Экспериментальное исследование параметров электрического раздражения зрительной коры с целью разработки зрительного протеза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Научный центр неврологии Российской Академии Медицинских наук

Отдел исследований мозга

Лаборатория нейрокибернетики

03.03.01 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Экспериментальное исследование параметров электрического раздражения зрительной коры с целью разработки зрительного протеза

Иванова Марианна Евгеньевна

Москва, 2009

Работа выполнена в лаборатории нейрокибернетики (заведующий - д.б.н. Б.Х. Базиян) отдела исследований мозга научного центра неврологии РАМН (директор центра - академик РАМН, профессор, д.м.н. З.А. Суслина).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Базиян Борис Хоренович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Журавлев Борис Васильевич;

доктор биологических наук, профессор Полянский Владимир Борисович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук институт физиологии им. И.П. Павлова

Защита состоится на заседании Диссертационного совета Д 002.044.01 Учреждения Российской Академии Наук Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН по адресу: 117485, Москва, ул. Бутлерова, д. 5а. Факс: 8(495)338-85-00; E-mail: admin@ihna.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Владимир Вячеславович Раевский

Список используемых сокращений

КЗП - кортикальный зрительный протез;

МКИ - мозг-компьютерный интерфейс;

МФП - модель фосфенного поля;

МЭМ - микроэлектродная матрица;

УР - условный рефлекс.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. По данным ВОЗ в мире насчитывается более 37 миллионов слепых людей (ВОЗ, 2002). В настоящее время разрабатываются несколько подходов для восстановления зрительных функций у людей с необратимой слепотой, в том числе трансплантация стволовых клеток (Haynes T., 2004, Haruta M., 2005), фоторецепторов (Gouras P., 1996) и клеток пигментного эпителия (Tamai M., 1996, Abe T., 2002) в сетчатку, направленное влияние на метаболизм сетчатки ростовыми факторами (Gao G. et al., 2002) и другими агентами, которые замедляют гибель фоторецепторов, а также генная инженерия (Acland G. et al., 2001 и др.).

Параллельно с биологическим подходом развивается протезирование зрения с помощью "мозг-компьютерных" интерфейсов (brain-computer interface - BCI). В настоящее время применяются два основных подхода: ретинальный (Humayun M.S. et al., 1996) и кортикальный, в которых микроэлектродные матрицы имплантируют соответственно в сетчатку или зрительную кору головного мозга. При ретинальном протезировании обработка мозгом поступающих сигналов от сетчатки дает более качественное изображение, сходное с таковым у зрячих людей, однако важным условием является сохранность зрительных нервов, кроме того, большую проблему составляет риск отрыва матрицы при движениях глаз.

При кортикальном протезировании достаточно легкий хирургический доступ для имплантации, движение глаз не играет роли и сохранность зрительных нервов не обязательна, однако "фосфенная" карта мира ("фосфены" - зрительные перцепции без воздействия света), моделируемая таким способом незрячему человеку, сильно отличается от того, что мы привыкли называть зрением, потребуется период адаптации и обучения (Базиян Б.Х. и соавт., 2008), кроме того, непосредственная стимуляция микроэлектродной матрицей клеток зрительной коры головного мозга может привести к ряду нежелательных осложнений (Dobelle W.H. et al., 2000).

Поэтому для разработки кортикального зрительного протеза является критически важным выбор материала для изготовления микроэлектродов, определение безопасных параметров стимуляции коры головного мозга, а также при каких параметрах раздражающего тока (амплитуды, частоты, скважности) в безопасном диапазоне в мозге возникают "фосфены".

В доклинической фазе испытаний необходима проверка микроэлектродных матриц на способность вызывать фосфены для отладки процесса производства наиболее функциональных устройств. В качестве нейрофизиологической модели для экспериментальной оценки предлагались различные животные: приматы (Tehovnik E.J. et al., 2005), свиньи (Gekeler F. Et al., 2006) и другие. Основными требованиями к лабораторной модели являются сходство структурно-функциональной организации зрительного анализатора с таковой у человека, обучаемость и возможность проводить поведенческие эксперименты. зрительный протез слепота

В представляемой работе мы предлагаем использовать в качестве нейрофизиологической модели кошку - животное, хорошо способное к обучению, чья зрительная система при всех известных различиях достаточно близка к человеческой и стоимость содержания которого меньше, чем приматов.

Целью настоящего исследования является разработка экспериментальной нейрофизиологической модели для определения функциональности имплантируемого кортикального зрительного протеза при электрическом раздражении зрительной коры, и определение при этом безопасности его параметров, вызывающих фосфены, используемые для создания зрительных протезов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать на основе периферического и центрального условных рефлексов поведенческую нейрофизиологическую модель.

