Нейротропное действие нейротрофического фактора BDNF на разных этапах развития культур диссоциированных клеток гиппокампа in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru

Нейротропное действие нейротрофического фактора BDNF на разных этапах развития культур диссоциированных клеток гиппокампа in vitro

Т.А. Мищенко,

М.В. Ведунова,

Е.В. Митрошина,

А.С. Пимашкин,

И.В. Мухина

Ключевые слова: нейротрофический фактор головного мозга; BDNF; диссоциированная культура гиппокампа; мультиэлектродная матрица.

Цель исследования -- оценить нейротропное действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей гиппокампа в зависимости от стадии их развития in vitro.

Материалы и методы. Материалом для исследований служили культуры диссоциированных клеток гиппокампа, полученные от эмбрионов мыши линии C57BL/6 18-го дня гестации. Культивирование первичных культур выполняли на мультиэлектродных матрицах MED64 (Alpha Med Science, Япония). Аппликацию нейротрофического фактора в концентрации 0,1; 1; 10 нг/мл в среду культивирования осуществляли на 7, 14 и 21-й дни развития культур in vitro. Регистрация базового уровня спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур проводилась в течение 10 мин до аппликации вещества. После добавления нейротрофина регистрация активности осуществлялась непрерывно в течение 35 мин. Повторная 10-минутная регистрация выполнялась через 2 и 24 ч после добавления нейротрофина.

Результаты. Показано, что нейротрофический фактор BDNF модулирует спонтанную биоэлектрическую активность культур диссоциированных клеток гиппокампа начиная с 14-го дня развития in vitro. Эффект проявляется в увеличении длительности сетевой пачки и реструктуризации паттерна спонтанной сетевой активности при отсутствии изменений в количестве спайков в пачке. Нейротропный эффект BDNF наблюдается через 10-15 мин после аппликации с продолжительностью действия не менее 2 ч.

Заключение. Применение нейротрофического фактора BDNF в концентрации 0,1; 1 и 10 нг/мл оказывает транзиторный нейротропный эффект на спонтанную биоэлектрическую активность зрелых нейронных сетей культур диссоциированных клеток гиппокампа начиная с 14-го дня развития in vitro. Изучение механизмов участия BDNF в синаптической передаче позволит прояснить роль нейротрофина в таких высших функциях ЦНС, как научение и память.

нейротрофин нейротропный головной мозг гиппокамп

Изучение механизмов регуляции биологических процессов, наблюдаемых в центральной нервной системе (ЦНС), является одной из значимых задач современной биологии и медицины. Нейротрофины -- одни из важнейших регуляторных белков, обеспечивающих основные процессы жизнедеятельности человека и животных [1]. Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) является ключевым представителем данного семейства белков, функции которого непосредственно связаны с работой ЦНС. Основную роль данный нейротрофин играет на стадии пренатального развития, принимая участие в процессах нейрогенеза, обеспечивая активную дифференцировку и пролиферацию нейронов различного фенотипа и локализации. Однако особый интерес представляет действие BDNF на функционирование ЦНС в постнатальный период [2]. Недавними исследованиями [3] показана возможность модулирования нейротрофическим фактором синаптической передачи в гиппокампе и некоторых отделах коры головного мозга. В результате взаимодействия BDNF с высокоаффинным тирозинкиназным рецептором В (TrkB) происходит запуск нескольких сигнальных механизмов, обеспечивающих действие нейротрофического фактора на пресинаптическую и постсинаптическую передачу сигнала в клетке. BDNF способен активировать потенциалзависимые натриевые, калиевые каналы, повышать уровень экспрессии GABAА-рецепторов, а также фосфорилирования NR1- и NR2B-субъединиц NMDA-рецепторов, тем самым влияя на эффективность синаптической передачи. Кроме того, BDNF принимает участие в формировании синаптической пластичности и в процессах обучения и памяти [4, 5]. Однако в связи с недостаточностью знаний о роли и механизмах действия BDNF на функционирование нейронов на сетевом уровне в процессе их развития, а также об участии нейротрофина в гомеостатической пластичности очевидна необходимость дальнейшего исследования.

Цель исследования -- оценить нейротропное действие нейротрофического фактора головного мозга на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей гиппокампа в зависимости от стадии их развития in vitro.

