Гистологические и молекулярно-генетические критерии в прогнозировании течения рака мочевого пузыря без мышечной инвазии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.12 - онкология

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ТЕЧЕНИЯ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ БЕЗ МЫШЕЧНОЙ ИНВАЗИИ

Набебина Татьяна Ивановна

Минск, 2017

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Заболеваемость злокачественными новообразованиями мочевого пузыря находится на достаточно высоком уровне во многих странах. Ежегодно в мире регистрируется около 430 000 вновь выявленных случаев заболевания, и более чем 165 000 пациентов умирают. Самые высокие показатели заболеваемости наблюдаются в Северной Америке и Западной Европе [GLOBOCAN, 2012].

Республика Беларусь входит в группу стран с примерно средними по Европе показателями заболеваемости. В Республике Беларусь в структуре всех злокачественных новообразований частота переходно-клеточного рака мочевого пузыря в 2014 году составила 2, 5%, среди вновь заболевших мужчин его доля достигла 3, 9%, а среди женщин - 1, 2%. Отмечается увеличение частоты выявления новых случаев рака мочевого пузыря за 2000-2013 годы - с 10, 5 до 12, 3 случаев на 100 000 жителей. Заболеваемость женщин в 7 раз ниже, чем мужчин: 14, 9 и 2, 2 на 100 000 жителей соответствующего пола (стандартизованные показатели) в среднем за 2000-2014 годы [Океанов А. Е. и соавт., 2016].

При первичной диагностике 75-85% опухолей мочевого пузыря относятся к раку мочевого пузыря без инвазии в мышечный слой (РМПБМИ), который объединяет неинвазивный (рТа и карцинома in situ, соответственно 70 и 5-10% всех случаев) и инвазирующий подслизистую соединительную ткань переходно-клеточный рак (рТ1, 20-25%) [van Rhijn Bas W. G., 2009]. Это гетерогенная группа опухолей с различной частотой рецидивирования и дальнейшего прогрессирования с развитием инвазии мышечного слоя: возможность рецидива в течение 1-го года после проведенного лечения составляет (по разным данным) от 15 до 70%, вероятность прогрессирования в течение 5 лет от начала заболевания - от 7 до 40% [Sylvester R. J., 2006, van Rhijn Bas W. G., 2009].

Основным способом лечения пациентов, страдающих переходно-клеточным РМПБМИ, является органосохраняющий: выполнение трансуретральной резекции с/без последующей внутрипузырной терапии (вакцина БЦЖ, химиотерапия). У некоторых пациентов после проведенного лечения заболевание прогрессирует с развитием инвазии мышечного слоя и метастазирования. В случае развития инвазии мышечного слоя и/или метастазирования раково-специфическая выживаемость, несмотря на проводимое агрессивное лечение, составляет всего 35% [van den Bosch S., 2011, Orsola A., 2015]. Цистэктомия может предотвратить прогрессирование опухолевого процесса и связанное с этим резкое ухудшение прогноза заболевания [Herr H. W., 2001]. Однако даже в группе пациентов с высоким риском прогрессирования рекомендуемая ранняя цистэктомия может оказаться избыточным травматичным вмешательством в 45-65% случаев [Sylvester R. J., 2006, Fernandez-Gomez J., 2008]. Это определяет необходимость поиска дополнительных характеристик опухоли, определяющих неблагоприятное течение заболевания, что позволит обоснованно выполнять раннее радикальное хирургическое вмешательство, предотвратить прогрессирование заболевания и смерть от рака. Наиболее перспективной в этом отношении группой параметров являются гистологические и молекулярно-генетические характеристики опухоли.

Связь работы с научными программами (проектами), темами

Диссертация выполнена в рамках научно-исследовательских работ по темам:

02.06. Разработать новый метод оценки прогноза клинического течения рака мочевого пузыря посредством комплексного анализа клинико-морфологических параметров опухоли и молекулярно-генетического статуса гена FGFR3. ГНТП «Новые технологии диагностики, лечения и профилактики», подпрограмма «Онкология», № гос. регистрации 20101347, сроки выполнения 1 кв. 2010 - 4 кв. 2014 гг.

02.13. Разработать и внедрить метод определения биологической агрессивности немышечно-инвазивного переходно-клеточного рака мочевого пузыря путем комплексной оценки морфологических и молекулярно-биологических характеристик опухоли. ГНТП «Новые технологии диагностики, лечения и профилактики», подпрограмма «Онкология», № гос. регистрации 20132061, сроки выполнения 1 кв. 2013 - 4 кв. 2015 гг.

