Ежегодно в РФ выполняют приблизительно 12 000 операций протезирования клапанов сердца, из которых 2400 составляют биологические протезы, при этом до 26,4% пациентов подвергаются повторной операции в связи с дисфункцией створчатого аппарата [1]. До 90% дисфункций биопротезов обусловлено первичной тканевой недостаточностью, развивающейся вследствие ряда факторов, основными из которых являются структурная деградация ткани и кальцификация [2, 3]. В связи с ростом числа приобретенных и врожденных пороков сердца количество вмешательств с использованием биологических протезов продолжает неуклонно увеличиваться [1], однако эффективных способов обработки биоматериала, позволяющих радикально решить проблему долговечности биопротезов, не найдено. Данная ситуация вызывает необходимость оценки состояния ткани протеза, что обусловливает развитие новых методов исследования, позволяющих получить количественную оценку степени деградации протеза и сформировать расширенное представление о механизме развития дисфункции.

Существующие исследования эксплантированных биопротезов в основном полагаются на макроскопическое и гистологическое описание [4, 5], однако данные методы не дают достаточной информации о структуре поражений, а заключения носят качественный, но не количественный характер. Высокая рентгенологическая контрастность кальциевых конгломератов позволяет успешно использовать флюороскопические методы оценки кальциноза: в частности, рентгенограмма способна обеспечить качественную визуализацию минерализованной ткани [6], но также не дает возможности сформировать количественную оценку. Наиболее перспективными в данном случае представляются методы, позволяющие осуществлять количественный анализ на базе трехмерных реконструкций, в частности компьютерная томография [7]. Однако и этот метод ввиду относительно невысокого разрешения стандартных клинических установок не позволяет воспроизводить детальную структуру кальцинатов и биологического материала в полной мере. С учетом статичности объекта исследования, а также отсутствия лимита лучевой нагрузки высокое разрешение трехмерной реконструкции может быть получено методом микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) [8]. Данный подход широко используют при решении задач реконструкции прецизионных моделей протезов клапанов сердца для последующего компьютерного моделирования [9-11] и в исследованиях биологической ткани [12]. Мы предлагаем использовать микрокомпьютерную томографию при изучении эксплантированных протезов с дисфункцией для получения количественных характеристик исследуемого поражения.

Цель исследования - оценить возможности метода микрокомпьютерной томографии с последующей обработкой снимков для анализа дисфункций эксплантированных биологических протезов клапанов сердца.

Материалы и методы

Объект исследования. В качестве объекта исследования был выбран ксеноперикардиальный биопротез "ЮниЛайн" (ЗАО "НеоКор", Россия) 30-го типоразмера. Данное медицинское устройство относится к классу жестких каркасных протезов, которые на сегодняшний день являются стандартом радикальной коррекции клапанных патологий [13]. Непосредственно сам протез изготовлен из бычьего ксеноперикарда, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля, монтирован на композитном каркасе из нитинола и полипропилена. Обшивка каркаса и манжета также изготовлены из ксеноперикарда без применения синтетических материалов [14, 15].

В исследовании использовали биологический протез клапана, эксплантированный по причине дисфункции в митральной позиции. Возраст пациента на момент репротезирования - 56 лет, срок функционирования биопротеза в организме - 5 лет. С целью сохранности микроструктуры ткани после иссечения биопротез был помещен в раствор 4% забуференного параформальдегида (Sigma-Aldrich, Германия).

Микрокомпьютерная томография. Исследование проводили с применением метода микро-КТ [16]. Одной из распространенных схем реализации этого метода является использование рентгеновского аппарата с малым размером фокального пятна. Полезная форма пучка в такой схеме представляет собой конус (рис.1). Излучение проходит через объект исследования, частично в нем ослабляется и регистрируется плоскопанельным рентгеновским детектором. Объект исследования поворачивается на определенный угол вокруг вертикальной оси, позволяя делать снимки с различных ракурсов. Размер воксела после реконструкции в данной схеме определен величиной проекционного увеличения, которое зависит от расстояния "объект-источник" и "источник-детектор" [8].

Для проведения исследования был использован томограф "Орел-МТ" (Томский политехнический университет, Россия), реализующий описанную выше схему и обладающий следующими характеристиками:

излучатель: ток - 1-1000 мкА;

напряжение - 20-160 кВ;

фокальное пятно - 1,3 мкм;

детектор - 3 мегапикселя (1920Ч1536 пикселей);

14-битная активная матрица;

диапазон усиления - 1,3-25,0;

область сканирования - 150Ч150Ч100 мм;

размер воксела - 5-100 мкм.

Разрешающая способность томографа в эксперименте составила 25,4 мкм. Детектор был установлен на расстоянии 500 мм от фокального пятна рентгеновского аппарата, объект исследования - на расстоянии 100 мм. Параметры режимов сканирования приведены в таблице. С целью получения более контрастных и информативных изображений протез помещали в герметичную тару с воздушной средой.

