 недели после трансплантации клеток. А - экспрессия человеческого GFAP; Б - экспрессия человеческого NeuN.

Также в работе было установлено, что через 12 дней после внутривенного введения человеческих клеток крысам с ишемическим инсультом происходит активная стимуляция пролиферации резидентных нейрональных стволовых клеток в субвентрикулярной зоне обоих полушарий. Используя маркер пролиферирующих клеток Ki-67, было показано, что по сравнению с контрольными животными, количество делящихся клеток в субвентрикулярной зоне опытных животных становится существенно выше. Более того, Ki-67-позитивные клетки (т.е. пролиферирующие клетки) у опытных животных формируют отчетливые тангенциально направленные «треки», чего не наблюдается у контрольных крыс. Вдобавок, у экспериментальных животных, в отличие от контрольных, в очаге ишемии и вокруг него наблюдаются массивные скопления пролиферирующих клеток (Рис. 10).

Рис. 10. Стимуляция пролиферации резидентных клеток СВЗ (окрашивание антителами к Ki-67). А - СВЗ контроль; Б - СВЗ опыт; В - путь миграции контроль; Г - путь миграции опыт; Д - периинфарктная зона контроль; Е - периинфарктная зона опыт.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод мечения МСК плаценты человека магнитными флуоресцентными микрочастицами, обеспечивающий 90%-ую эффективность мечения и не влияющий на основные характеристики клеток в культуре - скорость пролиферации, способность к нейрогенной дифференцировке и жизнеспособность.

2. При интраспинальном введении животным с травмой спинного мозга меченые МСК активно мигрируют в спинном мозге в ростральном, каудальном и вентральном направлениях. Некоторое количество клеток обнаруживается в зубчатой извилине гиппокампа головного мозга.

3. При внутривенном введении меченых человеческих МСК крысам с экспериментальным ишемическим инсультом, в течение первых суток после трансплантации они обнаруживаются во всех паренхиматозных органах. В течение 2 недель после трансплантации меченые МСК проникают в ткань головного мозга, формируют треки миграции, начинающиеся от кровеносных сосудов, и обнаруживаются в зоне ишемии и в гиппокампе.

4. Интраспинальная трансплантация МСК плаценты человека мышам с травмой спинного мозга способствует трехкратному улучшению локомоторной функции задних конечностей по шкале BMS.

5. В тестах «Открытое поле» и «Крестообразный лабиринт» в опытной группе животных с ишемическим инсультом статистически достоверное улучшение показателей неврологического статуса (по сравнению с контрольными животными) происходит уже на 7 сутки после операции, подобная тенденция сохраняется на протяжении всего эксперимента.

6. По данным МРТ, вследствие трансплантации человеческих МСК крысам с ишемией мозга, размер очага ишемии существенно уменьшается к 7 суткам, а через месяц у опытных животных объем очага поражения уже в 10 раз меньше, чем у контрольных животных.

7. Человеческие плацентарные МСК, трансплантированные мышам со спинальной травмой и крысам с экспериментальным ишемическим инсультом, в единичных случаях проявляют признаки неполной видоспецифичной нейрональной дифференцировки.

8. Положительные эффекты трансплантированных МСК связаны не с замещением погибших клеток реципиента трансплантированными клетками, а в большей степени с паракринной стимуляцией собственных репаративных процессов, в частности, с усилением миелинизации нервных проводников при спинальной травме и с активацией пролиферации эндогенных нейральных стволовых клеток в субвентрикулярной зоне животных с экспериментальным ишемическим инсультом и их миграции в очаг поражения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Количество магнитных флуоресцентных микрочастиц (Bangs laboratories, Inc., США), использующихся для мечения мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека должно составлять не более 5 мкл стоковой суспензии на 1 мл культуральной среды.

2. Перед внутривенным введением животным человеческих плацентарных МСК клетки необходимо тщательно суспендировать, а для инъекции использовать катетер с фильтром, во избежание окклюзии сосудов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Губский Л.В., Учеваткин А.А., Леденев В.В., Таирова Р.Т., Чеглаков И.Б., Цебоева А.А., Бурунова В.В., Ярыгин К.Н., Ярыгин В.Н., Скворцова В.И. Изучение влияния мезенхимальных стволовых клеток, меченых микрочастицами оксида железа в декстрановой оболочке на экспериментальных моделях ишемического инсульта у крыс // Сб. материалов 9-го международного семинара по магнитному резонансу. Ростов-на-Дону, 2008. Стр. 76-77.

2. Скворцова В.И., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н., Пирогов А.Ю., Губский Л.В., Поварова О.В., Цебоева А.А., Таирова Р.Т. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на течение экспериментального ишемического инсульта у крыс // Сб. материалов научно-практической конференции "Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины". Москва, 2008. Стр. 90-91.

3. Ярыгин К.Н., Чеглаков И.Б., Кониева А.А., Бурунова В.В., Таирова Р.Т., Губский Л.В., Каралкин П.А., Лупатов А.Ю., Шрагина О.А., Черкезов Я.А. Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований в области клеточных технологий // Сб. материалов Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Москва, 2008. Стр. 159.

4. Gubskiy L., Tairova R., Pirogov Yu.A., Ceboeva A.А., Burunova V.V., Yarygin K.N., Yarygin V.N., Skvortsova V.I. The influence of intravenous introduction mesenchymal stem cells marked by ultra small particles of iron oxide at infarct in rats // International Journal of Stroke. 2008. Vol. 3, suppl. 1. 6th World Stroke Congress, Vienna, Austria: Abstract PO01-297.

5. Yarygin K.N., Kholodenko I.V., Konieva A.A., Burunova V.V., Tairova R.T., Gubsky L.V., Pirogov Yu.A., Yarygin V.N., Skvortsova V.I. Mechanisms of beneficial effects of human placenta MSC transplantation in rats with experimental ischemic stroke // Second annual Stem Cells & Regenerative Medicine Europe conference. Edinburgh , 2009. P. 276.

6. Ярыгин К.Н., Холоденко И.В., Кониева А.А., Бурунова В.В., Таирова Р.Т., Губский Л.В., Чеглаков И.Б., Пирогов Ю.А., Ярыгин В.Н., Скворцова В.И. Механизмы положительного влияния трансплантации МСК плаценты человека на восстановление крыс после экспериментального ишемического инсульта // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009, т. 148, № 12, С. 699-702.

7. Скворцова В.И., Ярыгин В.Н., Пирогов Ю.А., Ярыгин К.Н., Губский Л.В., Таирова Р.Т., Холоденко И.В., Кониева А.А., Бурунова В.В. Хоуминг-эффект мезенхимальных стволовых клеток на модели острой фокальной ишемии мозга у крыс // Сб. материалов Российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение». Пятигорск, 2010. Стр. 41.

Размещено на Allbest.ru