2. В эксперименте имплантировать электроды кортикального зрительного протеза на разную глубину в зрительной области коры (поле 17) лабораторного животного: на поверхность коры - субдурально (эпикортикальный подход) и в глубину - 3-4 слои (интракортикальный подход).

3. Определить параметры электрического раздражения зрительной коры кошки, т.е. силу тока, напряжение, длительность, полярность и частоту импульса, общую длительность трейна, количество стимулируемых электродов, при которых возникают фосфены в этих подходах.

4. Провести сравнительную характеристику параметров раздражения, вызывающих фосфены, для эпи- и интракортикальной имплантации электродов и матрицы.

5. На основе результатов сравнения параметров, полученных при различной локализации электродов, определить наиболее оптимальную локализацию электродов при имплантации кортикального зрительного протеза.

6. Проверить с помощью разработанной поведенческой нейрофизиологической модели имплантируемые электроды кортикального зрительного протеза на функциональность.

Научная новизна

Впервые разработана поведенческая нейрофизиологическая модель на кошке для исследования имплантируемых микроэлектродных матриц кортикального зрительного протеза на функциональность. Аналогов идеи данной методики и модели и ее осуществления в России и за рубежом нет.

Впервые на кошках получены параметры электрического раздражения коры эпи- и интракортикальными электродами и проведен сравнительный анализ этих параметров с целью определения оптимального выбора соответствующих матриц для имплантации. Использованы электроды, изготовленные как в лаборатории нейрокибернетики, так и микроэлектродные платы, изготовленные фирмой "NeuroConnex" (Германия).

Научно-практическая значимость

Применение разработанной нами нейрофизиологической модели на кошке для поведенческой проверки функциональности микроэлектродных матриц открывает новые возможности в области кортикального зрительного протезирования и изучения функциональной организации и структуры зрительной системы.

Благодаря относительной простоте в применении и доступной цене она может быть использована для качественной проверки на доклиническом этапе функциональности микроэлектродных матриц. После таких экспериментов появляется возможность перейти к клиническим испытаниям на пациентах серийно производимых сертифицированных микроэлектродных матриц. Нейрофизиологическая поведенческая модель достаточно адекватно отражает характеристики параметров электрического раздражения коры, при которых индуцируются фосфены.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная поведенческая нейрофизиологическая модель позволяет проверять матрицы и электроды кортикального зрительного протеза на функциональность.

2. Определены параметры электрического раздражения зрительной коры мозга кошки, которые приводят к индукции и перцепции животным зрительных вспышек-фосфенов.

3. Интракортикальная имплантация микроэлектродов позволяет применять значительно меньшие токи для индукции фосфенов, чем субдуральная (эпикортикальная), что снижает количество осложнений в процессе использования протеза и позволяет значительно увеличить количество электродов.

Апробация работы

Основные результаты и положения выносимой на защиту диссертации были обсуждены в международных конференциях ARVO (Association research in vision and ophthalmology), США, 2008; EMBC Annual International IEEE EMBS, Канада, 2008; "Advances in ophthalmology", конференции молодых ученых, ГУ НИИ глазных болезней им. Гельмгольца, Россия, 2008; на ХХ съезде физиологического сообщества им. И.П. Павлова, Россия, 2007; на VII Съезде нейроофтальмологов России, НИИ нейрохирургии им. Бурденко, Россия, 2008; на XII научной конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии, ИВНД и НФ РАН, 2008; на конференции молодых ученых "Актуальные проблемы офтальмологии" МНТК микрохирургии глаза им С.Н. Федорова Москва, Россия, 2006. Доклад удостоен премией за лучшую работу среди молодых ученых на конференции.

Публикации

Материалы диссертации представлены в 14 публикациях (из них 3 в рецензируемых журналах), список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 133 страницах, иллюстрирована 33 рисунками и 15 таблицами. Список литературы включает 149 источников, из них 33 - на русском и 116 - на иностранных языках.

Объект и методы исследования

Тринадцать взрослых здоровых кошек были предварительно испытаны на "способность" к тестам по выработке условных пищевых рефлексов. Одиннадцать из них были взяты для последующего экспериментального исследования.

В эксперименте мы использовали хорошо известный и описанный принцип переноса классического периферического условного рефлекса в центральный условный рефлекс. Наш подход заключался в выработке у всех животных условного пищедобывательного рефлекса в ответ на предъявление "модели фосфенного поля" (МФП) с последующим центральным рефлексом при раздражении током зрительной коры (поле 17).

Имплантировали поверхностные и интракортикальные (на уровень 3-4-го слоя) электроды диаметром 1,0 мм, 0,2 мм или 0,05 мм. В зависимости от глубины имплантации и диаметра электрода животные были разделены на 4 группы.