Материалы и методы. Культивирование диссоциированных клеток гиппокампа. Материалом для исследований служили культуры диссоциированных клеток гиппокампа, полученных от 18-дневных эмбрионов мышей линии C57BL/6. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в приказе Минздрава России №267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации».

С целью регистрации основных электрофизиологических показателей активности нейронных сетей культивирование клеток проводилось на мультиэлектродных матрицах MED64 (Alfa Med Science, Япония).

Ферментативную диссоциацию клеток эмбрионального гиппокампа выполняли при помощи обработки гиппокампа 0,25% раствором трипсина (Gibco, США). Культивирование первичных культур осуществляли в нейробазальной среде Neurobasal^TM (Invitrogen, США) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen, США), L-глутамином (Invitrogen, США), эмбриональной телячьей сывороткой («ПанЭко», Россия) согласно ранее разработанному протоколу [6] в течение 30 дней in vitro на мультиэлектродной матрице. Перед посадкой клеток мультиэлектродные матрицы обрабатывали положительно заряженным гидрофильным веществом -- полиэтиленимином (Sigma, Германия) для повышения адгезии клеток на их поверхность. Исходная плотность культуры на матрице составляла 9000 кл./мм². Жизнеспособность культур поддерживалась в условиях СО₂-инкубатора (MCO-18AIC, Sanyo, Япония) при температуре 35,5°С и газовой смеси, содержащей 5% СО₂ [7].

Схема эксперимента. BDNF апплицировали на 7-, 14- и 21-й дни развития культур in vitro. В 1-й группе культур BDNF добавляли в культуральную среду в концентрации 0,1 нг/мл, во 2-й группе -- 1 нг/мл, в 3-й группе -- 10 нг/мл. В качестве контроля использовали соответствующие концентрации раствора альбумина в фосфатно-солевом буфере PBS (phosphate buffered saline).

Регистрация базового уровня спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур проводилась в течение 10 мин до аппликации вещества. После добавления нейротрофина регистрация активности осуществлялась непрерывно в течение 35 мин. Повторная 10-минутная регистрация проводилась через 2 и 24 ч после добавления нейротрофина (рис. 1).

Для получения данных и их первичного анализа использовали набор программного обеспечения Conductor^TM (Alpha Med Science, Япония). Анализ сетевой активности нейронов проводили с помощью разработанного в программной среде MATLAB оригинального пакета алгоритмов MEAMAN (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2012611190).

Детектирование спайков (внеклеточных потенциалов действия) осуществляли по следующему алгоритму: выбиралась граница, равная 8у, где у -- среднеквадратичное число. При условии превышения амплитудой спонтанной активности данного порога событие считалось спайком, без превышения активности распознавалось как шум и не учитывалась при анализе данных. Исследовались основные характеристики спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети: количество малых сетевых пачек в записи; количество спайков в пачке; длительность малой пачки импульсов в секундах. Критерием малой сетевой пачки являлось наличие спайков минимум на четырех различных электродах матрицы с межспайковым интервалом не более 100 мс [8].

Анализ паттерна активации нейронной сети. Дополнительно для характеристики функциональной структуры сетевой активности был выполнен анализ последовательности спайков внутри вызванной пачки, обусловленных сложной сетевой динамикой, которая способна варьироваться в разных пачках. Для анализа функциональных характеристик всех регистрируемых клеток был проведен следующий анализ паттернов активации. Для каждой пачки был определен 64-мерный паттерн активации -- времена первого спайка на каждом электроде после временньй точки, равной времени начала пачки.

Статистический анализ данных. Полученные результаты подвергались статистической обработке с помощью пакета прикладных программ SigmaPlot 11.0 с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Данные представлены в форме «среднее значение ± стандартная ошибка среднего». Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Исследование влияния нейротрофического фактора BDNF на функциональную биоэлектрическую активность первичных клеток гиппокампа проведено на 7-, 14- и 21-й дни культивирования. Согласно ранее полученным данным [9-12], эти сроки развития являются ключевыми этапами формирования нейронных сетей диссоциированных культур in vitro. Добавление различных концентраций альбумина в PBS не вызвало статистически значимых изменений в спонтанной биоэлектрической активности на всех сроках развития культур диссоциированных клеток гиппокампа, что дало основание усреднить значения контрольных групп для каждого этапа проведения исследования.

