Оптимізація проведення протоколу екстракорпорального запліднення при використанні преімплантаційної генетичної діагностики

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний медичний університет

Оптимізація проведення протоколу екстракорпорального запліднення при використанні преімплантаційної генетичної діагностики

Луцький А.С.

Анотація

У статті представлені дані дослідження по оптимізації ведення пацієнтів, яким проводилася преімплантаційна генетична діагностика (ПГД) у протоколі екстракорпорального запліднення (ЕКЗ) при різних схемах підготовки ендометрія та підтримки лютеїнової фази. На підставі проведених досліджень показано, що оптимізація протоколу ЕКЗ полягає в проведенні підготовки ендометрія у природному циклі; виконання біопсії для проведення ПГД, в міру можливості, на 5-у добу розвитку ембріона з отриманням декількох клітин трофектодерми; вітрифікація всіх біоптованих ембріонів; виконання ПГД з діагностикою можливих моногених захворювань, або транслокацій в поєднанні з анеуплоїдією; проведення кріопротокола з перенесенням в порожнину матки не більше 2 протестованих ембріонів.

Ключові слова: преімплантаційна генетична діагностика, екстракорпоральне запліднення, підготовка ендометрія.

ПГД -- єдиний можливий спосіб виявлення хромосомних порушень у ембріонів. Цей метод дозволяє не тільки запобігти народженню дитини з хромосомними захворюваннями, а й підвищує ефективність ЕКЗ [1]. Дана методика, що в теперішній час має назву предімплантаційний генетичний скринінг (ПГС), була розроблена для цитогенетичного аналізу ембріонів при наступних показаннях: старший репродуктивний вік, велике число безуспішних спроб ЕКЗ, відсутність імплантації при перенесенні ембріонів хорошої якості, при значному зниженні якості сперми. Однак, за даними проведених рандомізованих контрольованих досліджень, використання класичної ПГД за допомогою виконання біопсії на стадії дроблення, не підвищує частоту імплантації та ймовірність настання вагітності [2].

ПГД -- це єдина можливість оцінити генетичне здоров'я ембріона до імплантації [3]. Велика кількість досліджень у світовій практиці підтверджує,що перенесення ембріонів без хромосомної патології підвищує ефективність ЕКЗ і значно збільшує шанси на народження здорової дитини [4].

Однак, незважаючи на досягнуті успіхи, зазначена методика відрізняється деяким чином, що обмежує застосування ПГД, а саме: необхідність інтенсивної гормональної стимуляції пацієнтки, ймовірність зупинки дроблення ембріона після біопсії, феномен мозаїцизму, недостатня кількість ДНК, що отримується при біопсії бластомера, випадіння алелі при проведенні молекулярно-генетичного етапу, відсутність ембріонів, придатних до переносу в порожнину матки, зниження ймовірності вагітності після ПГД внаслідок впливу біопсії на ембріон.

Проведення ПГД можливо тільки в циклах ЕКЗ, оскільки ембріони знаходяться поза організмом матері і доступні для дослідження.

Мета дослідження. Підвищення результативності лікування безпліддя методом ЕКЗ із застосуванням методики ПГД при різних схемах підготовки ендометрія та підтримки лютеїнової фази (ЛФ).

Матеріал і методи дослідження. Дослідження проведено на кафедра акушерства та гінекології № 2 ХНМУ в клініці репродуктивної медицини імені академіка В.І. Грищенко (м. Харків), де впроваджена технологія ПГД, з метою проведення генетичного аналізу ембріона до його перенесення в матку. У цій клініці використовується інноваційний вид генетичного аналізу -- секвенування наступного покоління (N08). N08 дозволяє «прочитувати» одноразово кілька ділянок геному, що є головною відмінністю від попередніх методів секвенування (рис. 1). На сьогоднішній день це найшвидший і чутливий метод аналізу, який охоплює весь геном цілком [6].

Показаннями для проведення ПГД були:

— вік жінки 35 років і старший;

— мимовільні аборти до 12 тижнів в анамнезі;

— невдалі цикли ЕКЗ в анамнезі;

Рис. 1. Результат проведення генетичного аналізу ПГД методом NGS

— наявність в каріотипі подружньої пари хромосомних порушень, генних дефектів;

— високий рівень анеуплоїдії сперми (більше 5%);

— підтверджений випадок анеуплоїдії плода.

Виконання кріопротоколу проводилося з перенесенням в порожнину матки не більше 2 протестованих ембріонів.

Проведено обстеження 186 пацієнток, які були розділені на 2 групи. В 1 групу увійшли 94 жінок, яким в протоколі ЕКЗ була проведена ПГД. Другу групу склали 92 пацієнтки, яким в протоколі ЕКЗ ПГД не проводилося.

Метод ПГД шляхом проведення біопсії ембріона представлений на рис. 2.

Рис. 2. Виконання ПГД (біпсія ембріону)

Дана маніпуляція виконується за допомогою спеціального інструментарію, який дозволяє взяти лише кілька клітин від майбутніх оболонок ембріона. Клітини самого ембріона залишаються недоторканими, тому це цілком безпечно для майбутньої дитини, що підтверджено багатьма дослідженнями [7].