Перед вживлением все электроды и матрицы стерилизовали в этиловом спирте. Точность введения электродов контролировали по координатам атласа Rejnoso-Suarez et al. (1961) и с помощью вызванных потенциалов на свет, локализацию кончика электрода определяли с точностью до слоя по изменениям вызванного потенциала. После окончательного использования некоторым животным проводили морфологический контроль положения кончиков электродов.

Имплантацию электродов для хронических экспериментов проводили под нембуталовым наркозом в экранированной экспериментальной камере в стерильных условиях на кошках обоего пола весом 2,5 - 4,5 кг.

После 12 - 24 - часовой пищевой депривации вводили нембутал в дозе 33-35 мг/кг, животное через 15 минут засыпало, и его укрепляли в стереотаксическом приборе типа М 13-4101. Поверхность кожи на черепе сбривали от носа до загривка, место надреза обрабатывали йодом, кожу надрезали от переносицы до загривка. После этого часть головных мышц на вскрываемой поверхности вырезали, тщательно очищали череп от остатков мягкой ткани шпателем и осушали перекисью водорода.

Координаты электродов размечали на черепе по атласу и осторожно сверлили бором отверстия до мозговой оболочки. Поверхностные электроды вживляли эпикортикально, перед вживлением интракортикальных аккуратно протыкали мозговую оболочку инъекционной иглой. Процедуру вживления проводили в одном и том же направлении (ростро-каудальном или каудо-ростральном). Возникающий из-под введенных электродов на поверхность кости ликвор отсасывали ватными или марлевыми фитилями. Крепили электроды акрилоксидом. Всю свободную поверхность кости, которая должна была находиться под "пробкой", также сначала покрывали акрилоксидом.

После процедур имплантации электродов и матрицы острые углы и выступы нивелировали фрезой, операционное поле тщательно очищали, рану обрабатывали бициллином, пенициллином или стрептоцидом и зашивали. Затем вводили внутримышечно бициллин (100000 ед. на 1 мл новокаина). В конце операции вживления регистрировали контрольные зрительные вызванные потенциалы на свет. Животное вынимали из стереотаксического аппарата и помещали в послеоперационный бокс, где оно приходило в себя после наркоза.

Каждое животное использовалось в течение нескольких недель/месяцев, количество экспериментов с каждым животным по определенной программе составляло несколько десятков.

После проведенной имплантации и периода реабилитации в течение 5-7 дней животное брали в поведенческий эксперимент.

Стимулирующая и регистрирующая аппаратура. Фотостимуляцию при вертикальных проходках проводили прибором типа ФС-2 с насаженной к лампе-вспышке самодельной оптической системой, позволяющей регулировать размер светового луча от 1 углового градуса и выше. Длительность вспышки была 50 мкс, интенсивность 0,3 Дж. Для регистрации биосигналов мозга использовали усилители фирмы "Nihon Kohden" (Япония), подключенные к компьютеру. Верхняя полоса используемых частот составляла 150 Гц, нижняя ограничивалась постоянной времени усилителей, которую при изучении ВП брали равной 0,5 с. Для электрического раздражения коры применяли двухканальный стимулятор фирмы "Nihon Kohden"" (Япония), выходы которого были соединены с раздражающими электродами через изолирующие трансформаторы той же фирмы. Токи и напряжение раздражения измеряли этим же прибором. Импеданс электродов измеряли прибором фирмы "Dantec" Type15B45.

Контроль положения имплантированных электродов осуществлялся тремя способами: стереотаксически, электрофизиологически, морфологически.

Модель "фосфенного поля" (МФП) представляла собой условный раздражитель в виде зрительного паттерна в виде нескольких (4 - 7) пучков света диаметром примерно в 1 угловой градус ("имитация фосфенного поля"). Животное обучали поднимать какую-либо лапу при включении светового паттерна МФП, положительным подкреплением служил кусочек мяса. Так как животное перед проведением обучения не кормили в течение нескольких часов, то правильный ответ в виде поднятия лапы на включение светового паттерна с последующим вознаграждением в виде кусочка мяса служили достаточным мотивирующим фактором для животного, чтобы обучиться рефлексу. Во время эксперимента, чтобы ограничить передвижения животному надевали жилет, который веревками прикреплялся к штангам, фиксируя таким образом свободу перемещения животного в радиусе 50 - 70 см.