Установлено, что в ответ на аппликацию BDNF (0,1 и 1 нг/мл) на 7-й день развития культур in vitro спонтанная биоэлектрическая активность статистически значимо не изменялась ни по одному из исследуемых параметров (количество малых сетевых пачек, количество спайков в пачке, длительность малой сетевой пачки). Однако следует отметить, что после добавления в среду культивирования BDNF отмечалось увеличение синхронизации работы нейронов, формирующих сетевую пачку импульсов (рис. 2, б, в). Данный эффект наблюдался в течение суток (рис. 2, г).

При исследовании влияния BDNF на 14-й день развития культур in vitro обнаружены изменения спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур. Наиболее значимые события были выявлены при анализе длительности малой сетевой пачки импульсов. Так, во временньм промежутке 15-20 мин после добавления в среду культивирования BDNF в концентрации 0,1 нг/мл длительность малой сетевой пачки статистически значимо (p<0,05) увеличивалась по сравнению с исходным уровнем в среднем на 70% (от 0,65±0,16 до 1,11±0,19 с). Кроме того, также (p<0,05) возрастала длительность малой сетевой пачки относительно активности контрольных культур. Однако нейротропный эффект носил транзиторный характер (не менее 20 мин), и через 2 ч после аппликации BDNF спонтанная биоэлектрическая активность возвращалась к исходным значениям и не отличалась от активности контрольных культур (рис. 3, а).

Схожая динамика изменений спонтанной биоэлектрической активности наблюдалась в группе культур с добавлением BDNF в концентрации 1 нг/мл. Однако эффект действия нейротрофина в этом случае был более выражен по сравнению с культурами, получавшими BDNF в концентрации 0,1 нг/мл. Через 10-15 мин длительность малой сетевой пачки была статистически значимо больше (p<0,05) как относительно исходной активности, так и активности культур с аппликацией BDNF в концентрации 0,1 нг/мл. На 20-й минуте регистрации длительность пачки в среднем (p<0,05) превысила исходные значения на 83% (с 0,698±0,09 до 1,286±0,21 с), но уже не отличалась от значений, полученных в группе с меньшей концентрацией BDNF. Через 2 и 24 ч после добавления нейротрофина спонтанная биоэлектрическая активность группы культур с BDNF в концентрации 1 нг/мл не отличалась от исходных значений.

При оценке длительности малой сетевой пачки в группе с добавлением в среду культивирования BDNF в концентрации 10 нг/мл (рис. 2, а) обнаружено, что к 10-15-й минуте наблюдения статистически значимо (p<0,05) увеличивается длительность малой сетевой пачки как относительно исходных значений, так и значений группы с BDNF в концентрации 0,1 нг/мл. Достоверных различий с группой BDNF в концентрации 1 нг/мл не зафиксировано.

Таким образом, нами обнаружен нейротропный эффект концентраций BDNF 1 и 10 нг/мл и не выявлен выраженный эффект BDNF в концентрации 0,1 нг/мл. Нейротропный эффект BDNF длился кратковременно, и через 2 ч после добавления нейротрофического фактора активность нейронных сетей возвращалась к исходному уровню, статистически значимых различий относительно исходных значений не обнаружено.

Кроме того, аппликация различных концентраций нейротрофического фактора приводила к разным изменениям функциональных характеристик сетевой пачки импульсов, отражающих индивидуальную структуру нейронной сети диссоциированных культур клеток гиппокампа (рис. 3, б-д). Нейротропный эффект BDNF может быть связан с повышением эффективности синаптической передачи, что, в свою очередь, приводит к увеличению количества нейронов с временем активации не более 50 мс. Подобная синхронизация нейронов в сети наблюдалась через 24 ч после аппликации. Следует отметить, что степень синхронизации спайков зависела от концентрации добавляемого нейротрофического фактора. Наибольший эффект отмечен в случае применения BDNF с концентрацией 10 нг/мл, на большинстве электродов время появления спайков в сетевой пачке составляло не более 15 мс.

Исследования, проведенные на 21-й день развития культур in vitro, показали, что аппликация BDNF в концентрации 1 нг/мл приводит к активации спонтанной биоэлектрической активности культур диссоциированных клеток гиппокампа. Достоверные изменения длительности малой сетевой пачки регистрировались через 20 мин после добавления нейротрофина. Применение более низких концентраций BDNF (0,1 нг/мл) не вызывало статистически значимых изменений биоэлектрической активности (рис. 4).