Диссертационная работа соответствует приоритетному направлению фундаментальных и прикладных научных исследований Республики Беларусь на 2011-2015 годы, отраженному в пункте 4.2 «Новые технологии профилактики, диагностики, лечения и реабилитации сердечно-сосудистых, онкологических и других социально значимых заболеваний» постановления Совета Министров Республики Беларусь «Об утверждении перечня приоритетных направлений фундаментальных и прикладных научных исследований Республики Беларусь» от 19 апреля 2010 года № 585.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - повысить эффективность оценки биологической агрессивности переходно-клеточного рака мочевого пузыря без мышечной инвазии путем разработки диагностического алгоритма на основе определения гистологического и молекулярно-генетического профиля опухоли.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать клинико-морфологические признаки рака мочевого пузыря без мышечной инвазии с оценкой межисследовательской изменчивости при определении стандартных гистологических характеристик опухоли (степени дифференцировки/злокачественности, степени местной распространенности, наличия карциномы in situ в участках слизистой оболочки мочевого пузыря, прилежащих к опухоли).

2. Оценить уровень экспрессии белков ki67, р53, р63 в клетках рака мочевого пузыря без мышечной инвазии в зависимости от гистологических характеристик опухоли.

3. Выявить характер и уровень экспрессии различных классов цитокератинов (СК5/6, 10/13, 18, 20) для определения фенотипа переходно-клеточного рака мочевого пузыря без мышечной инвазии (люминальный или базальноклеточный фенотип).

4. Установить статистически значимые гистологические и молекулярно-генетические факторы прогноза прогрессирования рака мочевого пузыря без мышечной инвазии.

5. В мультивариантном анализе выявить иммуногистохимические характеристики, имеющие независимое прогностическое значение в отношении выживаемости до прогрессирования, и на их основе разработать диагностический алгоритм оценки риска прогрессирования рака мочевого пузыря без мышечной инвазии.

Научная новизна

Доказан высокий уровень межисследовательской изменчивости при определении гистологических характеристик переходно-клеточного рака мочевого пузыря без мышечной инвазии (степень дифференцировки/ злокачественности опухоли, степень местной распространенности), имеющих прогностическое значение при определении вероятности прогрессирования рака мочевого пузыря без мышечной инвазии. Определены уровни экспрессии белков ki67, р53, р63 и различных классов цитокератинов (СК5/6, 10/13, 18, 20), отражающих фенотип опухоли, у пациентов из числа жителей Республики Беларусь. Установлены корреляционные связи гистологических и молекулярно-генетических критериев. Выявлены иммуногистохимические характеристики опухоли, имеющие независимое прогностическое значение при определении вероятности прогрессирования рака мочевого пузыря без мышечной инвазии. Разработан диагностический алгоритм оценки риска прогрессирования рака мочевого пузыря без мышечной инвазии, позволяющий выделить группу пациентов, которым показана ранняя цистэктомия.

Положения, выносимые на защиту

1. Стандартные гистологические характеристики опухоли при раке мочевого пузыря без мышечной инвазии коррелируют с молекулярно-генетическими показателями. При переходно-клеточном раке с низкой степенью дифференцировки доля опухолей, демонстрирующих высокий уровень пролиферативной активности (Ki67>10% опухолевых клеток), гиперэкспрессию р53 (?50% опухолевых клеток), высокий уровень экспрессии СК20 (>10% опухолевых клеток), а также низкий уровень экспрессии р63 (<30% опухолевых клеток) возрастала на 48, 4%, 43, 8%, 29, 8% и 26, 4% соответственно по сравнению с высокодифференцированным переходно-клеточным раком (р<0, 05). При переходно-клеточном раке со степенью местной распространенности рТа/рТ1m и рТ1е низкий уровень экспрессии СК20 (<10% опухолевых клеток) наблюдался в 64, 3% и 28, 6% соответственно (р=0, 02).

2. Риск прогрессирования рака мочевого пузыря без мышечной инвазии при наличии в опухоли позитивной ядерной реакции с антителами к белку р53 и/или позитивной цитоплазматической реакции с антителами к СК5/6, равной или более чем в 50% опухолевых клеток, в 3, 97 раза выше, чем в случае реакции с антителами к р53 и СК5/6 менее чем в 50% опухолевых клеток (95% ДИ 2, 25-7, 01).

3. Разработанный на основании мультивариантного анализа комбинированный алгоритм определения риска прогрессирования по критериям EORTC с последующим выполнением в группе высокого риска иммуногистохимического исследования с антителами к белкам р53 и СК5/6 позволяет выделить группу пациентов с неблагоприятным прогнозом с пятилетней выживаемостью до прогрессирования на 26, 4% ниже, чем при отсутствии дополнительных факторов негативного прогноза.