Выработка условного рефлекса в экспериментальной группе животных в среднем занимала 13 ± 2 дня. Из 13 животных одиннадцать быстро и четко обучились ответу на световой стимул. Оставшиеся животные либо слишком медленно обучались до необходимого процента правильных ответов, либо животное "понимало", что от него требуется, но вследствие индивидуальных особенностей и "характера", уровень правильных ответов в среднем не превышал 40 - 50%. Поэтому данные животные не были взяты в эксперимент по имплантации микроэлектродов и матриц. Cтоимость одной микроэлектродной матрицы фирмы NeuroConnex составляет порядка 1800 евро. На основе взаимовыгодного сотрудничества нам были предоставлены матрицы фирмы NeuroConnex, которые мы имплантировали трем животным (№№ 5, 8, 13). Восьми животным была проведена имплантация микроэлектродов собственного производства (№№ 1, 2, 4, 7, 9, 10, 11, 12).

Выработка условного рефлекса. Вначале кошку обучали класть лапу на фонарик в тот момент, когда он зажигался. При правильной реакции животное подкармливалось. Затем фонарик отодвигали от него на расстояние 5 - 10 см. Для быстрого и эффективного обучения кошке надевали жилет, который на веревках прикреплялся к штангам, и тем самым, ограничивая степень ее подвижности, заставлял протягивать лапу (неважно какую) в направлении отдаленного фонарика во время его зажигания.

Обучение завершали через 15 дней, при уровне правильных ответов более 70%. Латентный период поднятия лапы в зависимости от животного изменялся от 2 до 10 сек и стабилизировался на уровне 3-4 сек в конце обучения, суетливые и неуверенные движения исчезали, что указывало на прочность рефлекса. Таким образом, вырабатывался рефлекс на предъявление МФП.

На следующем этапе после имплантации и пятидневного периода реабилитации проводили зрительную депривацию - на глаза животного накладывали повязку из плотного материала.

При закрытых повязкой глазах кошка получала электрическое раздражение коры одновременно от одного или нескольких электродов с помощью двухканального электростимулятора фирмы Nihon Kohden (Япония) выходы которого были соединены с раздражающими электродами через изолирующие трансформаторы той же фирмы. Параметры раздражения (силу тока, полярность и длительность импульса, частоту и длительность трейна импульсов) изменяли при такой конфигурации электродов до тех пор, пока не получали понятных ответов (поднятия лапы).

Сопротивление микроэлектродов измеряли каждый месяц после имплантации.

Результаты исследований

Полная характеристика экспериментальной группы животных представлена в табл. 1.

На основе переноса периферического условного рефлекса в центральный нами была разработана нейрофизиологическая модель для исследования крайних значений параметров электрического раздражения зрительной коры головного мозга, при которых возникают фосфены.

На рис. 1, А отображено животное с установившимся условным рефлексом поднятия лапы в ответ на предъявление МФП в фиксирующем жилете в экспериментальной камере. Затем животному надевали повязку (рис. 1, Б), которой зашторивали глаза, и которая не мешала дышать.

Табл. 1. Характеристика экспериментальной группы животных.

А Б В

Рис. 1. Представление разработанной нейрофизиологической поведенческой модели.

Затем проводили электрическую стимуляцию коры головного мозга различными параметрами, и в некотором их диапазоне животное поднимало лапу (рис. 1, В) точно так же, как и при предъявлении "модели фосфенного поля".

Все параметры, которые были изменяемы в ходе эксперимента по электрической стимуляции, представлены на рис. 2. Обозначены параметры самой составляющей МКИ кортикального зрительного протеза (топика имплантации, диаметр микроэлектродов и количество стимулируемых микроэлектродов от 1 до 8), указаны параметры, изменение величин которых проводили дискретно, опираясь на данные литературы (частота раздражения, полярность импульса и длительность трейна импульсов). Интервалами указаны наиболее значимые параметры для возникновения фосфенов (сила тока, сопротивление одиночного электрода, общее сопротивление стимулируемых микроэлектродов и длительность импульса).

В ходе эксперимента был получен поведенческий ответ животного при параметрах, диапазон которых указан на рис. 3.

Рис. 2. Схема, отображающая три группы изменяемых параметров при стимуляции электродов.

Изучение сопротивления микроэлектродов. В группе эпикортикальной имплантации 1,0 мм электродов в среднем сопротивление через 7 дней после имплантации составило 2,1±1,7 кОм, через 1 месяц после имплантации - 9,2±5,3 кОм, через 8 месяцев после имплантации 21,3±9,0 кОм. В группе эпикортикальной имплантации микроэлектродов 0,05 мм сопротивление через 7 дней после имплантации составило 12,3±4,9 кОм, через 1 месяц после имплантации - 19,8±8,1 кОм, через 8 месяцев после имплантации 50,2±32,1 кОм.

