Изучение роли митотической киназы Aurora А в развитии наследственной поликистозной болезни почек человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Изучение роли митотической киназы Aurora А в развитии наследственной поликистозной болезни почек человека

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

кандидата биологических наук

Плотникова Ольга Викторовна

Москва, 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцентРихард Вольдемарович Лацис

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Татьяна Клеониковна Дубовая

кандидат биологических наук Анастасия Петровна Григоренко

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «30» ноября 2009 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан «26» октября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор А.И. Щёголев

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования. Поликистозная болезнь почек (ПБП) ? врождённое заболевание человека, характеризующееся образованием и ростом множественных кист в обеих почках. ПБП связана с нарушением дифференцировки и пролиферации эпителиальных клеток в собирательных канальцах почек. В норме эпителий канальцев почек относится к типу медленно обновляющихся клеточных популяций, характеризующихся очень низким темпом пролиферации, и представленных долгоживущими клетками, участвующими преимущественно в реабсорбции питательных веществ во внутриканальцевые капилляры. При ПБП начинается неконтролируемая пролиферация эпителия собирательных канальцев почек, сопровождающаяся утратой клетками поляризации и нарушением дифференцировки, что неизбежно приводит к формированию кист. Молекулярный механизм таких нарушений дифференцировки и как следствие формирования кист во многом не изучен, и в настоящее время лечение ПБП остается только симптоматическим, заключающимся в коррекции проявлений болезни (Игнатова М.С. и др., 1996, Harris P. et al., 2009, Igarashi P. et al., 2002).

ПБП развивается в случаях появления инактивирующих мутаций в генах PKD1 или PKD2, кодирующих трансмембранные белки полицистин-1 и полицистин-2, соответственно. Полицистин-1 является интегральным мембранным белком, который связывается с кальциевым каналом, сформированным из шести субъединиц белка полицистина-2, образуя комплекс, контролирующий дифференцировку и пролиферацию клеток почечного эпителия в сенсорном сигнальном пути (Harwood L et al., 2004). Показано, что комплекс полицистина-1 и полицистина-2 локализуется в плазмолемме первичных ресничек (Bae Y. et al., 2006). Неподвижная первичная ресничка представляет собой выдающеюся в просвет канальца покрытую цитоплазматической мембранной органеллу. В ее основании находится базальное тело, а собственно ресничка образована девятью дуплетами периферических микротрубочек без двух центральных (в отличие от классической реснички, у которой обязательно присутствует центральный дуплет). Есть все основания полагать, что первичные реснички, находящееся на поверхности почечных эпителиальных клеток, являются механосенсорными органеллами, которые инициируют широкий спектр передачи Са²⁺-опосредованных регуляторных сигналов, причем в данном случае реснички «отслеживают» скорость тока мочи через канальцы и собирательные трубочки. В результате воздействия на первичную ресничку механических стимулов происходит инициация входа Са²⁺ в цитоплазму, что запускает каскад сигналов, регулирующих пролиферацию клеток (Nauli S. et al., 2004). При вступлении клетки в митоз происходит потеря первичной реснички благодаря тому, что базальное тело, находящееся в ее основании, учавствует в формировании центросомы (диплосомы) (Marshall W. et al., 2008). Было показано, что одним из признаков опухолевых или трансформированных клеток как раз является потеря первичной реснички. Эти и другие данные, демонстрирующие, что в первичной ресничке локализовано большое количество таких митотических белков, как семейство NEK-киназ, участвующих в регуляции митоза, позволяет предположить, что первичная ресничка играет важную роль в регуляции клеточного цикла. Более того, полученные в последние годы данные указывают, что развитие ПБП часто сопровождается утратой первичной реснички почечным эпителием (Plotnikova O. et al., 2008).

Таким образом, нарушение функционирования или полная потеря первичной реснички, сопровождающаяся нарушением восприимчивости почечного эпителия к току мочи и нарушением гомеостаза Са²⁺, способствует расстройству регуляции клеточного цикла, что ведет к неконтролируемой пролиферации клеток и формированию кист. Хотя этапы гистогенеза кист изучены достаточно подробно, остаются неясными вопросы, связанные с механизмом нарушения контроля пролиферации и дифференцировки эпителия почечных канальцев. В настоящее время картина молекулярных механизмов, контролирующих функции дифференцированных клеток в почке постепенно проясняется. Интересно, что Aurora A (AurA) хорошо изученная как митотическая киназа, располагающаяся на полюсах веретена деления начиная с профазы и до окончания телофазы и участвующая в регуляции клеточного цикла (Bolanos-Garcia V. et al, 2005) может являться одним из ведущих белков, контролирующих пролиферацию почечного эпителия. Ген АurA картируется в областях хромосом, часто нарушаемых при опухолях (например, 20q13.2-q.13.3) и избыточно экспрессируется во многих первичных опухолях. Избыточная экспрессия или несвоевременная активация киназы AurA вызывает нарушение регуляции прохождения клетки по клеточному циклу, что сопровождается увеличением количества центросом и анеуплоидией, в отдельных случаях ведущих к трансформации клеток млекопитающих (Katayama H. еt al., 2003). Следует отметить, что одним из начальных этапов развития кист является как раз нарушение в регуляции нормальной пролиферации клеток с появлением мультицентросомных клеток с последующим изменением их структуры (Burtey S. et al., 2008), что, скорее всего, может свидетельствовать о существенной роли киназы AurA в этих процессах. Недавно было обнаружено, что киназа AurA локализована в базальном теле первичной реснички и была показана ее ключевая роль в инициации разборки и последующей потери клеткой этой структуры (Pugacheva E. et al., 2007). Выше описанная роль киназы AurA в инициации разборки первичной реснички и регуляции клеточного цикла позволяет нам рассматривать киназу AurA как новый маркер ПБП, которая, безусловно вовлечена в патогенез ПБП.

