Генное регулирование программированной клеточной гибели миокарда при остром инфаркте миокарда, ее динамика при лечении и перспективы терапии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генное регулирование программированной клеточной гибели миокарда при остром инфаркте миокарда, ее динамика при лечении и перспективы терапии

Цель исследования - изучение генной регуляции апоптоза при остром инфаркте миокарда и в процессе лечения, оценка влияния левокарнитина (Элькара) на экспрессию генов Fas-зависимого пути апоптоза.

В процессе работы решались следующие задачи: 1) количественная характеристика активности генов основного (рецепторного) пути апоптоза при остром инфаркте миокарда (так называемого Fаs-зависимого пути апоптоза) на различных этапах развития болезни; 2) исследование динамики в процессе лечения двух форм гена Fas: мембраносвязанной формы mFas (CD95, FasR) и растворимой формы sFas (FasL, CD178); 3) количественная оценка влияния на экспрессию генов Fas препарата левокарнитин (Элькар), способного, по некоторым данным, оказывать тормозящее действие на процесс апоптоза. Этот препарат обладает антиоксидантным действием, повышает толерантность миокарда к дефициту кислорода (гипоксии), улучшает сократительную функцию сердца [4-10].

Материалы и методы. Активность генов апоптоза исследовали путем определения в крови после лизиса клеточных и ядерных мембран содержания мРНК исследуемых генов, которое зависит от общего количества генов и их эффективности. Уровень мРНК в крови определяли путем амплификации (накопления) ее количества в ходе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени cпомощью специального устройства DT Lite 4 («ДНК-Технология», Россия) и рассчитывали с учетом фотофлюоресцентной реакции праймеров, специфичных для исследуемых мРНК. Учитывали число циклов, необходимое для амплификации праймера до того количества, которое давало реакцию флюоресценции. Этот момент носит наименование Cp - точка пересечения (англ. crossing point) и позволяет провести расчет количества амплификата. Для этого применяются специальные формулы, предложенные биотехнологами. Наибольшую популярность имеет метод расчета, разработанный генетиками Германии и Англии, известный под названием REST (relative expression softlove tool) - компьютерная программа расчета относительной экспрессии нуклеопротеинов [11, 12].

Группа экспертов, проверявшая этот метод расчета экспрессии генов, отметила точность, воспроизводимость данных этой программы и ее пригодность для расчетов межгрупповых и индивидуальных соотношений [3].

Все операции по исследованию экспрессии генов апоптоза проводились в лаборатории НИИ молекулярной иммунологии Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского.

При определении экспрессии генов указанная программа использует относительную величину R, выводимую из формулы R=E^{(ДCp target gene-Cp ref gene)}.

В этой формуле E (эффективность) выражает величину, на которую увеличивается концентрация мРНК в течение одного цикла; Cp - количество циклов до начала кривой флюоресценции; ref gene - ген сравнения (контроля); а target gene - целевой ген; Д - разница между средним значением Ср в группе обследуемых и средним значением референтного гена.

Найденная величина R отображает, насколько искомый (таргетный) ген активнее по показателю экспрессии в сравнении с покоящимся геном. Численное значение R является безразмерной величиной. Считается, что определение абсолютного значения уровня гена в крови не имеет преимуществ перед информативностью относительной экспрессии. Все данные приводятся в сравнении с уровнем гена «домашнего хозяйства» (убиквитина / референтного гена), считающегося наиболее стабильным и принимаемым за точку отсчета в так называемых нормализованных результатах. Изучение экспрессии проведено путем сравнения усредненных данных экспрессии мРНК (mFas и sFas форм гена Fas) в группах больных и группах здоровых. При анализе динамики генов использовалось сравнение исходных и достигнутых данных. Статистические данные признавались достоверными при величине р<0,05. Получаемые данные являются «нормализованными», т.е. соотнесенными с уровнем гена «домашнего хозяйства».