Рис. 3. Связь диапазонов длительностей импульса (мс) и силы тока (мА), при которой наблюдается четкий поведенческий ответ на возникновение фосфенов при различной топике имплантации (эпи-, интракортикальной) и диаметра микроэлектрода (0,05, 0,2 или 1,0 мм.) при фиксированной частоте раздражения 100 Гц, длительности двухполярного -/+ трейна импульсов 1,0 с и четырех произвольно выбранных микроэлектродах.

В группе интракортикальной имплантации 0,2 мм электродов сопротивление через 7 дней после имплантации составило 3,2±1,7 кОм, через 1 месяц после имплантации - 8,4±3,1 кОм, через 8 месяцев после имплантации 16,5±7,2 кОм. В группе интракортикальной имплантации 0,05 мм микроэлектродов сопротивление через 7 дней после имплантации составило 9,3±5 кОм, через 1 месяц после имплантации - 14,1±7 кОм, через 8 месяцев после имплантации 47,7±30 кОм.

Имеет место тенденция значительного увеличения сопротивления электродов и микроэлектродных матриц со временем. Измеренные данные в 1 и 8 месяц достоверно отличаются. В связи с повышением сопротивления со временем приходится подавать все большее напряжение для достижения порога индукции фосфена. В табл. 2 приведены сводные данные напряжения, по результатам наших измерений во всех исследуемых животных при различной локализации имплантации электродов и их диаметре.

Табл. 2. Усредненные параметры напряжения (В), которые необходимо подавать на электроды и микроэлектроды для индукции фосфенов в зависимости от длительности нахождения их в ткани мозга.

Срок имплантации Группа животных	7 дней	1 месяц	8 месяцев
Эпи- 1,0 мм (I = 2,5 мА)	5,0	22,5	52,5
Эпи- 0,05 мм (I = 1,2 мА)	14,8	23,8	60,2
Интра- 0,2 мм (I = 0,3 мА)	0,96	2,52	4,95
Интра- 0,05 мм (I = 0,06 мА)	0,56	0,85	2,8

Таким образом, напряжение, которое необходимо подавать на электроды, за 8 месяцев повышается в несколько раз, что затрудняет использование имплантированных электродов в качестве зрительного протеза в течение длительного времени. Необходимо решить вопрос возрастания общего сопротивления, прежде чем переходить к серийным исследованиям на добровольцах. Итак, в заключение приведем обобщенные параметры электрического раздражения, при которых был получен поведенческий ответ от животного (табл. 3).



Обсуждение полученных результатов

В связи с развитием инженерной составляющей кортикального зрительного протеза не раз вставал вопрос о том, как на лабораторном этапе провести предварительную оценку эффективности предложенной инженерами новинки или технического усовершенствования. В качестве поведенческой модели для проверки функциональности имплантируемых микроэлектродных матриц предлагались самые различные животные от крыс и морских свинок до приматов. Также проводились поведенческие эксперименты с участием добровольцев.

Обоснование выбора кошки в качестве нейрофизиологической модели. Наиболее существенным отличием зрительной системы млекопитающих из отряда хищных и низших приматов от зрительной системы высших приматов, в том числе и человека, является наличие геникуло-экстрастриарных связей, т.е. связей от наружного коленчатого тела не только к стриарной коре (поле 17), но и обширных связей его со зрительными полями 18, 19. (Подвигин Н.Ф. и соавт., 1986). Вызванные потенциалы поля 17 значительно уступают по своей амплитуде этим полям.

Если по каким-либо причинам происходит длительная депривация в работе зрительного анализатора, то показано, что в отличие от клеток сетчатки, подвергающихся ремоделированию, нейроны зрительной коры долгие годы сохраняют свои зрительные свойства (Полянский В.Б. и соавт., 1981). Согласно существующему мнению, у человека афференты, передающие зрительные импульсы от сетчатки, приходят в наружное коленчатое тело, а затем отсюда передаются только в зрительную стриарную кору (т.е. в поле 17). Сюда они приходят в основной своей массе в 3-4-ые слои, где вызванный потенциал после инверсии на границе 2-ого и 3-его слоев имеет максимальную амплитуду. Отсюда они разветвляются в 3-ем слое этой коры, не доходя до 1-ого слоя, который раздражается в системе искусственного зрения у Brindley (1968) и Dobelle W.H. (2000). Поэтому, такое раздражение в принципе не является достаточно адекватным. Более адекватным являлось бы раздражение зрительного тракта или наружного коленчатого тела. Скорее всего, поэтому в указанных работах позиция фосфена в зрительном поле лишь грубо соответствовала той ожидаемой позиции, которая должна быть согласно классическим представлениям о ретинотопических проекциях зрительной коры. Вторая причина несоответствия может быть связана с деструктивными изменениями в коре после ретинальной депривации, связанной с травмой.

