Для оценки патоморфологических изменений в головном мозге мы использовали модель экспериментального криптококкоза при внутривенном введении возбудителя мышам. Так, в I серии экспериментов с использованием 4-х штаммов криптококков (в дозе 1х10⁶ кл/мышь), из которых штаммы 1178 и 1165 обладают слабой вирулентностью, а штаммы 1096 и 1090 - сильной вирулентностью, через сутки от начала опыта единичные криптококки обнаруживали во всех срезах у всех животных в просвете микрососудов или вблизи них, в то же время в мягкой мозговой оболочке микромицеты на этом сроке не были обнаружены. В другой серии опытов с использованием сильновирулентного штамма 1166 и менее вирулентного штамма 1067, вводимых в сублетальной дозе (10⁴ кл/мышь и 10⁵ кл/мышь соответственно), на ранних сроках опыта мы также наблюдали изменения стенок микрососудов: расширение просветов артериол, капилляров, нарушение взаиморасположения эндотелия, частичную его десквамацию. Вблизи микрососудов или в их расширенных просветах можно было видеть немногочисленные криптококки. Микроскопическую картину преимущественного поражения микрососудов наблюдали и другие исследователи [Olszevski M. et al. 2004г]. Авторы также отмечали скопление дрожжевых клеток в капиллярах, повреждение стенок микрососудов с формированием "слизистых кист" вблизи разрушенных капилляров и отсутствие воспалительного ответа. При анализе научной литературы, посвященной патоморфологии криптококковых менингитов, нам удалось обнаружить лишь немногочисленные работы, где была бы представлена характеристика структурных изменений в головном мозге на разных сроках развития криптоккового мениногэнцефалита. При морфологическом исследовании головного мозга мышей на различных сроках эксперимента нами определена последовательность изменений, отражающих различные стадии инфекционного процесса. Так, в опыте с использованием 2-х штаммов разной вирулентности (1166 и 1067) на 3-и сутки в мягкой мозговой оболочке у всех подопытных животных наблюдали незначительную воспалительную инфильтрацию лимфоцитами и единичными нейтрофильными лейкоцитами. Наряду с этим в микрососудах мягкой мозговой оболочки и веществе мозга - расширение просветов, гомогенизация стенки, набухание и десквамация эндотелия. В коре мозга обнаруживались зоны опустошения, иногда довольно значительные. Преобладал гипоксический тип изменений, однако наряду с этим в наружных слоях коры отмечались тяжёлые изменения клеток, сопровождавшиеся вакуолизацией цитоплазмы, рексисом ядер, а так же появлением "тающих" клеток, "клеток - теней". На 7-е сутки в мягкой мозговой оболочке нарастала воспалительная инфильтрация, увеличилось количество нейтрофильных лейкоцитов, в оболочке и веществе головного мозга появились мелкие скопления криптококков, часто наблюдаемые вблизи микрососудов с фрагментированными стенками. На этом же сроке в веществе мозга выявляли характерные для криптококкового поражения очаги "лизиса" (микрокисты), содержащие криптококки. Деструктивные изменения нейронов на 7-е сутки оказались явно более выражены, чем на 3-и сутки. Слои коры головного мозга часто не определялись, в базальных отделах повсеместно наблюдались тяжёлые изменения нейронов вплоть до образования клеток - теней. На 14-е сутки в мягкой мозговой оболочке у большинства животных наблюдали большое число криптококков, обильную воспалительную инфильтрацию. В веществе мозга у всех животных встречались разных размеров очаги "лизиса", содержащие криптококки, вокруг которых были видны сдавленные, вытянутой формы нервные клетки. Значительные зоны опустошения с лизисом нервных клеток отмечались в базальных отделах и подкорковых ядрах. К 21-м суткам в группе мышей, заражённой высоковирулентным штаммом, деструктивные изменения в мозге продолжали нарастать, в то время как в другой группе, инфицированной менее вирулентным штаммом, наметилась тенденция к уменьшению числа криптококков как в оболочке, так и в веществе мозга, сочетавшаяся с меньшими деструктивными изменениями нервных клеток и более выраженной астроцитарной реакцией. В связи с этим, на основании анализа патоморфологических изменений в головном мозге мышей, мы выделили следующие периоды развития инфекционного процесса и морфологические критерии их оценки: а) ранний (3 сутки), характеризующийся расширением просвета микрососудов, гомогенизацией и набуханием стенки, десквамацией эндотелия, появлением небольших зон опустошения в коре головного мозга, преимущественно гипоксическим типом изменения нервных клеток, б) острый период (7, 14 сутки), в который отмечены деструктивные изменения сосудистой стенки, некрозы эндотелиоцитов, нарастание тяжелых изменений нервных клеток, обширные очаги выпадения в коре головного мозга и в) подострый период (21-е сутки), в который распространенные деструктивные изменения сосудов сочетались с пролиферацией их по периферии очагов поражения и заместительной глиальной реакцией.