На протяжении времени госпитализации больные получали лечение установленного стандарта - ингибиторами ангиотензина, антиангинальными и антиагрегантными средствами. Поводили ЭКГ- и эхоКГ-исследования в динамике и биохимические исследования (С-реактивный белок, КФК-МВ, тропонин-I, липиды крови и др.).

Всего обследовано 28 больных инфарктом миокарда, из которых 16 мужчин и 12 женщин. Средний возраст мужчин - 62 года, женщин - 68 лет.

Тяжесть состояния оценивали при поступлении по показателю TIMI, среднегрупповые значения которого в группе мужчин были равны 4, в группе женщин - 4,2. Передний инфаркт миокарда установлен у 16 больных, нижний - у 9, циркулярный - у 3.

Также были обследованы 18 здоровых лиц (доноров и сотрудников лечебных учреждений) с целью формирования группы сравнения (контроля).

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией (принятой в июне 1964 г. (Хельсинки, Финляндия) и пересмотренной в октябре 2000 г. (Эдинбург, Шотландия)) и одобрено Этическим комитетом НижГМА. От каждого пациента получено информированное согласие.

Исследование динамики экспрессии генов Fas выполнено у 10 больных инфарктом миокарда, которые прошли десятидневный курс лечения левокарнитином (Элькар, ф. «Пик-Фарма», Россия), препаратом, у которого предполагается ингибирующее апоптоз действие.

Всего проанализировано 156 анализов от здоровых и больных людей.

Результаты и обсуждение. Уровень экспрессии мРНК гена mFasздоровых людей, нормализованный по уровню референтного гена, равен 4,2. Экспрессия этого гена в группе больных крупноочаговым инфарктом оказалась в первый день равной 9,56, т.е. в 2 раза выше. Экспрессия мРНК sFas была равной 4,5 в группе здоровых и 8,87 - в группе больных. Функциональную активность генов Fas у больных в процессе лечения демонстрируют данные повторных исследований экспрессии мРНК Fas, проведенных через 1 и 2 нед, что согласно консенсусным методическим разработкам AHA (Американской кардиологической ассоциации и коллегии университетских кардиологов), Европейской кардиологической ассоциации и Российского общества кардиологов, соответствует первому - острому и второму - подострому периодам инфаркта миокарда (см. таблицу и рисунок).

апоптоз миокард инфаркт ген

В таблице приведены значения R - относительной величины экспрессии генов (мРНК генов mFas и sFas) у больных острым инфарктом миокарда на протяжении острого и раннего постинфарктного периода и у здоровых людей, чьи данные приняты за норму. Также в таблице и рисунке приведены результаты мониторирования экспрессии генов под влиянием стандартного лечения больных в остром и раннем подостром периодах (1-я и 2-я недели) и на фоне комплексного лечения с включением левокарнитина (Элькара).

Показанная связь между длительностью экспрессии генов апоптоза mFas и sFas отмечена впервые и обосновывает необходимость проведения ингибиции апоптоза в целях протекции миокарда с помощью генной терапии инфаркта миокарда.

В связи с «кризисом» генно-инженерных методов в клинических условиях [13-16] фармакологическая регуляция генной активности (экспрессии) может быть альтернативой генно-инженерному методу, а применение левокарнитина, тормозящего митохондриальные нарушения, - важным дополнением к известным фармакологическим агентам защиты миокарда при инфаркте.

Активация (экспрессия) генов, участвующих в развитии и поддержании Fas-зависимого пути апоптоза у больных крупноочаговым острым инфарктом миокарда, повышена по сравнению с нормой (уровнем экспрессии у здоровых людей). Повышенная экспрессия генов апоптоза сохраняется не только в фазе острейшего и острого (развивающегося) инфаркта, но и в ранней постинфарктной фазе, что может служить причиной длительности апоптоза у этих больных.

Препарат левокарнитин (Элькар), примененный в ранний период инфаркта миокарда, ингибирует апоптоз, снижая экспрессию генов апоптоза Fas-пути и оказывая цитопротективное действие.

Размещено на Allbest.ru