Цель исследования. Изучение роли митотической киназы Аurora А в нарушении пролиферации клеток почечного эпителия при развитии наследственной поликистозной болезни почек человека.

Задачи исследования:

1. Продемонстрировать локализацию киназы AurA в нормальной почечной ткани и изучить возможность гиперактивации киназы AurA у больных поликистозной болезнью почек с использованием иммуногистохимических методов.

2. Выбрать модель, позволяющую изучать роль киназы AurA в регуляции полицистинов, белков, мутированных при ПБП, с применением биохимических методов, и приемлемую для дальнейших функциональных исследований.

3. Ответить на вопросы: взаимодействует ли киназа AurA с полицистином-1 и полицистином-2 и регулирует ли их активность путем фосфорилирования?

4. Оценить функциональную значимость взаимодействия AurA с полицистинами и показать роль ингибитора AurA в регуляции этих белков.

Научная новизна работы. Работа содержит новые данные о роли киназы AurA в ПБП. AurА известна как киназа, участвующая в регуляции митоза и прохождения клеткой через G2/M фазы клеточного цикла. Ранее не было известно о локализации киназы AurA в клетках почечного эпителия и, тем более, не была изучена роль этой киназы в ПБП. В данной работе впервые показано, что уровень активированной путем фофсорилирования киназы AurA повышен в эпителии, выстилающем просвет кист у больных ПБП в отличие от интактного эпителия. Выявлен механизм участия киназы AurA в нарушении регуляции пролиферации почечного эпителия, что является одной из первичных причин формирования кист при ПБП.

В данном исследовании было обнаружено, что AurA может рассматриваться как один из ключевых белков, вовлеченных в патогенез ПБП, ингибирование этой киназы может являться потенциальным и эффективным терапевтическим подходом в лечении ПБП.

Практическая значимость диссертации. При отсутствии терапевтических средств для лечения ПБП, в настоящее время активно ведется поиск и изучение белков, вовлеченных в процесс нарушения клеточной пролиферации при формировании кист у больных ПБП. В данной работе была установлена новая роль киназы AurA в развитии данной патологии и показано, что в эпителии кист уровень фосфорилирования киназы AurA повышен у больных ПБП. Также было продемонстрировано, что использование ингибиторов AurA ведет к восстановлению нарушенного гомеостаза кальция при ПБП, что может способствовать ингибированию пролиферации кистозного эпителия. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о потенциальной возможности использования ингибиторов киназы AurA в качестве терапевтических агентов в лечении ПБП. гиперактивация киназа поликистозный почка

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований и ряд примененных в работе методов внедрены в учебный процесс на кафедре молекулярной биологии и биотехнологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Апробация результатов диссертационной работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: “13th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference” (Филадельфия, США, 2008), “Forefronts Symposium on Polycystic Kidney Disease” (Монреаль, Канада, 2008), “The American Society for Cell Biology, 48th Annual Meeting” (Сан-Франциско, США 2008), “14th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference” (Филадельфия, США, 2009), II Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-биологов “Симбиоз Россия 2009” (Пермь, 2009), 13-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), “The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting” (Сан-Диего, США 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 171 источник (6 отечественных и 165 зарубежных). Работа содержит 43 рисунка.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. В исследовании использовались образцы тканей почек, полученных от 25 здоровых людей и от 25 больных с диагнозом «наследственная поликистозная болезнь почек» либо после смерти, либо при биопсии почек. Возраст пациентов варьировал от 20 до 40 лет. Образцы были получены из Национальной коллекции тканей и органов (NDRI, США).

В данной работе были использованы клеточные культуры HEK-293, НК2 и кистозные эпителилальные клетки. HEK-293, эмбриональные клетки печени человека (ATCC, США) и кистозные эпителилальные клетки, полученные от больных ПБП, культивировали на пластиковых чашках Петри (Corning, США) в стандартной среде DMEM (Gibco, США), содержащей 10% бычьей сыворотки (Invitrogen, США). НК2, почечные эпителиальные клетки человека, полученные из эпителия проксимальных канальцев (АТСС, США), культивировали в среде GIBCO Keratinocyte-SFM (Invitrogen, США).