Последующую реконструкцию полученных томограмм, сегментирование в соответствии с градациями серого, измерения, а также построение сетки трехмерных моделей осуществляли с использованием программного обеспечения Mimics (Materialise, США). В процессе измерений деформации протеза на томограммах, соответствующих плоскостям гистологических срезов, фиксировали следующие показатели: H - высота зоны коаптации, б - угол провисания створки, R - радиус кривизны створки, D - диаметр каркаса, в - угол наклона стойки проволочного каркаса протеза (рис.2).

Для проведения объемного рендеринга, построения проекций максимальной интенсивности и усредненных проекций использовали программное обеспечение Amira (FEI, США).

Гистологическое исследование. Для оценки структурных изменений биологического материала в процессе функционирования биопротеза была иссечена центральная часть створки от свободного края до основания. Микроструктуру биоматериала оценивали методом световой микроскопии на микроскопе Axio Imager A1 (Carl Zeiss, Германия). Документирование и обработку изображений производили с помощью программного обеспечения AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Измерения толщин биоматериала и размеров кальцификатов производили на 10 серийных срезах для каждого образца. Гистологические препараты толщиной 4-6 мкм готовили на криотоме Microm HM 525 (Thermo Scientific, Германия). Для идентификации кальцификатов на микроструктурном уровне криосрезы окрашивали ализариновым красным С (НПО "Химсинтез", Россия).

По расположению биопротеза относительно анатомии естественного митрального клапана было принято следующее обозначение створок биопротеза: A - антериальная, P - постериальная, M - медиальная (рис.3).

Статистический анализ. Обработку данных по результатам гистологического исследования производили в программе Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США). Характер распределения в выборках оценивали при помощи критерия Колмогорова-Смирнова. Данные представлены в виде медианы (М) и 25 и 75 процентилей.

Результаты

Микрокомпьютерная томография. Первоначально ускоряющее напряжение рентгеновского аппарата было выбрано на уровне 80 кВ. Однако в этих условиях на томограммах сильно проявлялись характерные артефакты из-за наличия металлических компонентов в конструкции биопротеза [17]. Напряжение было увеличено до 140 кВ, что частично компенсировало возникновение артефактов, однако контрастность компонентов, слабопоглощающих рентгеновское излучение, снижалась (рис.4).

Полученные в ходе эксперимента томограммы в оттенках серого и псевдоцветные снимки продемонстрировали основную локализацию наиболее плотных кальцинатов в тканях постериальной и медиальной створок, при этом антериальная створка была свободна от кальцификации (рис.5). Толщина кальцината в куполе постериальной створки составила 0,92 мм. Медиальная створка содержала несколько кальцификатов в срезе, расположенных в куполе и основании створки, максимальная толщина составила 1,68 мм. Толщина антериальной створки в районе свободного края составила 1,57 мм, купола - 1,05 мм.

Медиальный срез (М-срез) наглядно продемонстрировал несимметричность свободного края створки и, как следствие, нарушение геометрии зоны коаптации: высота зоны коаптации составила 2,14 мм против 3,42 и 3,12 мм для постериальной и антериальной створок соответственно.

Наименьший радиус кривизны отмечен для постериальной створки - 22,0 мм, при этом угол провисания створки составил 22,7°. Аналогичные показатели для медиальной и антериальной створок составили 6,15 мм, 30,9° и 7,20 мм, 26,0° соответственно.

Наименьшим углом наклона в 73,4° (стойка деформирована в наибольшей степени) обладала постерио-антериальная стойка проволочного каркаса протеза, при этом угол для других стоек был практически идентичный - 80,0° (медиально-антериальная) и 79,7° (постерио-медиальная).

Диаметр каркаса во всех трех срезах незначительно отклонялся от исходного - 30,48 мм: 28,96 (P-срез); 30,68 (M-срез) и 30,22 мм (А-срез), т.е. каркас не был подвержен эллиптической деформации (см. рис.5).

Полученные в исследовании усредненная 2D-проекция и проекция максимальной интенсивности позволили выделить области с наиболее выраженным кальцинозом (рис.6). Наибольшим изменениям была подвергнута постериальная створка, медиальная створка была преимущественно поражена со стороны постерио-медиальной стойки. Кроме того, объемный рендеринг позволил наглядно визуализировать кальцинаты в области стоек каркаса.

Согласно полученной гистограмме градаций серого по 16-битной шкале яркости от 0 до 65 535 ступеней было выделено два основных пика в диапазоне 800-3700 ступеней - для биоматериала и полипропиленового каркаса, 3700-10 000 ступеней - для кальцинатов. Диапазон 10 000-65 535 ступеней соответствовал проволочному каркасу. В соответствии с данными диапазонами выполнены сегментирование и последующее построение трехмерных моделей (рис.7).