Для сопоставления наблюдаемых нейрогистологических изменений в эксперименте было предпринято изучение головного мозга у 4-х умерших от криптококкоза людей. В первом случае (у пациента, перенёсшего трансплантацию почки) немногочисленные криптококки и воспалительную инфильтрацию наблюдали в ММО, но не обнаруживали их в веществе мозга. Артериолы и капилляры часто принимали причудливую, угловатую форму, стенки сосудов были гомогенизированы, эндотелий частично десквамирован, вблизи сосуда и на отдалении - сливающиеся очаги коагуляционного некроза. В 2-х случаях (криптококковый менингоэнцефалит у женщины на фоне длительной гормональной терапии и у женщины на фоне ожирения и герпетической инфекции) в ММО и в веществе головного мозга обнаруживали скопления криптококков. Характерная локализация, выявляемые фрагменты сосудистой стенки по периферии скоплений криптококков указывали, что эти колонии возбудителей образовались на месте разрушенных микрососудов. В четвёртом случае (криптококкоз у мужчины на фоне хронического вирусного гепатита В) выявлены немногочисленные криптококки в оболочке и веществе мозга и морфологические изменения продуктивного характера с наличием гигантских клеток в ММО. В веществе мозга отмечалось интенсивное новообразование сосудов и пролиферация глии. Таким образом, обнаружен широкий спектр патоморфологических изменений в головном мозге, отражающих, вероятно, различные особенности течения криптококковой нейроинфекции, сопоставимых с результатами экспериментальных исследований. Так, поражение стенки микрососудов, обнаружение гипоксического типа изменений нервных клеток могут свидетельствовать о сосудистом генезе некрозов в веществе головного мозга при криптококкозе.

Характер и сроки появления воспалительных инфильтратов в мягкой мозговой оболочке и микрокист в веществе головного мозга во многом совпадают с данными других авторов [Maffei C. et al, 2004; Chretien F. et al, 2004]. В научной литературе мы практически не нашли данных о динамике и характере поражения нервных клеток на разных этапах криптококковой инфекции за исключением сведений о появлении темных, "сморщенных" клеток в коре головного мозга на ранних сроках криптококкового менингоэнцефалита [Fries B. et al, 2004].