Методы исследования. Иммунохимическое окрашивание для выявления тотальной и фосфорилированной киназы AurA у больных ПБП и здоровых индивидов проводили на депарафинированных срезах образцов тканей почек с использованием моноклональных антител, против киназы AurA или только к ее фосфорилированной форме (Bethyl, США). Микроскопическое исследование образцов проводили на микроскопе Nikon Eclipse E600 (Nikon, Япония).

Трансфекцию клеток НЕК-293 проводили с использованием плазмидных векторов, несущих гены AurА, PKD1 и PKD2 и с совместным использованием реагентов Lipofectamine и Reagent plus в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen, США).

Изучение взаимодействия AurA и полицистина-1 и 2 проводилось методом непрямой коиммунопреципитации с последующим разделением белков на полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях и проведением Вестерн Блота. Белки выявляли методом усиленной хемилюминесценции (ECL, Pierce Biotechnology, США).

Для проведения киназной реакции in vitro была использована рекомбинантная киназа AurA (Millipore, США), а в качестве субстрата, коньюгированные с глютатион S-трансферазой (GST) С-терминальные домены белков полицистин-1 и 2, выделенные из E. coli линии BL21. В качестве отрицательного контроля на специфичность фосфорилирования использовали белок GST. Фосфорилирование рекомбинантных белков in vitro проводили в течение 30 мин при 37°C в реакционной смеси объемом 50 мкл, содержащей реакционный буфер, 37 кБк [-³²P]АТФ, 1 мкг киназы AurA (1711 ед/мг) и 1 мкг одного из двух субстратов. Пробы наносили на гель и после электрофореза в ПААГ гель экспонировали с рентгеновской пленкой.

Иммунофлюоресцентный анализ для выявления различных участников изучяеммых процессов проводили по единой схеме: клетки выращивали на покровных стеклах клеток. После фиксации 4%-ным формалином клетки окрашивали сначала первичными антителами, а затем - вторичными. ДНК окрашивали красителем DAPI (4 мкг/мл). Образцы анализировали при помощи конфокального микроскопа Nikon C1 Spectral с объективом Iris 100x/1.4 или 40x/1.3 (Nikon, США).

Для измерения внутриклеточного кальция клетки выращивали на покровных стеклах в течение 2-х суток, затем нагружали флюорисцентным зондом Fluo-4AM (Invitrogen, США) и помещали в перфузионную камеру (FC2, Bioptechs, США). Освобождение Ca²⁺ из эндоплазматического ретикулума инициировалось добавлением в перфузионную камеру 100 нМ аргинин-вазопресcина (Sigma, США). Уровень Ca²⁺ в клетках измеряли по флуоресценции зонда Fluo-4AM с помощью конфокального микроскопа Nikon C1 Spectral (Nikon, Япония). Для анализа и статистической обработки результатов использовали программы Метаморф и Метафлоу (Metamorph and Metafluor softwares (Molecular Devices, США)). Во всех случаях достоверными считались различия при Р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение:

1. Присутствие киназы AurA в почечном эпителии. Киназа AurА известна как киназа, участвующая в регуляции митоза и прохождения клеткой по клеточному циклу (Andrews P.D. et al., 2003). Недавно было показано, что у пигментных клеток ретины человека киназа AurА сконцентрирована в базальном теле в основании первичной реснички, и что ее активация ведет к разборке первичной реснички (Pugacheva E.N. et al., 2007). Ранее не было известно о локализации киназы AurA в клетках почечного эпителия и, тем более, не была изучена роль этой киназы в ПБП.

Иммуногистохимические исследования показали наибольшую концентрацию киназы AurА в проксимальных, дистальных и собирательных канальцах здоровых почек человека (Рис. 1А, верхняя панель). В то же время уровень активированной путем аутофосфорилирования киназы AurА (P-AurA) (Рис. 1А, нижняя панель) значительно снижен по сравнению с уровнем общего белка AurA. В качестве контроля специфичности антител к общей киназе AurА данные антитела инкубировали с блокирующим пептидом, который был использован для продукции антител против киназы AurА при иммунизации кролика, и наблюдали полное блокирование гистохимического окрашивания канальцев здоровых почек человека. Иммуногистохимический анализ образцов почечных тканей, полученных от пациентов с ПБП (Рис. 1Б, верхняя панель) показал, что киназа AurА присутствует в значительном количестве в видоизмененном эпителии почечных кист. Наблюдается также повышение количества активированной P-AurA в эпителии кист срезов, полученных от больных ПБП (Рис. 1Б, нижняя панель).

Рисунок 1. Иммуногистохимическое выявление киназы AurA и ее фосфорилированной формы (Р-AurA) в почечном эпителии человека. А,Б - срезы почечной ткани, полученные от здорового человека и больного ПБП, соответственно.

Таким образом, повышенное количество активированной киназы Aur A в эпителии, почечных кист по сравнению с морфологически нормальным эпителием почек указывает на ее возможную роль в индукции неконтролируемой пролиферации эпителия, что в свою очередь, ведет к образованию кист.