Через 20 мин после аппликации BDNF в концентрации 1 нг/мл наблюдалось статистически значимое (p<0,05) увеличение длительности пачки импульсов относительно исходной активности и активности контрольных культур, длящееся в течение последующих 2 ч (контрольные значения были превышены в среднем на 62%). Однако эффект был транзиторный и через 24 ч после добавления нейротрофического фактора длительность пачки не отличалась от первоначальных и контрольных показателей.

Анализ функциональных характеристик сетевой пачки импульсов, отражающих индивидуальную структуру нейронной сети, показал, что добавление в среду культивирования контрольного раствора (альбумина в PBS) не повлияло на паттерн сетевой пачки диссоциированных культур. В отличие от контрольной группы добавление в культуральную среду BDNF в концентрации 0,1 и 1 нг/мл привело к сокращению времени появления первого спайка в сетевой пачке, что говорит о повышении синхронизации работы нейронов. Данный эффект сохранялся в течение 24 ч после аппликации нейротрофина, также как и на 14-й день развития нейронных сетей первичных культур гиппокампа.

Обсуждение. В результате проведенных исследований установлено, что нейротрофический фактор BDNF модулирует спонтанную биоэлектрическую активность культур диссоциированных клеток гиппокампа. Изменение спонтанной биоэлектрической активности нейронов на сетевом уровне выражалось в увеличении длительности малой сетевой пачки импульсов, сокращении времени появления первых спайков в пачке, что изменяло структуру как паттерна активации, так и всей пачки импульсов, являющейся функциональной характеристикой сети. Проявление наблюдаемых изменений зависело от концентрации добавляемого нейротрофина и от стадии развития диссоциированных культур in vitro.

Аппликация BDNF на 7-й день развития культур in vitro не влияла на спонтанную биоэлектрическую активность культур диссоциированных клеток гиппокампа, в то время как на 14-й и 21-й дни культивирования модулировала биоэлектрическую активность нейронных сетей. Эффект в ответ на добавление нейротрофина проявлялся в увеличении длительности малой сетевой пачки импульсов и развивался на временньм промежутке 10-20 мин. Важно отметить, что характерным проявлением нейротропного действия BDNF служили также повышение эффективности синаптической передачи в нейронной сети гиппокампа и усиление синхронизации нейронов при их включении в сетевую активность.

Можно предположить, что полученный нейротропный эффект в ответ на добавление нейротрофического фактора связан с метаболическими процессами, опосредованными запуском сигнальных каскадов при взаимодействии BDNF с рецептором TrkB [3, 13-15]. Для реализации данных реакций необходимо наличие сформированных зрелых синаптических контактов в нейронной сети [4, 5, 16]. Этим объясняется отсутствие изменений в спонтанной активности диссоциированных культур при добавлении нейротрофина на 7-й день развития культур in vitro, поскольку в данный период развития нейронная сеть находится на стадии формирования с преобладанием электрических синапсов и отсутствием полноценных химических синаптических контактов [9-12]. Более поздние сроки развития диссоциированных культур характеризуются наличием сформированных нейронных сетей, в структуре которых преобладают химические синапсы, обеспечивающие пластичность диссоциированных культур [9, 10] и необходимые для реализации нейротропного эффекта BDNF.

Таким образом, BDNF может выступать в роли нейромодулятора спонтанной биоэлектрической активности нейронных сетей культур диссоциированных клеток гиппокампа. Раскрытие механизмов участия BDNF в синаптической передаче позволит прояснить роль нейротрофина в таких высших функциях ЦНС, как научение и память.

Заключение

Нейротрофический фактор головного мозга BDNF в концентрациях 0,1; 1; и 10 нг/мл оказывает транзиторный нейротропный эффект на спонтанную биоэлектрическую активность только зрелых нейронных сетей культур диссоциированных клеток гиппокампа начиная с 14-го дня развития in vitro.

Финансирование исследования. Работа поддержана грантами РФФИ №13-04-01871, №13-04-12067, №14-04-31601, грантом (соглашение от 27 августа 2013 г. №02.В.49.21.0003 между Министерством образования и науки РФ и Нижегородским государственным университетом им. Н.И. Лобачевского). Публикация частично подготовлена в рамках выполнения государственной работы «Обеспечение проведения научных исследований».