Учитывая выраженные изменения микроциркуляторного русла, а также значительные зоны опустошения в коре головного мозга и тяжёлые изменения нервных клеток, часто не связанные с непосредственным присутствием криптококков в веществе мозга, безусловный интерес представляет оценка роли астроцитарной глии - составляющей гематоэнцефалического барьера. С помощью иммуногистохимического окрашивания КФБ мы проследили в динамике изменения астроцитарной глии при криптококкозе в группах мышей, заражённых штаммами 1166 и 1067 на 3-и, 14-е и 21-е сутки. При этом на 3-и сутки можно было наблюдать очаговые скопления астроцитов как в коре, так и в белом веществе головного мозга. В глубоких слоях коры были видны обширные поля с выраженной экспрессией КФБ в набухших и утолщенных отростках астроцитов вокруг капилляров. Вокруг микрососудов как в коре, так и белом веществе хорошо окрашивались не только утолщенные сосудистые ножки, но и их тела и многочисленные ветвящиеся отростки, выявляя очаговые скопления астроцитов. Таким образом, на 3-и сутки мы наблюдали прогрессивные изменения астроцитов, утолщение перикапиллярных отростков вокруг капилляров, что можно расценить как ответную реакцию астроцитов, направленную на укрепление гематоэнцефалического барьера. Подобные изменения астроцитов описаны и другими авторами [Насыров Р.А., 1995, Matsumoto S. et al, 2003; Li J. et al 2005;]. На 14-е и 21-е сутки в базальных отделах, в коре головного мозга можно было наблюдать очаговую и диффузную пролиферацию астроцитов, причем как вблизи фокусов лизиса, содержащих криптококки, так и на отдалении; при этом крупные астроциты с многочисленными ветвящимися утолщенными отростками образовывали значительные скопления. Внутри очагов, содержащих криптококки, можно было видеть крупные астроциты с немногочисленными утолщенными отростками. Наблюдалось некоторое отличие в проявлении астроцитарной активности в головном мозге мышей, зараженных штаммами разной вирулентности. На 14-е и, особенно на 21-е сутки в группе, инфицированной менее вирулентным штаммом 1067, в сравнении с более вирулентным 1166, преобладали прогрессивные изменения астроглии с замещением очагов, содержащих криптококки? астроцитами. (Рис.1). Криптококки в очагах часто имели признаки дегенеративных изменений - вытянутые, лимонообразные дрожжевые клетки. В то же время в группе, зараженной более вирулентным штаммом 1166 чаще наблюдали их регрессивные формы астроцитов, фрагментацию и распад отростков (клазматодендроз). Криптококки в очагах "лизиса" были морфологически сохранными с отчётливой капсулой.

Рис.1 Пролиферация астроцитов в головном мозге мышей, инфицированных C. neoformans, штамм 1067, 14-е сутки опыта. Иммуногистохимическое выявление КФБ. Объектив х40. - астроциты,

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что в более поздние сроки наряду с барьерной и заместительной функцией, выполняемой астроцитами, наблюдались регрессивные формы, свидетельствующие о срыве протективного эффекта астроцитов.

Несмотря на возросший в последние годы интерес к проблеме патогенеза криптококкоза, в литературе встречаются лишь единичные работы, посвященные сравнительной морфологии при менингитах, вызванных различными по вирулентности штаммами криптококков.

Однако известно, что возбудители криптококкоза значительно различаются по вирулентности и доказано, что патогенность штаммов криптококков зависит от комбинации следующих факторов: способности к росту при 37^оС, капсулообразованию, меланинобразованию, фосфолипазной и уреазной активности [Васильева Н.В., 2005]. Данные нашего эксперимента с использованием 4-х штаммов, обладающих различной вирулентностью продемонстрировали, что на 7-е сутки после заражения в группах мышей, инфицированных сильновирулентными штаммами 1090 и 1096, в мягкой мозговой оболочке обнаруживалось большое количество морфологически сохранных криптококков, более выражена оказалась воспалительная инфильтрация; в двух других группах мышей, инфицированных слабовирулентными штаммами в оболочке были обнаружены единичные дрожжевые клетки. У всех животных в веществе головного мозга наблюдались очаги "лизиса" (микрокисты). Их количество были достоверно больше (P<0,05) у мышей, инфицированных сильновирулентными штаммами - 1096 и 1090 (Рис.2). В головном мозге мышей, инфицированных слабовирулентными штаммами 1178 и 1165 вокруг криптококков наблюдалась отчётливая глиальная реакция с частичным замещением очагов поражения. Клетки грибов часто были деформированы, с явными признаками дегенерации.

Известно, что в тканях макроорганизма C. neoformans не только образует полисахаридную капсулу, состоящую, в основном из кислого глюкуроноксиломаннана, но и продуцирует значительное его количество, а возможно, и другие биологически активные вещества. Нет сомнений, что этот биополимер углеводной природы, наряду с другими проявлениями своей биологической активности, обладающий способностью взаимодействовать с лектиновыми рецепторами клеток, может вносить свой вклад в события, которые разворачиваются в ходе инфекционного процесса. В связи с этим, одной из задач нашего исследования было изучение локализации антигена криптококка с помощью ИГХ метода.

Рис 2. Количество очагов лизиса в головном мозге мышей в зависимости от вирулентности штаммов криптококков.