Вторым, очень важным отличием зрительной системы животных от таковой у человека является наличие у животных так называемой "второй зрительной системы", которая идет параллельно первой ("классической") зрительной системе в те же поля, а также в супрасильвиевую извилину (поля 5, 7 и т.д.) через переднее двухолмие, комплекс подушка-заднее латеральное ядро (Базиян Б.Х., 1993). Даже показано, что при полном разрушении стриарной коры у животных, остаточное зрение у них все же сохраняется (Любимов Н.Н. и соавт., 1972).

Итак, каково же значение разработанной нами поведенческой модели оценки функциональности кортикального зрительного протеза в ряду других поведенческих животных моделей? Лабораторные животные совершенно разных видов довольно широко применяются в разработке кортикального (и ретинального) зрительных протезов, однако в связи со специфичностью разрабатываемого устройства чрезвычайно сложно найти подходящую модель для поведенческой оценки. Предлагаемые ранее в качестве поведенческих моделей собаки, кролики и свиньи не оправдали себя в качестве хороших и эффективных нейрофизиологических поведенческих моделей, как предполагалось.

Единственными полезными "ценителями" кортикального зрительного протеза оказались самые ближайшие родственники человека - приматы. Однако масштаб исследований на приматах в последние десятилетия значительно сократился и продолжает сокращаться под давлением общественности о моральности и гуманности таких экспериментов. Кроме того, содержание приматов в регламентированных лабораторных условиях обходится намного дороже, чем кошек.

Поэтому предложенная нами модель является одной из самых эффективных после приматов как по проценту правильных ответов в поведенческих экспериментах, так и в экономическом плане.

Еще в середине прошлого века были проведены эксперименты по выявлению возможности выработки различных условных рефлексов (инструментальных, оборонительных и т.д.), где в качестве условного раздражителя было использовано не раздражение периферических сенсорных систем, а электрическое раздражение структур мозга, имеющих отношение к анализаторам мозга. Уже первые исследования показали возможность выработки, угашения и восстановления пищевых и оборонительных условных рефлексов на раздражение ряда центральных структур (стволовых, подкорковых, корковых) у разных животных, что намекало на сходство ощущений при этом с адекватными сенсорными раздражениями. Скорость переноса рефлекса из периферического в центральный, как показали исследования, довольно высока. О методах тренировки, стимуляции, порогах, генерализации стимула и переносе между зрительными, слуховыми и центральными стимулами имеется достаточно литературы (Шумихина С.И., 1981, John E.R. et al., 1975, Kelly P.J., 1973).

Предлагаемая нами нейрофизиологическая модель основана именно на этом принципе переноса периферического условного рефлекса к центральному.

Выработка условного поведенческого рефлекса. Обучение животных требует терпения, но особых сложностей не представляет. Описанная другими авторами (Шумихина С., 1981) методика работы с кошками и их обучение имеют много общих черт с нашей. Тренинг животного у нее длился в среднем 11 дней.

Параметры электрической стимуляции зрительной коры, вызывающие фосфены

Сила тока. Наши данные по параметрам стимуляции (электрического раздражения структур) мозга животных отличаются более широким диапазоном величин, чем данные Добелля и Бриндли, (Brindley G.S. et al., 1968, Dobelle W.H. et al., 2000) полученные на человеке при создании системы искусственного зрения. Это связано с целым рядом причин и в первую очередь, с видом животного, раздражаемыми структурами и электродной системой. Что касается параметров раздражения коры, то полученные нами значения параметров достаточно близки к таковым у этих авторов. Это в первую очередь объясняется одинаковыми по диаметру электродами, использованными нами. Использование более тонких электродов позволяет, незначительно травмируя мозг, имплантировать их в подкорковые структуры. Необходимо отметить, что при регистрации вызванных ответов, а также раздражении структур для исследования связей между образованиями мозга обычно в мировой литературе применяются именно такие же электроды (диаметром 0,1 - 0,3 мм), обладающие достаточной жесткостью и стойкостью к воздействию агрессивной среды наподобие мозговой (сталь, нихром и т.д.) (Bostock H. et al., 1983). Данные, полученные нами при использовании этих электродов, хорошо согласуются с данными литературы, величины параметров электрического раздражения близки к данным Doty R.W. et al. (1959), Dikmen et al. (1975) и других авторов.

Длительность одиночного импульса. Длительности импульсов изменяли от сверхкоротких до 2 мс. При этом для интракортикально имплантированных электродов для индукции поведенческого ответа на электрическую стимуляцию требовалась длина импульса от 0,1 мс и выше, тогда как для эпикортикально расположенных электродов порог индукции фосфенов составлял 0,3 мс. Полученные нами данные согласуются с данными, полученными в исследованиях Dobelle и Schmidt и описанными в литературе (Grill W.M. et al., 1996).