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.

Литература

1. Гомазков О.А. Нейротрофическая регуляция и стволовые клетки мозга. М: Икар; 2006; 331 с.

2. Martin J.L., Finsterwald C. Cooperation between BDNF and glutamate in the regulation of synaptic transmission and neuronal development. Commun Integr Biol 2011; 4(1): 14-16, http://dx.doi.org/10.4161/cib.13761.

3. Rose C.R., Blum R., Kafitz K.W., Kovalchuk Y., Konnerth A. From modulator to mediator: rapid effects of BDNF on ion channels. BioEssays 2004; 26(11): 1185-1194, http://dx.doi.org/10.1002/bies.20118.

4. Aptowicz C.O., Kunkler P.E., Kraig R.P. Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na⁺ channel expression. Brain Res 2004; 998(2): 115-163, http://dx.doi.org/10.1016/j.brainres.2003.11.035.

5. Сunha C., Brambilla R., Tomas K.L. A simple role for BDNF in learning and memory? Front Mol Neurosci 2010; 3: 1, http://dx.doi.org/10.3389/neuro.02.001.2010.

6. Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков Л.Г., Захаров Ю.Н., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Коротченко С.А., Корягина Е.А. Мультиэлектродные матрицы -- новые возможности в исследовании пластичности нейрональной сети. Современные технологии в медицине 2009; 1: 8-15.

7. Vedunova M., Sakharnova T., Mitroshina E., Perminova M., Pimashkin A., Zakharov Y., Dityatev A., Mukhina I. Seizure-like activity in hyaluronidase-treated dissociated hippocampal cultures. Front Cell Neurosci 2013; 7(149), http://dx.doi.org/10.3389/fncel.2013.00149.

8. Pimashkin A., Kastalskiy I., Simonov A., Koryagina E., Mukhina I., Kazantsev V. Spiking signatures of spontaneous activity bursts in hippocampal cultures. Front Comput Neurosci 2011; 5(46), http://dx.doi.org/10.3389/fncom.2011.00046.

9. Широкова О.М., Фрумкина Л.Е., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Захаров Ю.Н., Хаспеков Л.Г., Мухина И.В. Морфофункциональные закономерности развития нейронных сетей диссоциированных культур гиппокампа in vitro. Современные технологии в медицине 2013; 2: 6-13.

10. Агрба Е.А., Мухина И.В. Пространственно-временная характеристика нейросетевой активности первичных культур гиппокампа. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2013; 4(1): 139-144.

11. Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Широкова О.М., Захаров Ю.Н., Калинцева Я.И., Мухина И.В. Оценка динамики функционального состояния диссоциированной культуры гиппокампа in vitro. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2011; 2(2): 283-286.

12. Гладков А.А., Ведунова М.В., Коротченко С.А., Захаров Ю.Н., Балашова А.Н., Мухина И.В. Развитие пространственно-временной структуры нейрональной сети гиппокампа in vitro. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2011; 2(2): 243-248.

13. Caldeira M.V., Melo C.V., Pereira D.B., Carvalho R.F., Carvalho A.L., Duarte C.B. BDNF regulates the expression and traffic of NMDA receptors in cultured hippocampal neurons. Mol Cell Neurosci 2007; 35(2): 208-219, http://dx.doi.org/10.1016/j.mcn.2007.02.019.

14. Porcher C., Hatchett C., Longbottom R.E., McAinch K., Sihra T.S., Moss S.J., Thomson A.M., Jovanovic J.N. Positive feedback regulation between gamma-aminobutyric acid type A (GABA(A)) receptor signaling and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) release in developing neurons. J Biol Chem 2011; 286(24): 21667-21677, http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M110.201582.

15. Patapoutian A., Reichardt L.F. Trk receptors: mediators of neurotrophin action. Curr Opin Neurobiol 2001; 11(3): 272-280, http://dx.doi.org/10.1016/S0959-4388(00)00208-7.

16. Sakharnova T.A., Vedunova M.V., Mukhina I.V. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and its role in the functioning of the central nervous system. Neurochem J 2012; 6(4): 251-259, http://dx.doi.org/10.1134/s1819712412030129

Размещено на Allbest.ru