Отримані клітини досліджувались за допомогою спеціального обладнання(апарат lon S5, виготовлений lon Torent by Termo Fisher Scientific -- США). Аналіз виявляє різні генні і хромосомні порушення. ПГД є також єдиним методом, який дозволяє визначити стать майбутньої дитини до імплантації ембріона [8].

Таким чином, ПГД дозволяє запобігти народженню дитини з хромосомними і генними захворюваннями і значно підвищити ефективність циклів допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ) за рахунок зниження рівня ранніх репродуктивних втрат [9].

Всі пацієнтки мали регулярний менструальний цикл, нормальний яєчниковий резерв. У них раніше не було оперативних втручань на органах малого тазу. За даними ультразвукового дослідження (УЗД) у всіх жінок, що були обстежені, у матковій порожнині були відсутні гіперпластичні процеси.

Аналіз генеративної функції показав, що майже у половини обстежених жінок (45%) спостерігалися різні порушення в репродуктивній системі. З огляду на те, що основною причиною звернення пацієнток було безпліддя, виявлено, що первинне і вторинне безпліддя у всіх групах пацієнток зустрічалося з практично однаковою частотою. Не виявлено достовірних відмінностей у частоті визначення інших факторів безпліддя.

Жінки обстежених груп не відрізнялися за кількістю попередніх спроб ЕКЗ, по кількості днів стимуляції і сумарною дозою гонадотропінів (ГТ), а також по днях культивування і кількості перенесених ембріонів.

Крім загальноклінічних методів дослідження, всім паціенткам проводився ультразвуковий моніторинг, що дозволило виявити причини розвитку НЛФ. УЗД здійснювалось за допомогою трансвагінального датчика на апараті В-К Medical (Данія).

Після трансвагінальної пункції (ТВП) фолікулів проводили запліднення зрілих ооцитів за методикою інтрацитоплазматичної ін'єкції сперматозоїда (ІКСІ), з оцінкою запліднення через 16-18 годин і культивуванням нормально запліднених ооцитів.

У першій групі спостереження біопсія виконувалася на 5-й день культивування при досягненні ембріонами стадії бластоцисти після формування отвору у блискучій оболонці ембріона за допомогою 3D механічного хетчинга. Ембріони на 5-ту добу культивування вітрифікували [5, 6, 10]. ПГД здійснювалася методом NGS. Перенесення ембріонів в порожнину матки виконували під ультразвуковим контролем в асептичних умовах. Визначення рівня Р-субодиниць хоріонічного гормону людини в сироватці крові проводили через 14 діб після перенесення ембріонів з наступним УЗД через 10 днів, в разі отримання позитивного результату.

Кожна група за методом підготовки ендометрія до імплантації була розділена на дві підгрупи: підгрупа А -- природний цикл і підгрупа Б -- замісна гормональна терапія (ЗГТ). У 1А підгрупу увійшло 50 пацієнток, в 1Б -- 44. У 2А підгрупу увійшло 45 жінок, в 2Б -- 47. При природному циклі контролювали ріст і дозрівання фолікулів. Через 5 днів після овуляції проводився ембріопереніс. Пацієнткам підгрупи А з дня овуляції підтримка ЛФ здійснювалась шляхом введення 90 мг прогестерону внутрішньопіхвовим засобом. У підгрупах Б для підтримки ЛФ з 3 дня менструального циклу призначали естрадіолу валерату по 6 мг щодня. При досягненні ендометрія 8 мм призначали 25 мг прогестерону для підшкірного введення і 90 мг прогестерону внутрішньопіхвово. Про клінічну ефективність ЭКЗ після підтримки ЛФ та ПГД судили по частоті настання вагітності, діагностику якої проводили при УЗД на 21-22-й день після перенесення ембріонів.

Для статистичної обробки матеріалів дослідження використовували пакет прикладних програм Statistica 7.0 фірми «StatSoft Inc.» (США) для персонального комп'ютера за програмою в операційному середовищі Statistica for Windows і по прикладних програмах пакета Exsel.

Результати та їх обговорення. В ході проведеної роботи було виконано кількість перенесенних ембріонів на перенесення в кріоциклах з ПГД -- 1,1, без ПГД -- 1,6.

Молекулярно-генетичний етап ПГД був проведений успішно у всіх випадках спостереження. Однією з основних проблем, що ускладнюють виконання протоколів ПГД, є різке зменшення числа ембріонів в ході виконання даної програми в результаті поступового відсіювання при біопсії, отримання результатів молекулярно-генетичного і ембріологічного етапів [10].

Показники результативності лікування безпліддя методом ЕКЗ із застосуванням методики ПГД при різних схемах підготовки ендометрія представлені в таблиці 1.

Таблиця 1 Показники результативності лікування безпліддя методом ЕКЗ із застосуванням методики ПГД при різних схемах підготовки ендометрія