Длительность трейна импульсов. Как уже было сказано в главе "Результаты" при длительности трейна импульсов менее 0,5 с животное не всегда поднимало лапу. При длительности трейна импульсов 1 - 2 с. мы получали уверенный поведенческий ответ животного. Фосфен исчезает после 1-2 секунд, поэтому при длительном расположении фосфена в одной точке пространства потребуется дополнительная стимуляция нервной ткани через определенный промежуток времени, в наших экспериментах при длительности трейна 2 и более секунд поведение животного не изменялось. Длительный трейн нежелателен, так как происходит дополнительное разрушение ткани мозга. Для работы зрительного протеза необходим анализ поступающего изображения в реальном времени.

По данным Normann R.A. et al. (1995) длительность трейна импульсов должна составлять около 1 с. В экспериментах Mladejovsky M.G. et al. (1976), а также Dobelle W.H. (2000) длительность трейна импульсов для индукции фосфенов должна составлять 0,5 - 1 с. Однако в этих экспериментах применялись эпикортикальные платиновые электроды-диски диаметром 1,0 мм, что может сказываться на эффективности длительности трейна в сторону удлинения. В экспериментах Schmidt E.M. et al. (1996) на добровольце было показано, что при длительности трейна импульсов от 125 мс до 3-х секунд в поле зрения возникают фосфены. В наших экспериментах мы достигли надежного получения поведенческого ответа при длительности трейна от 1 секунды. При длительности трейна импульсов от 0,5 до 1 с. мы в некоторых случаях получали поведенческий ответ, а в некоторых - нет. При длительности трейна импульсов менее 0,5 с. четкого поведенческого ответа не наблюдалось. Полученные нами данные в общих чертах коррелируют с данными литературы, полученными в результате исследований на добровольцах, однако при малых длительностях трейна импульсов точность поведенческого ответа животного мала.

Сопротивление электродов. В группе животных с эпикортикальными микроэлектродами диаметром 1,0 мм в среднем сопротивление микроэлектродов через 7 дней после имплантации составило 2,1±1,7 кОм, через 1 месяц после имплантации - 9,2±5,3 кОм, через 8 месяцев после имплантации 21,3±9,0 кОм. Полученные в эксперименте данные обозначают, что сразу после имплантации для возникновения фосфенов необходимо подавать ток напряжением в среднем 5 В, через месяц после имплантации напряжение необходимо увеличить в среднем до 22,5 В для получения параметров, при которых возникают фосфены, а через 8 месяцев после имплантации напряжение должно быть равно 52,5 В.

То есть со временем все большее и большее напряжение нужно подавать для того, чтобы у животного возникали фосфены, и оно реагировало на них поднятием лапы. Если подавать напряжение 50 В, то разрушение ткани мозга будет значительным.

По каким причинам происходит повышение уровня сопротивления имплантируемых микроэлектродов? Наиболее вероятной является регенеративная инкапсуляция микроэлектродов, снижение функциональности микроэлектрода в агрессивной ионной среде межклеточной жидкости нейронов зрительной коры мозга, а также снижение уровня ответа клеток на раздражение вследствие их повреждения.

Становится ясным, что при таких параметрах вольтажа использование протеза через несколько месяцев после имплантации становится совсем не таким, как непосредственно после имплантации. Подаваемое напряжение довольно сильно может повредить ткань мозга и даже вызвать эпилептический припадок. Кроме того, как раз к этому моменту (8 месяцев после имплантации) по данным литературы (Schmidt E.M. et al., 1996) и предварительным гипотезам функциональная полезность кортикального протеза достигает приемлемых значений по сравнению с начальным уровнем. Поэтому вопрос о решении этой проблемы должен быть поставлен и решен в последующих экспериментах и разработках.

Вид импульса. Для электрической стимуляции зрительной коры можно применять различные виды импульсов: прямоугольные и синусоидальные одиночные, а также несколько импульсов подряд - трейн - с различными параметрами импульсов в трейне. По данным Mladejovsky M.G. et al., (1976) предпочтительно применение именно прямоугольного бифазного симметричного импульса для предотвращения разрушения микроэлектрода вследствие электролиза, так как общая сумма переданных зарядов равна нулю.

Полярность импульсов. По результатам наших исследований полярность импульса не влияла на возникновение фосфенов. Аналогично исследовательская группа профессора Норманна из университета штата Юта, занимающаяся разработкой кортикального зрительного протеза, не выделяет полярность импульса в качестве параметра, влияющего на возникновение фосфенов (Normann R.A. et al., 1999). Однако в работах Dobelle W.H. et al., (2000) и Mladejovsky M.G. et al., (1976) применяли бифазный импульс, а по данным эксперимента Шмидта (Schmidt E.M. et al., 1996) полярность первой фазы бифазного стимулирующего импульса влияла на порог силы тока.