Личный вклад соискателя ученой степени

Личное участие автора в выполнении диссертационной работы состояло в изучении отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, обосновании актуальности темы исследования, анализировании медицинской документации и создании базы данных пациентов, страдающих переходно-клеточным РМПБМИ, выполнении световой микроскопии гистологических микропрепаратов переходно-клеточного рака мочевого пузыря, оценке результатов иммуногистохимического исследования, позволившего определить уровни экспрессии белков ki67, р53, р63, СК5/6, 10/13, 18, 20. Проанализированы полученные клинические, светооптические и иммуногистохимические данные, проведена их статистическая обработка, полученные результаты изложены в виде диссертационной работы. Постановка целей, задач, обоснование методологии научного исследования и интерпретация полученных результатов, формулирование положений, выносимых на защиту, проведены совместно с научным руководителем доктором медицинских наук, профессором, членом-корреспондентом НАН Беларуси А. С. Красным.

Апробация диссертации и информация об использовании ее результатов

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях и съездах: 9-й Конгресс Российского общества онкоурологов, Москва, 1-3 октября 2014 г.; Республиканская научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные вопросы диагностики и лечения онкоурологической патологии», Минск, 12 декабря 2014 г.; 30-й ежегодный конгресс Европейского общества урологов, Мадрид, 20-24 марта, 2015 г. (30th Annual EAU Congress, Madrid, 20-24 March, 2015); научная сессия БГМУ, посвященная Дню медицинской науки, секция «Медико-биологические науки №1», Минск, 26 января 2016 г.; 31-й ежегодный конгресс Европейского общества урологов, Мюнхен, 11-15 марта, 2016 г. (31th Annual EAU Congress, Munich, 11-15 March, 2016); 3-я Балтийская конференция Европейского общества урологов, Таллинн, Эстония, 27-28 мая 2016 г. (3rd EAU Baltic Meeting, Tallinn, Estonia, 27-28 May, 2016); IX Cъезд онкологов и радиологов стран СНГ и Евразии, Минск, Беларусь, 15-17 июня 2016 г. Разработаны инструкции по применению «Метод оценки прогноза клинического течения рака мочевого пузыря на основе комплексного анализа клинико-морфологических и генетических параметров опухоли», регистрационный № 121-1114, утверждена Министерством Здравоохранения Республики Беларусь 27.11.14 г., «Метод определения биологической агрессивности немышечно-инвазивного переходно-клеточного рака мочевого пузыря», регистрационный № 110-1015, утверждена Министерством здравоохранения Республики Беларусь 04.11.2015 г. Соискателем совместно с соавторами оформлена заявка на изобретение «Способ оценки вероятности прогрессирования переходно-клеточного рака мочевого пузыря без мышечной инвазии», заявка на выдачу патента а20150507, дата поступления заявки 26.10.2015 г.

Полученные результаты внедрены для практического применения в онкологическом урологическом отделении РНПЦ ОМР им. Н.Н. Александрова, в учебный процесс кафедры онкологии государственного учреждения образования «Белорусская медицинская академия последипломного образования».

Опубликованность результатов диссертации

Результаты диссертационного исследования опубликованы в 35 научных работах: 9 статей в журналах (из них 4 статьи в зарубежных журналах), соответствующих пункту 18 Положения о присуждении ученых степеней и присвоении ученых званий в Республике Беларусь, 24 - в материалах и тезисах докладов научных конференций, 2 инструкциях по применению, утвержденных Министерством здравоохранения Республики Беларусь. Подана 1 заявка на изобретение. Общее количество авторских листов опубликованных статей - 4, 6 авторских листа.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 112 страницах, содержит 14 таблиц и 22 рисунка, включает введение, общую характеристику работы, аналитический обзор литературы, 4 главы собственных исследований, заключение, библиографический список, состоящий из 191 источника (из них 2 - на русском языке, 189 - на английском языке) и 35 собственных публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Работа основана на ретроспективном анализе медицинской документации, архивных микропрепаратов, биопсийного и операционного материала пациентов с патологическими процессами мочевого пузыря, пролеченных в онкоурологическом отделении РНПЦ ОМР им. Н. Н. Александрова в 2004-2007 гг. В исследование включено 179 пациентов с переходно-клеточным РМПБМИ, имевших высокий риск прогрессирования заболевания (от 7 до 15 баллов). Для оценки риска прогрессирования заболевания использованы рекомендации Европейской организации по исследованию и лечению рака (EORTC), предлагающей учитывать следующие характеристики опухоли: степень дифференцировки/злокачественности (ВОЗ 1973 (G1, G2, G3)), степень местной распространенности (Ta, T1), наличие карциномы in situ (CIS), множественность (единичная, от 2 до 7, 8 и более опухолей) и размеры (до 3 см, 3 см и более) опухоли, время возникновения первого рецидива (первичная опухоль, 1 рец/год, >1 рец/год). Клинические данные о пациентах приведены в таблице 1.

