Изучение потенциальной роли криоконсервированных мезехимальных стромальных клеток плаценты в ингибировании нейродегенеративных изменений сетчатки при стрептозотоциновом диабете 2 типа по динамике изменений VEGF и BDNF

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изучение потенциальной роли криоконсервированных мезехимальных стромальных клеток плаценты в ингибировании нейродегенеративных изменений сетчатки при стрептозотоциновом диабете 2 типа по динамике изменений VEGF и BDNF

В современной офтальмологии возрастает интерес к использованию стромальных клеток для лечения заболеваний сетчатки [1]. В этом исследовании мы использовали криоконсервированные мезенхимальные стромальные клетки плаценты (кМСКП), так как плацента [2], содержит достаточное количество стромальных клеток. Также привлекательным является отсутствие этических проблем, поскольку плацента является побочным продуктом при нормальных родах [3].

Использование кМСКП для регенерации ретинальных клеток является одним из наиболее перспективных методов терапии заболеваний сетчатки. С прогрессом в изучении клеточных технологий кМСКП рассматриваются как перспективный источник замены клеток и нейропротекции. Некоторые факторы роста, участвующие в развитии клеток сетчатки могут иметь важное значение для дифференцировки МСК в клетки сетчатки. Эти молекулы включают в себя нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) и антиангиогенные нейротрофические факторы [4].

Цель данного исследования изучить динамику изменения BDNF и VEGF в сетчатке после трансплантации кМСКП крысам в лечении экспериментального стрептозотоцининдуцированного сахарного диабета 2 типа.

Молекулярнобиологические исследования проводилось в лаборатории Банка пуповинной крови, других тканей и клеток человека, г. Киев. Уровень экспрессии генов VEGF и BDNF определяли в образцах сетчатки глаз опытных животных.

Исследования проводили на модели сахарного диабета (СД) 2 типа, индуцированном стрептозотоцином и высококалорийной диетой, на половозрелых самцах лабораторных крыс линии Вистар [5]. Все манипуляции с животными проводились соответственно с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериметальных и научных целей» (Страсбург, 1986) и постановления IV Национального конгресса по биоэтике (Киев,2010).

Через семь дней после последней инъекции стрептозотоцина всех экспериментальных животных разделили на группы: контрольная, здоровые животные, получающие кМСКП (Н+кМСКП), животные с СД, получающие кМСКП (Д+кМСКП) и животные с СД получающие плацебо (Д+плацебо).

КМСКП вводили в/в в концентрации 1,1х10⁶ и интравитреально в концентрации 0,1х10⁶ здоровым животным и крысам с СД 2 типа, индуцированным высококалорийной диетой и стрептозотоцином.

Крысы группы «Д+плацебо» получали плацебо соответствующего объема по аналогичной схеме.

Криоконсевирование МСКП проводили соответственно с разработанной и запатентованой технологией [6].

Для определения уровня экспрессии генов VEGF и BDNF в препаратах сетчатки глаз крыс проводилось ПЦР в реальном времени (RT-PCR) [6].

Статистическую обработку полученных данных выполняли при помощи программы SPSS 21 для Windows XP, используя методы первичной описательной статистики, t-критерий Стьюдента. Проверка на нормальность проводилась по критерию согласия Колмогорова - Смирнова.

Изучаемые признаки имели нормальное распределение в группах, поэтому в работе данные представлены в виде M±m, где М - среднее (Mean), m - стандартная ошибка (SD).

Результаты. ПЦР в режиме реального времени показала значительный уровень экспрессии нейротрофических факторов в сетчатке крыс.

При этом, в группе Д+плацебо наблюдается увеличение уровня экспрессии VEGF до 0,6692±0,0279 по сравнению с контрольной группой 0,3947±0,0242 (P<0,05).

В группе Д+плацебо наблюдается снижение уровня BDNF до 0,0058±0,0005, тогда как в контрольной группе он составляет 0,0114±0,0007. Это различие было статистически достоверным P<0,05 (табл.1).

Таблица 1. Показатели уровня экспрессии VEGF и BDNF у животных в группе Д+плацебо и контрольной группы.

клетка регенерация сетчатка

Качественный и количественный анализ показал, что наибольшие пики концентрации были достигнуты нейротрофическим фактором мозга у крыс с трансплантированными стромальными клетками по сравнению с диабетическими крысами (табл.2).