2. Выбор модели, позволяющей изучать роль киназы AurA в регуляции полицистинов. На сегодняшний день известно, что AurA участвует в активации митотических белков в процессе инициации прохождения клетки по фазам клеточного цикла. Но исследования последних лет продемонстрировали важную роль AurA в индукции разборки первичной реснички (Pugacheva E. et al., 2007). Известно, что на поверхности эпителиальных почечных клеток человека находится первичная ресничка, которая выдается в просвет канальца, где она играет роль механосенсора тока мочи и участвует в поддержании нормального пролиферативного состояния эпителия почки. Соответственно, одним из главных критериев выбора клеточной модели для исследования ПБП являлось присутствие первичной реснички на поверхности почечных клеток. После анализа различных почечных клеточных линий мы остановили свой выбор на линии НК2 - эпителиальные почечные клетки человека (Ryan, M. et al., 1994). Мы показали, что эти клетки формируют первичную ресничку при достижении 100% конфлюентности или после 48 часов роста в бессывороточной среде (Рис. 2А). Более того, методом непрямой иммунофлуоресценции мы выявили, что почечный белок, полицистин-1, функции которого нарушены при ПБП, локализован в первичной ресничке этих клеток (Рис. 2В). В то же время киназа AurA присутствует в базальном теле первичной реснички (Рис. 2Б).

Рисунок 2. Иммунофлуоресцентное выявление первичной реснички в клетках НК2 и локализованных в ней белков: AurA и РС1. А - Окрашивание первичной реснички антителами против ацетилированного тубулина (AcTub). Б - Локализация AurA в базальном теле первичной реснички. В - локализация РС1 в первичной ресничке. DAPI - окрашивание ДНК, Merge - совмещение всех 3-х маркеров, масштаб - 20 мкм.

3. Связывание и фосфорилирование киназой AurA С-терминального (СТ) домена почечного белка полицистина-1 (РС1). Было исследованно возможное участие киназы AurА в регуляции РС1 - интегрального мембранного белка, локализованного в первичной ресничке, мутации или нарушении функции которого ведут к развитию ПБП (Cai Y. et al.,. 1999). Поскольку киназа AurА является цитоплазматическим белком, была изученна возможность связывания AurА с цитоплазматическим СТ доменом РС1. С этой целью мы клонировали кДНК киназы AurA и СT домена РС1 в плазмидные векторы для экспресии данных генов в клетках млекопитающих. Затем полученные конструкции были временно трансфецированы в культуру почечных клеток человека НК2. После проведения коиммунопреципитации с антителами к AurА и последующего иммуноблотинга белков преципитата с антителами против Flag-эпитопа, прикрепленного к СТ домену РС1, мы наблюдали, что киназа AurА действительно образует комплекс c СТ доменом РС1 (Рис. 3А).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 3. А. Коиммунопреципитация СТ домена РС1 с киназой AurA. Верхняя панель иммунноблотинг СТ домена РС1 (РС1-СТ) после коиммунопрецепитации (КИП) с киназой AurA (левая дорожка), правая, контроль специфичности коиммунопреципитации, где вместо СТ домена РС1 была взята пустая плазмида. Нижняя панель - детекция киназы AurA в клеточных лизатах (КЛ) методом иммуноблотинга. Б. Фосфорилирование киназой AurA СТ домена РС1 in vitro. Верхняя панель радиоавтограф (Р³²) после разделения в ПААГ продуктов киназной реакции с использованием в качестве субстратов РС1-СТ (левая дорожка) или белка GST (негативный контроль) (правая дорожка). Средняя и нижняя панели окрашивание белков реакционной смеси после разделения в ПААГ кумаси синим (КМ). Указаны размеры маркера молекулярной массы в килодальтонах.

AurA является серин-треониновой киназой, регулирующей белки путем их фосфорилирования (Walter A. et al., 2000). С целью изучить возможность регуляции РС1 киназой AurA путем фосфорилирования, мы провели киназный анализ in vitro с использованием рекомбинантной киназы AurA и рекомбинантного СТ домена РС1 в качестве субстрата. Показано, что киназа AurA фосфорилирует in vitro СТ домен РС1, но не белок GST, использованнный в качестве негативного контроля на специфичность фосфорилирования (Рис. 3Б, верхняя панель).

Таким образом, с помощью коиммунопреципитации и киназной реакции in vitro мы показали, что киназа AurA связывает и фосфорилирeут РС1, белок, нарушение функции которого ведет к развитию ПБП.

4. Создание модели для изучения регуляции киназой AurA функции кальциевого канала, образованного полицистином-2 (РС2). Помимо мутаций гена PKD1, приводящих к развитию ПБП, были так же обнаружены мутации и в гене PKD2, кодирующего белок полицистин-2 (РС2). РС2 локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), где функционирует как кальциевый канал, через который происходит освобождение запасов Са²⁺ из ЭР в цитоплазму клетки в ответ на различные внеклеточные стимулы, в том числе на ростовые факторы. Таким образом, белок РС2 играет важное значение в контроле дифференцировки и пролиферации клеток почечного эпителия. Было показано, что активация кальциевого канала РС2 происходит при стимуляции клеток млекопитающих различными соединениями, вызывающими увеличение внутриклеточного кальция. Наиболее часто для активации РС2 in vitro используют пептидный гормон аргинин- вазопрессин (AVP). В данной работе для дальнейшего изучения регуляции функции РС2 был разработан метод измерения цитоплазматического Са²⁺ на модели выше описанной клеточной линии НК2, экспрессиирующей экзогенный РС2 (Рис. 4).