Таблица 1. - Клиническая характеристика пациентов

Определение гистологических характеристик опухоли выполнено при световой микроскопии. Соискателем в соответствии с разработанной схемой выполнена оценка архивных микропрепаратов 179 пациентов, страдающих РМПБМИ. Определение степени дифференцировки/злокачественности выполнено по классификационным системам, принятым Всемирной Организацией здравоохранения в 1973 году и 2004 году (ВОЗ 1973 и ВОЗ 2004, соответственно) с применением диагностического алгоритма для переходно-клеточных новообразований мочевого пузыря. Изучена степень местной распространенности опухоли (категория рТ). Субстадирование опухолей, инвазирующих подслизистый слой (рТ1), проведено по системе, которая различает T1-микроинвазивную (T1m) и T1-широко-инвазивную (T1e) опухоль. T1m - единичный очаг инвазии собственной пластинки, меньший либо равный 0, 5 мм (в пределах одного поля зрения х400), T1e - очаг инвазии собственной пластинки более 0, 5 мм либо множественные микроинвазивные поля (рисунок 1).

При оценке «плоского» внутриэпителиального поражения учтены следующие характеристики: толщина (количество слоев) и сохранение полярности переходного эпителия, просветление цитоплазмы клетки, увеличение размеров ядра, скопления ядер, изменение формы ядер, внутриядерные включения, распределение хроматина в ядре, наличие ядрышек, митозов, сопутствующее воспаление и новообразование сосудов в подлежащих тканях (рисунок 2).

Оценено наличие внутрисосудистой инвазии в микропрепаратах, окрашенных гематоксилином-эозином. Этот признак оценивался как положительный при наличии в просвете сосуда полностью свободного кластера клеток с гладкими границами; клетки, составляющие опухолевый тромб, плотно спаяны между собой, уплощены по периферии тромба. В сосуде прослеживался четкий слой эндотелия, присутствовали клетки крови в пространстве между стенкой сосуда и тромбом. Окружающая стромальная ткань имела нормальное гистологическое строение.

Иммуногистохимическое определение молекулярно-генетических характеристик опухоли. В опухолевом материале 179 пациентов по стандартной методологии выполнено иммуногистохимическое исследование. Для выполнения исследования использованы следующие клоны первичных антител: ki67 - клон MIB-1, готовые к употреблению, р53 - клон DO-7, рабочее разведение 1:300, р63 - клон 4A4, рабочее разведение 1:300, СК5/6 - клон DS/16B4, рабочее разведение 1:50, СК10/13 - клон DE-K13, рабочее разведение 1:200, СК20 - клон Ks20.8, рабочее разведение 1:100, СК18 - клон DC10, рабочее разведение 1:300.

В качестве визуализирующей системы использована En Vision+Dual Link System-HRP, рН демаскировочного буфера 9, 0 (производитель Dako Denmark). Результаты иммуногистохимической реакции оценены при световой микроскопии с учетом характера экспрессии (позитивная окраска ядра опухолевой клетки - для p53, ki67, р63, позитивная окраска цитоплазмы клеток, характерная для цитокератинов СК5/6, СК10/13, СК18, СК20) (рисунки 3, 4).

Количество позитивно окрашенных клеток подсчитывалось в пяти различных полях зрения при увеличении х400 (окуляр х10, объектив х40). Определялось количество позитивно окрашенных клеток и общее число опухолевых элементов в каждом выбранном поле зрения, а также процентное соотношение числа позитивных клеток к общему числу опухолевых элементов. За окончательный результат принято среднее арифметическое полученных пяти значений, округленное до целого числа, результат выражен в процентах.

Для учета количества позитивных клеток, как с ядерным, так и с цитоплазматическим окрашиванием, использована следующая система определения баллов: 0 реакция в менее чем 10% клеток, 1 реакция в 1030% клеток, 2 реакция в 3149% клеток, 3 реакция равная или более чем в 50% клеток.