Таблица 2. Показатели уровня экспрессии VEGF и BDNF у животных в группах Д+кМСКП и Д+плацебо.

В группе Д+плацебо уровень экспрессии VEGF достигал 0,6692±0,0279, при введении кМСКП показатели уровня экспрессии VEGF в группе Д+кМСКП снижался до 0,5737±0,0341. Это различие было статистически значимым P<0,05. Значительное уменьшение уровня экспрессии VEGF в группе Д+кМСКП по сравнению с группой Д+ плацебо свидетельствует о возможном антиангиогенном эффекте препарата кМСКП при экспериментальной модели СД.

Значительно более высокий уровень BDNF наблюдался в сетчатке крыс группы Д+кМСКП по сравнению с группой Д+плацебо. Уровень экспрессии BDNF в группе Д+кМСКП достиг 0,0082±0,0010 , тогда как уровень экспрессии BDNF в группе Д+плацебо была 0,0058±0,0005 (P<0,05).

Увеличение уровня BDNF у крыс с пересаженными кМСКП подчеркивает возможный высокий потенциал нейропротекторного действия, что согласуется с данными [7].

Таким образом, кМСКП обладают нейропротекторным и ангиогенным действием, что способствует восстановлению сетчатки.

Обсуждение результатов. Нами предложен алгоритм использования кМСКП in vivo при ДР, который основывается на двух подходах: внутривенное и интравитреальное введение. Нейротрофический фактор BDNF может быть вовлечен в восстановление ретинальных клеток при ДР [9].

Интравитреальное введение кМСКП обеспечивает высокий уровень нейротрофинов, которые могут проникнуть в сетчатку. Кроме того, интравитреальная трансплантация кМСКП может минимизировать повреждение сетчатки [8].

Нейротрофины, выделяющиеся из кМСКП обеспечивают регресс нейродегенеративных изменений сетчатки при стрептозотоцининдуцированном СД 2 типа.

Интравитреальная инъекция кМСКП с экспрессией BDNF может предотвратить повреждение и гибель ганглиозных клеток в течение 21 суток.

Системное введение кМСКП приводило к благотворному эффекту для фоторецепторов и предотвращению патологического роста сосудов сетчатки, что согласуется с данными литературы [6] .

Выводы

КМСКП являются перспективным препаратом для нейропротекции при экспериментальной ДР поскольку они продуцируют нейротрофические и антиангиогенные факторы, полезные для выживания клеток сетчатки и способствуют антиангиогенному эффекту, предотвращая развитие ДР.

Литература

клетка регенерация сетчатка

1. Joe AW, Gregory-Evans K. Mesenchymal stem cells and potential applications in treating ocular disease.Curr Eye Res. 2010;35(11):941-952.

2. Tsagias N, Koliakos I, Lappa M, et al. Placenta perfusion has hematopoietic and mesenchymal progenitor stem cell potential. 2011 Mar 7.

3. Abdulrazzak H, Moschidou D, Jones G, et al. Biological characteristics of stem cells from foetal, cord blood and extraembryonic tissues.J R Soc Interface. 2010;7(Suppl 6):S689-S706.

4. Hicks D, Courtois Y. Fibroblast growth factor stimulates photoreceptor differentiation in vitro.J Neurosci. 1992;12:2022-2033.

5. Preventive effect of taurine on experimental type II diabetic nephropathy [Text] / S. Lin, J. Yang, G. Wu [et al.] // J. Of Biomedical Science. - 2010. - Vol. 17, Suppl. - P. 46 -56.

6. Лобинцева Г.С. Патент (11) 46673 А, Україна, Спосіб консервування гемопоетичних клітин людини. - Бюл. №5 15.05.2002

7. Mahdy RA, Nada WM, Hadhoud KM, et al. The role of vascular endothelial growth factor in the progression of diabetic vascular complications.Eye (Lond) 2010;24(10):1576-1584.

8. Nemeth K, Keane-Myers A, Brown JM, Metcalfe DD, Gorham JD, Bundoc VG, Hodges MG, Jelinek I, Madala S, Karpati S, Mezey E. Bone marrow stromal cells use TGF-beta to suppress allergic responses in a mouse model of ragweed-induced asthma.Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:5652-5657.

9. Yu S, Tanabe T, Dezawa M, Ishikawa H, Yoshimura N. Effects of bone marrow stromal cell injection in an experimental glaucoma model.Biochem Biophys Res Commun. 2006;344:1071-1079.

Размещено на Allbest.ru