Клетки линии НК2 сажали на покровные стекла и на следующий день трансфецировали плазмидой, несущей ген PKD2 или контрольной «пустой» плазмидой. Затем клетки инкубировали с флюорисцентным зондом Fluo-4AM, связывающим цитоплазматический Са²⁺ и помещали в перфузионную камеру. Измерения проводились с использованием конфокального микроскопа, сначала измерялась базальная флюоресценция до добавления AVP (F₀), затем регистрировалось AVP-индуцированное изменение флюоресценции со временем, отражающее высвобождение Са²⁺ через канал РС2 (F₁). Разработанный выше подход для клеток линии НК2 в дальнейшем был использован для анализа регуляции функции РС2 киназой AurA.

Рисунок 4. Модель изучения регуляции внутриклеточного уровня Са²⁺ в почечных клетках. На графике: F₀ - базальная и F - AVP-индуцированная флюоресценция. На панели: флюоресценция клеток, трансфецированных либо плазмидой для экспрессии PKD1 или пустой плазмидой (mock) до (-AVP) или после (+AVP) добавления стимулятора AVP.

5. Киназа AurA негативно регулирует кальциевый канал РС2, понижая содержание Са²⁺ в цитоплазме. В результате анализа клеточных линий из кист, полученных от больных ПБП, было выявлено снижение уровня цитоплазматического Ca²⁺ в эпителии кист, что играет большую роль в нарушении регуляции клеточного цикла этих клеток, ведущее к нарушению механизмов их пролиферации (Anyatonwu G. et al., 2004).

В данной работе мы продемонстрировали, что активация киназы AurA может стимулироваться увеличением уровня цитоплазматического Са²⁺. Например, добавление AVP, активирующего РС2 и вызывающего освобождение Са²⁺ в цитоплазму вызывает увеличение активированной путем фосфорилирования AurA в НК2 клетках. Следовательно, можно предположить, что киназа AurA играет роль в поддержании гомеостаза Са²⁺ через регуляцию кальциевого канала РС2. С целью проверить данную гипотезу, мы воспользовались описанной выше моделью, дополнительно трансфецировав плазмиду для экспресии гена AurA в клетки НК2, и затем измерили AVP-индуцированное освобождение Са²⁺ через канал РС2 в цитоплазму. Результаты экспиремента выявили, что избыточная экспрессия AurA к клетках НК2 приводит к снижению выброса Са²⁺ через канал РС2, что способствует понижению цитоплазматического Са²⁺ (Рис. 5А). Затем мы провели аналогичный эксперимент, только вместо увеличения уровня киназы AurA в клетках она была инактивирована путем обработки клеток ингибитором AurA PHA-680632 (Nerviano Medical Sciences Srl, США) (Рис. 5Б). Надо заметить, что согласно с полученными в этой работе результатами, уровень активной киназы AurA увеличен в кистозном эпителии больных ПБП. Соответственно, мы продемонстировали, что черезмерная активация киназы AurA может приводит к резкому уменьшению выброса Са²⁺ через канал, образованный полицистином-2, и нарушению гомеостаза Са²⁺, что характерно для эпителия кист. В то же время ингибирование киназы AurA увеличивает активность кальциевого канала, ведущее к повышению уровня Ca²⁺ в клетке.

Рис. 5 AurA негативно регулирует РС2-зависимое освобождение Ca²⁺. А. Измерение Са²⁺ в клетках НК2, трансфецированных плазмидами для экспрессии РС2 или для совместной эксрпрессии РС2 и AurA (левая панель). Б. Клетки НК2, трансфецированные либо плазмидой для экспрессии РС2 либо «пустой» контрольной плазмидой (mock). Измерение Са²⁺ проводилось после преинкубации клеток либо с ингибитором AurA РНА-680632 (РНА) либо с контрольным вещестов, использованным для растворение РНА (DMSO) (левая панель). Иммуннофлюорисцентный сигнал был измерен до и после добавления AVP (момент добаления AVP отмечен стрелкой). Данные представлены в виде зависимости отношения F/F₀ от времени, где F₀ - базальная флуоресценция до добавления стимулятора. Для обоих графиков была подсчитана амплитуда флуоресцентного сигнала А(F/F₀) (правая панель).

6. Киназа AurA взаимодействует с РС2 и регулирует его путем фосфорилирования. С целью понять, каким образом происходит регуляция киназой AurA канала РС2, мы провели эксперименты, позволяющие изучить возможность связывания AurA с РС2 и его регуляции путем фосфорилирования. Методом коиммунопреципитации и последующего денатурирующего ПААГ электрофореза и Вестерн блоттинга было показано, что AurA взаимодействует с РС2 в клетках НК2 (Рис. 6А).