Результаты исследования

Гистологические характеристики опухоли. При световой микроскопии архивных микропрепаратов, окрашенных гематоксилином-эозином, степень злокачественности опухоли по системе ВОЗ 1973 определена как высокодифференцированный рак (grade 1) в 51 (28, 4%) случае, умеренно дифференцированный (grade 2) - в 96 (53, 6%) случаях, низкодифференцированный (grade 3) - в 32 (17, 8%) случаях. При определении степени злокачественности по системе ВОЗ 2004 в 27 (15, 1%) случаях установлен диагноз папиллярная переходно-клеточная опухоль с низким злокачественным потенциалом, в 79 (44, 1%) случаях - папиллярный переходно-клеточный рак низкой степени злокачественности, в 73 (40, 8%) случаях - папиллярный переходно-клеточный рак высокой степени злокачественности. Степень местной распространенности рТ1 (наличие инвазии базальной мембраны) выявлена у 98 пациентов. Единичный очаг инвазии собственной пластинки, меньший либо равный 0, 5 мм (в пределах одного поля зрения х40) (рT1m) описан у 31 (17, 3%). Очаги инвазии собственной пластинки более 0, 5 мм либо множественные микроинвазивные поля (рT1e) - у 67 (37, 5%). В 81 (45, 2%) случаев инвазия подслизистого слоя отсутствует (рТа). В 23 случаях (12, 8%) клеточная и тканевая атипия в пределах переходного эпителия имели максимальную выраженность, эти изменения охарактеризованы как переходно-клеточный рак in situ. Лимфососудистая инвазия выявлена в 11 (6, 1%) случаях в зоне опухоли. Перитуморозная инвазия сосудов не определяется.

Межисследовательская изменчивость. Проведено сравнение результатов определения гистологической степени злокачественности и степени местной распространенности опухоли, полученных при выполнении исследования, с результатами первичного заключения патологоанатома (заключение, сделанное при первичной оценке микропрепаратов в 2004-2007 гг.). Оценен уровень межисследовательской воспроизводимости, рассчитаны показатели согласия (%), каппы Коэна и их 95% доверительные интервалы (ДИ). Вычислена выживаемость до прогрессирования в зависимости от степени дифференцировки/ злокачественности и категории рТ заболевания, определенной при первичном исследовании и при повторном пересмотре. В ходе настоящего исследования выявлена низкая степень межисследовательского согласия при определении степени дифференцировки/злокачественности переходно-клеточного рака независимо от использованной классификации (ВОЗ 1973 и ВОЗ 2004); согласно использованной методологии, согласие можно оценить как очень слабое, слабое и умеренное. Наибольшее (умеренное) межисследовательское согласие наблюдалось при определении низкодифференцированного переходно-клеточного рака (ВОЗ 1973). При определении категории рТ межисследовательское согласие отсутствует.

Корреляционные взаимосвязи исследованных гистологических параметров. Выявлено наличие статистически значимой сильной (коэффициент корреляции более 0, 7) корреляционной зависимости между различными схемами определения степени дифференцировки/злокачественности опухоли (классификация ВОЗ 1973, 2004). Статистически значимая умеренная (коэффициент корреляции более 0, 5) корреляционная зависимость существует между такими характеристиками, как степень дифференцировки/ злокачественности (как по классификации ВОЗ 1973, так и по ВОЗ 2004) и степень местной распространенности (рТ), p<0, 001 в обоих случаях. Вероятность выявления рака in situ в соседних с основной опухолью участках слизистой оболочки мочевого пузыря статистически значимо коррелировала со степенью дифференцировки/злокачественности опухоли по классификации ВОЗ 2004, p<0, 001 и степенью местной распространенности опухоли, p=0, 033.

Корреляционные связи между молекулярно-генетическими и стандартными гистологическими характеристиками опухоли. Для оценки биологической значимости изучаемых иммуногистохимических показателей проведен анализ их связи с гистологическими факторами прогноза биологической агрессивности опухоли (степень дифференцировки/злокачественности, степень местной распространенности, наличие карциномы in situ). Уровень экспрессии ki67, р53 и СК20 статистически значимо коррелирует со степенью дифференцировки/злокачественности и степенью местной распространенности опухоли. Отмечено снижение уровня экспрессии р63 при нарастании клеточной и тканевой атипии в переходно-клеточном раке. Не отмечено наличия прямой корреляционной зависимости ни с одним из стандартных гистологических параметров таких показателей как кератины СК5/6, СК10/13, СК18 и кератиновые фенотипы опухолей (люминальный и базальноклеточный).