В результате измерения объемов сегментированных тел были получены следующие значения: совокупный объем кальцинатов - 1499,68 мм³, проволочного каркаса - 67,76 мм³, биоматериала (за вычетом полипропиленового каркаса) - 4918,5 мм³. Таким образом, отношение кальций/биологическая ткань составило 0,305. Общая площадь поверхности сетки кальцинатов - 4640 мм².

Гистологическое исследование. Все створки были утолщены с потерей эластичности. В основании створок наблюдали сохранение исходной толщины ткани. В центральной части постериальной и медиальной створок выявлены массивные кальцинаты протяженностью 8 и 4,84 мм соответственно, локализованные в куполе створок (рис.8). Максимальная толщина кальцинированных участков отмечена в куполе постериальной и медиальной створок и составила 0,89 (0,88-1,0) и 1,64 (1,59-1,72) мм соответственно. Толщина кальцината варьировала от 0,3 до 0,68 мм. Также в основании по линии крепления медиальной створки к каркасу отмечен кальцинат, не имеющий локализационной связи с кальцинатом купола створки. Антериальная створка в центральной части не имела признаков кальцификации, ее толщина в области свободного края и купола составила 1,5 (1,47-1,54) и 0,96 (0,94-0,97) мм соответственно.

Обсуждение. Результаты настоящего исследования демонстрируют, что использование метода микро-КТ в изучении дисфункции биопротезов клапанов сердца позволяет существенно расширить арсенал инструментов качественного и количественного анализа. В отличие от рентгенографии [6], метод также позволяет получать проекции максимальной интенсивности, что может быть использовано для быстрой оценки распределения кальцинатов в зоне створчатого аппарата (см. рис.6), однако оказывается неэффективным для анализа распределения кальцинатов по контуру каркаса ввиду его сложной трехмерной геометрии. Для решения этой задачи может быть успешно применен 3D псевдоцветной объемный рендеринг. В целом следует отметить, что использование псевдоцветного окрашивания, в частности в томограммах, позволяет отчетливо визуализировать элементы каркаса протеза со схожей с окружающими тканями рентгенологической плотностью (см. рис.5).

Из всех возможностей метода микро-КТ наиболее ценной является количественное измерение геометрических параметров на реконструированных томограммах, а также реконструкция трехмерных тел с последующей оценкой их объемов. Сравнение результатов микро-КТ-анализа и гистологического описания продемонстрировало идентичность данных. Таким образом, искажения и артефакты - основной недостаток метода - можно считать несущественными.

Полученные в результате измерения данные позволяют связать распределение кальцинатов с напряженно-деформированным состоянием узлов конструкции протеза. Так, постериальная створка имела наименьший радиус кривизны и угол провисания, т.е. находилась в наиболее напряженном состоянии, при этом ее кальцификация - наиболее выраженная. Это позволяет предположить наличие взаимосвязи степени кальцификации и нагрузки в створке протеза, что согласуется с литературными данными, предполагающими первостепенное влияние напряжения материала на скорость кальцификации [18, 19]. В то же время причина изменения геометрии створчатого аппарата заключается по крайней мере в двух факторах: значительная несимметричная деформация стоек каркаса (изначальный угол наклона 84°) и растяжение непосредственно биологической ткани под действием интенсивной циклической нагрузки.

Наличие разрозненных конгломератов кальция в створках и их последующее объединение в более массивные элементы является приоритетным механизмом образования крупных скоплений кристаллов фосфата кальция [19, 20]. Рост кальцината сопровождается разрушением и замещением органической составляющей матрикса на кристаллы фосфата кальция [20, 21], поэтому наличие элементов перикарда вокруг сформированного крупного кальцината говорит о внутренней кальцификации, при которой центры нуклеации расположены в толще материала [18]. Значительное увеличение толщины створок в кальцинированных участках дает основание полагать, что процесс замещения биологической составляющей кальцинатом проходит с большей интенсивностью роста кальцината. Однако увеличение толщин свободного края постериальной створки и в целом толщины антериальной створки без признаков кальцификации указывает на дегенеративные изменения биоматериала без участия процесса кальцификации, которые также вносят свой вклад в дисфункцию биопротеза.

Таким образом, проведенное исследование наглядно демонстрирует возможности метода микро-КТ в оценке степени кальцификации и деформационных изменений каркаса и сворчатого аппарата при дисфункции биопротезов клапанов сердца.

Заключение. Предложенный метод микро-КТ способен существенно расширить набор инструментов исследования механизмов развития дисфункций биологических протезов за счет количественной и качественной оценки распределения кальцинатов. Он дает возможность провести пакетную количественную обработку реконструированных моделей и в перспективе решить вопрос их изучения методами компьютерного моделирования.

Финансирование исследования. Работа проведена в рамках финансирования ФГБНУ "НИИ комплексных проблем сердечно сосудистых заболеваний".

Конфликт интересов отсутствует.

Литература