Рисунок 6 А. Коиммунопреципитация СТ домена полицистина-2 с киназой AurA. Верхняя панель иммунноблотинг РС2 после коиммунопрецепитации (КИП) с киназой AurA (левая дорожка), правая, контроль специфичности коиммунопреципитации, где вместо антител против AurA использавались неспецифические иммуноглобулины. Нижняя панель - детекция киназы AurA в клеточных лизатах (КЛ). Б. Фосфорилирование киназой AurA СТ домена РС2 in vitro. Верхняя панель радиоавтограф (Р³²) после разделения в ПААГ продуктов киназной реакции с использованием в качестве субстратов РС2-СТ дикого типа (WT) (левая дорожка) или c мутацией S829A (правая дорожка). Средняя и нижняя панели окрашивание белков реакционной смеси после разделения в ПААГ кумаси синим (КМ). Указаны размеры маркера молекулярной массы в килодальтонах.

AurА, являясь серин/треониновой протеин киназой, обычно регулирует белки путем их фосфорилирования в стандартном консесусном мотиве R/K/N-R-x-S/T-В (x-любая аминокислота, В - любая аминокислота за исключением пролина) (Ferrari S. et al, 2005). Такой мотив был обнаружен на С-терминальном (СТ) домене полицистина-2 PRGSI (S=S829). Для подтверждения, возможности фосфорилирования киназой AurA РС2 в этом мотиве, мы провели киназный анализ in vitro с использованием рекомбинантной киназы AurA и рекомбинантного СТ домена PC2 в качестве субстрата. Показано, что киназа AurA фосфорилирует in vitro СТ домен РС2 дикого типа (WT), но не СТ домен РС2 с введенной мутацией в данный сайт фосфорилирования (S829A). Следовательно, мы показали, что киназа AurA негативно регулирует функцию кальциевого канала РС2 путем связывания с ним и фосфорилирования его СТ домена в сайте S829 (Рис. 6Б).

7. Изучение приложения ингибитора киназы AurA в терапии ПБП. На данный момент нет эффективных лекарственных средств для лечения ПБП. Как уже было показано, мутации в генах PKD1 и PKD2 ведут к уменьшению функциональной активности кальциевого канала РС2 и уменьшению содержания Са²⁺ в цитоплазме. (Igarashi P. et al., 2002). Соответственно, продемонстрированная нами способность ингибитора AurA увеличивать активность РС2, может найти приложение в терапии ПБП.

С целью продемонстрировать, что ингибитор AurA оказывает активирующий эффект на кальциевый канал РС2 в физиологическом контексте, мы использовали две кистозные клеточные линии, полученные из эпителия кист больных ПБП (Loghman-Adham M. et al., 2003). Одна клеточная линия была получена от больного, несущего мутацию Q2556X в гене PKD1, вторая от больного ПБП с мутацией A1302S в том же гене. В результате проведения измерения базального уровня Са²⁺ в данных клеточных линиях, предварительно обработанных ингибитором киназы AurA РНА-680632, мы обнаружили, что ингибирование AurA ведет к повышению в них уровня внутриклеточного Са²⁺ (Рис. 7).

Рисунок 7. Ингибитор AurA РНА-680632 (РНА) повышает базальный уровень Са²⁺ в кистозных эпетелиальных клетках, полученных от больных ПБП. Левая панель: пример измерения базального уровня Са²⁺, преобладание темного цвета отражает более низкий уровень Са²⁺ в клетке, а его повышение отражается переходом от темного к светлому. Правая панель - представление измерения уровня внутриклеточного Са²⁺ в виде гистограммы, в качестве контроля использовался DMSO, который служил растворителем для РНА. F - интенсивность флуорисценции Са²⁺-связывающего зонда Fluo-4AM, F₀ - фоновая флуоресценция. РНА-680632 (РНА) - ингибитор AurA.

В результате изучения развития ПБП у экспериментальных животных и людей было выявлено, что потеря или редукция длины первичной реснички ведет к развитию кист (Pan J. et al., 2005). Соответственно, нарушение интегральной функции полицистинов, участвующих в регуляции механосенсорных функций реснички, ведет к утрате контроля восприимчивости почечным эпителием потока мочи, что в свою очередь способствует нерегулируемой пролиферации эпителия и в конечном итоге приводит к формированию кист. Недавно была показана новая ключевая роль киназы AurA в инициации разборки и последующей потери клеткой первичной реснички (Pugacheva E. et al., 2007). Исходя из этих данных мы изучили возможность воздействия путем ингибирования AurA на количество и длину первичных ресничек на поверхности выше описанных кистозных клеток, полученных от больных с ПБП. Иммунофлуоресцентный анализ этих клеток показал, что они имеют то же количество первичных ресничек, что и нормальная клеточная линия НК2, но их длина значительно сокращена (Рис. 8).