Результаты проведённого ИГХ определения капсульного полисахарида в головном мозге показали, что на 3-и сутки после заражения была видна отчётливая экспрессия капсульного антигена криптококка на эндотелии сосудов ММО, микрососудов вещества мозга; иногда антиген криптококка обнаруживался также в периваскулярной зоне вещества головного мозга (на сосудистых ножках астроцитов). На 7-е сутки отмечено усиление экспрессии исследуемого антигена на эндотелии сосудов мягкой мозговой оболочки и периваскулярно. В веществе мозга антиген также обнаруживался в тесной связи с микрососудами - на эндотелии и в просвете, а также выявлялся в капсуле криптококков. На 14-е сутки помимо нарастания экспрессии антигена в ММО, в микрососудах и периваскулярно, в веществе мозга появилось диффузное пылевидное окрашивание вокруг очагов с криптококками. Такое же распределение антигена сохранялось и на 21-е сутки. Суммируя представленные данные о локализации капсульного антигена, можно отметить, что наибольшая плотность его была выявлена в эндотелии микрососудов ММО, вещества головного мозга, периваскулярной зоне независимо от вирулентности штамма (Рис.3).

Рис.3 Распределение антигена капсульного полисахарида в структурах головного мозга. Z1 - микрососуды ММО, Z2 - периваскулярное пространство ММО, Z3 - микрососуды головного мозга, Z4 - сосудистые ножки астроцитов, Z5 - нервные клетки, Z6 - капсула криптококков, Z7 - перифокальная экспрессия (вокруг очагов лизиса).

Таким образом, с одной стороны можно отметить преимущественное распространение антигена криптококка в микроциркуляторном русле, а также вокруг очагов лизиса с криптококками, с другой - отчётливые изменения сосудистой стенки как на ранних сроках инфекции (3-и сутки), так и на более поздних сроках (21-е сутки). Основываясь на этих результатах, можно предположить, что капсульный полисахарид вносит свой вклад в патологические изменения микроциркуляторного русла. Аутопсийный материал также был подвергнут иммуногистохимическому исследованию для выявления капсульного полисахарида. Отмечено наличие антигена криптококка не только в капсуле криптококков, но и на стенках микрососудов ММО и вещества головного мозга, а также вокруг очагов лизиса и среди глиальных клеток. Эти данные согласуются с наблюдениями других исследователей, отметивших преимущественную экспрессию антигена криптококка в капиллярах в головном мозге больных с диссеминированным криптококкозом [Lee S. et al, 1995, Chretien F. et al 2004].

Особую ценность представляло применение ИГХ метода выявления капсульного полисахарида при исследовании операционного материала, который представлял собой удалённую опухоль головного мозга у женщины 69 лет, расцененную при гистологическом исследовании как мультиформная глиобластома. Примечательно, что в нескольких срезах, среди некротических масс имелись скопления округлых и овальных клеток, слабо окрашивающихся по Моури в синий цвет. Слабо выраженная капсула, дегенеративные изменения большинства клеток гриба вызывали некоторые сомнения в правильности диагноза криптококкоза. Точный диагноз криптококкоза был поставлен только после применения ИГХ метода, позволившего выявить интенсивную экспрессию антигена криптококка в капсуле, стенке микрососудов, периваскулярно, в строме опухолевой ткани.

Как видно из представленных материалов, для характеристики патогенетических изменений структурных элементов головного мозга при криптококкозе необходим комплексный подход, охватывающий оценку морфологических изменений в системе " кровеносный сосуд-глия-нейрон" с учётом вирулентности криптококков, как одного из факторов, определяющих характер этих изменений.

Выводы

1. Диагностический поиск возбудителя в веществе мозга следует проводить с учетом преимущественного поражения криптококком определённых структур и отделов головного мозга: микрососуды мягкой мозговой оболочки, вещества мозга преимущественно базальных отделов. При длительном течении криптококковой нейроинфекции возбудитель может обнаруживаться внутри гигантских клеток или скоплений астроцитов.

3. Результаты исследования, выявившие важную роль микрососудов в развитии криптококковой нейроинфекции, могут быть приняты во внимание при разработке способов терапии данной патологии.

2. В качестве специфического и надежного способа прижизненной и постмортальной диагностики криптококкоза целесообразно использовать иммуногистохимический метод выявления капсульного полисахарида.

Список работ, опубликованных по теме диссертации