Рисунок 8. Выявление первичных ресничек методом иммунофлуоресценции в нормальных почечных клетках НК2 и кистозных клетках, полученных от больных с ПБП. Для детекции ресничек использовали антитела к их структурному белку, ацитилированному тубулину. Масштаб - 20 мкм. Первичные реснички отмеченны стрелками.

В связи с этим результатом возник вопрос, может ли ингибирование активности AurA влиять на размер первичной реснички? Для этого мы инкубировали кистозные клетки с ингибитором AurA РНА-680632 в течение 24 часов и затем провели иммунофлуоресцентный анализ первичных ресничек на поверхности этих клеток. В параллельном контрольном эксперименте эти же клетки растили 24 часа в отсутствии ингибитора. В результате было показано, что ингибирование киназы AurA ведет к восстановлению нормальной длины первичной реснички (Рис. 9). Принимая во внимание описанную ранее роль AurA в разборке первичной реснички (Pugacheva E. et al, 2007) и устанновленное нами увеличение активности AurA в кистозных тканях, можно заключить, что черезмернно активированная AurA вносит вклад в укорочение первичной реснички. Соответственно, ингибирование киназы AurA способствует восстановлению нормальной длины первичной реснички.

Рисунок 9. Иммунофлуоресцентное выявление увеличения размера первичной реснички после обработки клеток ингибитором AurA РНА-680632. Антитела против ацетилированного тубулина (AcTub) - окрашивание реснички, DAPI - окрашивание ДНК, масштаб - 20 мкм (левая панель). Правая панель - график, отражающий длину первичной реснчки до (-РНА) или после (+РНА) обработки клеток ингибитором AurA PHA-680632 (PHA). Ось Y - длина первичной реснички (мкм).

Таким образом, используя почечные клетки из кист, мы показали, что применение ингибитора AurA способствует восстановлению таких нарушений при ПБП, таких как снижение уровня цитоплазматического Са²⁺ в клетках и изменение длины первичной реснички, что дает нам возможность рассматривать ингибиторы AurA как потенциальные терапевтические средства в лечении ПБП.

Заключение

Основываясь на изложенных выше наблюдениях, мы продемонстрировали, что киназу AurA можно рассматривать в качестве нового маркерного белка ПБП, который играет роль в патогенезе ПБП. Основным патологическим процессом, лежащим в основе формирования кист при ПБП, является инициация неконтролируемой пролиферации и нарушение дифференцировки в норме медленно размножающегося эпителия почечных канальцев (Harris P. et al., 2009, Igarashi P. et al., 2002). Тот факт, что в образцах почечной ткани, полученных от больных с ПБП, активированная киназа AurA представлена в большом количестве в эпителии, выстилающем просветы кист, указывает на ее возможную роль в индукции неуправляемой пролиферации эпителия и образовании кист. Киназа AurA регулирует прохождение клетки по клеточному циклу через активацию как циклинов B, так и циклин-зависимых киназ (CDK) (Andrews P. et al., 2003). Соответственно, повышение уровня активированной киназы AurA запускает каскад реакций, ведущих к гиперфосфорилированию и активации циклинов, что в свою очередь ведет к запуску неконтролируемой пролиферации клеток через активацию соответсвующих CDK и нарушению регуляции вступления в митотическую фазу клеточного цикла, что может иметь место в почечном эпителии.

В исследованиях последних лет была показана важная роль первичной реснички в развитии ПБП. В ней локализовано множество митотических белков и эта органелла играет важную роль в регуляции клеточного цикла. Было выявлено, что повышение киназной активности фосфорилированной киназы AurA ведет к разборке первичной реснички (Pugacheva et al., 2007), что также может иметь место в эпителии кист больных ПБП. С другой стороны, первичные реснички выполняют как роль механосенсоров, улавливающих ток мочи в почечных канальцах и участвующих в регуляции диаметра просвета канальца, так и поддерживающих нормальный уровень пролиферативной активности почечного эпителия. Белок полицистин-1, встроенный в плазмолемму первичной реснички, функционирует как механосенсорный рецептор, который улавливает сигналы тока мочи, движущейся через канальцы, и является источником сигналов, контролирующих пролиферацию клетки (Nauli S. et al., 2004). В соответствии с нашими данными, гиперактивация киназы AurA в эпителии кист увеличивает уровень фосфорилированного полицистина-1, что может быть одной из главных причин изменения функционирования эпителия и его неспособности нужным образом реагировать на изменения потока мочи, что сопровождается нарушением регуляции диаметра канальца с последующей инициацией пролиферации почечного эпителия.

Рисунок 10. Роль киназы AurA в развитии ПБП человека.

Далее мы показали, что цитоплазматическая киназа AurA негативно регулирует кальциевый канал, образованный белком полицистином-2, трансмембранные домены которого пронизывают мембрану ЭР, что ведет к снижению выброса Са²⁺ из ЭР в цитоплазму. Поддержание постоянного гомеостаза Са²⁺ необычайно важно для обеспечения нормального пролиферативного состояния клеток почечного эпителия (Berridge M. et al., 2003). В частности, было зарегистрировано понижение уровня цитоплазматического кальция в клетках, выстилающих протоки кист у больных ПБП, что может быть связанно с гиперактивацией киназы AurA и угнетением функции кальциевого канала полицистина-2. Ниже представлена схема, обобщающая описанные в данной работе наблюдения (Рис. 10).

Выводы

1. Установлено, что киназа AurA присутствует в эпителии почечных канальцев у здоровых индивидов, однако содержание фосфорилированной киназы AurA в этом случае минимально. В эпителии, выстилающем просвет кист у больных ПБП по сравнению со здоровыми донорами, уровень фосфорилированной киназы AurA существенно повышен.

2. Отработана оптимальная модель на основе нормальных почечных клеток человека линии НК2, позволяющяя изучать роль киназы AurA в регуляции полицистина-1 и полицистина-2 в норме и в условиях, моделирующих патологию.

3. В норме активированная киназа AurA взаимодействует с полицистинами, регулируя их путем фосфорилирования. Гиперактивация киназы AurA приводит к резкому уменьшению выброса кальция через канал, образованный полицистином-2, что характерно для эпителия кист.

4. Ингибирование киназы AurA увеличивает активность кальциевого канала, препятствуя избыточному фосфорилированию полицистина-2, что способствует повышению уровня цитоплазматического кальция, пониженному в кистозном эпителии почек больных ПБП.

Практические рекомендации

Материалы диссертационной работы могут быть использованы для диагностических целей в практике лечебных учреждений при характеристики пролиферативных изменений, происходящих в кистозном эпителии при развитии ПБП. Описанная в данной работе способность ингибитора AurA корректировать такие патологические изменения при ПБП, как снижение уровня цитоплазматического кальция и редукции длины первичной реснички, может способствовать дальнейшему изучению приложения этого ингибитора в терапии ПБП.

Список сокращений

ПБП - поликистозная болезнь почек

ПААГ - полиакриламидный гель

ЭР - эндоплазмотический ретикулум

AcTub - ацетилированный б-тубулин (acetylated tubulin)

AurA - Aurora A

AVP - аргинин-вазопрессин (arginine vasopressin)

CDK - циклин-зависимые киназы (cyclin-dependent kinase)

DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол (4',6-diamidino-2-phenylindole) - краситель ДНК

GST - глутатион S-трансфераза (glutathione S-transferase)

NT - N -терминальный (N-terminal)

СТ - С-терминалтный (С-terminal)

РС1 - Полицистин-1 (polycystin-1)

РС2 - Полицистин-2 (polycystin-2)

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Olga Plotnikova and Erica Golemis. Roles for AurA and HEF1 as cilia-associated signaling regulators in PKD. Abstract book of «Fox Chase Cancer Center 13th Annual Postdoctoral and Graduate Student research Conference»; Philadelphia, USA. - 2008. - P. 70.

2. Erica Golemis, Olga Plotnikova and Elena Pugacheva. NEDD9, Aurora A, and PKD. «Abstract book of Forefronts Symposium on Polycystic Kidney Disease»; Montreal, Canada. - 2008. - P. 161.

3. Olga Plotnikova, Elena Pugacheva and Erica Golemis. Aurora A and HEF1 regulate polycystin 2. // The American Society for Cell Biology, 48th Annual Meeting, Meeting Abstracts. A supplement to Molecular Biology of the Cell; San Francisco. - 2008. - Volume 19. - P. 571.

4. Olga Plotnikova and Erica Golemis. Aurora A regulates polycystin 2 calcium channel activity. // Abstract book of «Fox Chase Cancer Center 14th Annual Postdoctoral and Graduate Student research Conference»; Philadelphia, USA. - 2009. - P.30

5. О.В. Плотникова, Э.А. Големис, Р.В. Лацис. Роль киназы Aurora A в развитии поликистозной болезни почек. // Сборник материалов конференции «Симбиоз Россия 2009», г. Пермь. - 2009. - С. 238.

6. О.В. Плотникова, Р.В. Лацис, Э.А. Големис. Киназа Aurora A и поликистозная болезнь почек. // Сборник материалов 13-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «биология - наука XXI века», г. Пущино. - 2009. - С. 36.

7. Olga Plotnikova, Elena Pugacheva and Erica Golemis. Aurora-A kinase regulates the PKD2 calcium channel. // The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting, Meeting Abstracts. A supplement to Molecular Biology of the Cell; San Diego. - 2009. - Volume 20. - P. 371.

8. О.В. Плотникова, Р.В. Лацис. Значение киназы Aurora A в развитии поликистозной болезни почек. // Вестник МГОУ. Серия: Естественные науки. - 2009. - № 4. - С. 77-80.

9. О.В. Плотникова, Р.В. Лацис, Э.А. Големис. Киназа Aurora A и поликистозная болезнь почек. // Вестник РГМУ. - 2009. - № 6. - С. 57-62.

10. Olga V. Plotnikova, Elena N. Pugacheva and Erica A. Golemis. Primary cilia and the cell cycle. // Methods in cell biology. - Elsevier Academic Press, San Diego. - 2009. - Volume 94. - Chapter 7. - P. 133-155.

Размещено на Allbest.ru