Частота импульсации. В наших экспериментах при частоте импульсации 10 Гц животное не давало условного рефлекса на стимуляцию зрительной коры. При частоте 25 Гц и выше (вплоть до 100 Гц) наблюдался четкий ответ - поднятие лапы. Наши данные согласуются с результатами эксперимента Dobelle W.H. et al., 2000, который получил зрительные ощущения фосфенов у испытуемых при частоте стимуляции от 50 до 100 Гц. В гипотезе Норманна (Normann R.A., 1996) частота стимуляции для индукции фосфенов для человека колеблется от 10 до 250 Гц, однако мы не получили подтверждения этим данным в нижних пределах от 10 до 25 Гц.

Количество стимулируемых электродов. В исследуемых группах при стимуляции менее трех электродов поднятия лапы животного не наблюдалось ни в одном случае. При стимуляции трех и более микроэлектродов в пределах параметров раздражения, вызывающих фосфены, в подавляющем большинстве случаев животное поднимало лапу, при этом наблюдали уменьшение латентного периода при увеличении количества стимулируемых электродов.

Полученные в эксперименте данные мы склонны интерпретировать следующим образом: при малом количестве стимулируемых микроэлектродов (один или два) кошка не "ассоциирует" возникающие единичные вспышки в поле зрения с моделью предъявляемого ранее фосфенного поля. Когда количество стимулируемых микроэлектродов более трех, то все экспериментальные животные довольно уверенно поднимают лапу в ответ на электрическую стимуляцию мозга в диапазоне параметров, которые вызывают фосфены, представляя, что такое количество вспышек в поле зрения соответствует МФП.

Локализация имплантируемых электродов. Локализация имплантации электродов и МЭМ очень сильно влияет на параметры электрической стимуляции, при которых возникают фосфены в поле зрения. Так, при эпикортикальной имплантации электродов требуется в 10 - 100 раз бульшая сила тока для получения таких же самых результатов. Подобные результаты описаны и в литературе (Dobelle, W.H. et al., 2000, Doty R.W., 1965, Bradley D.C. et al., 2005).

Для долговременного нахождения в мозге более безопасными являются интракортикальные электроды, так как пороги стимуляции для возникновения фосфенов для них в десятки раз меньше, однако сама процедура имплантации интракортикальных электродов сопряжена с бульшими рисками. Объяснение тому факту, что при интракортикальной стимуляции пороги силы тока меньше в десятки раз мы находим в том, что в случае поверхностного раздражения распространение возбуждения из раздражаемого пункта коры происходит по 1) системе непосредственно раздражаемых элементов 1 слоя, 2) системе возбуждаемых каллозальных волокон, 3) через посредство промежуточных и ассоциативных нейронов коры. В последнем случае реакция возникает часто после длительного раздражения путем постепенного вовлечения в реакцию этих промежуточных элементов под действием импульсов из раздражаемых волокон 1-ого слоя (или под действием раздражающего тока в месте раздражения). Иначе говоря, при прямой стимуляции коры ток идет, скорее всего, по поверхности, чем в глубину, и как считается, в связи с этим происходит недостаточная активация наружного коленчатого тела и его связей, могущие вызвать такие зрительные ощущения у животных и человека.

В нашем случае мы раздражаем 3-4 слои, и токи идут ортодромно. При этом все вышеперечисленные факторы не имеют места.

Заключение

Итак, несомненно, в долгосрочной перспективе интракортикальная имплантация электродов представляет значительно больший интерес, чем эпикортикальная, так как позволяет достигнуть того же результата, что и при эпикортикальной имплантации но со значительно меньшими величинами токов, благодаря чему снижается степень повреждения мозга.

Дальнейшие исследования должны быть направлены на снижение количества побочных эффектов, связанных с этим явлением. Будущее, по всей видимости, за тонкими микроэлектродами.

1. Разработана поведенческая нейрофизиологическая модель для экспериментального исследования функциональности имплантируемых микроэлектродов перед их применением в клинических целях.

2. Определены параметры (сила тока, частота и полярность раздражения, длительности импульсов и трейна, импеданс) безопасной стимуляции зрительной коры мозга кошки, при которых возникают фосфены. Эти параметры могут быть использованы при клинических испытаниях.

3. Проведена сравнительная оценка параметров раздражения, вызывающих фосфены при эпи- и интракортикальной имплантации микроэлектродов из нихрома, позолоченного серебра и оксида иридия.

4. Интракортикальная имплантация микроэлектродов диаметром 0,05 и 0,2 мм более травматична технически во время имплантации, чем эпикортикальная имплантация электродов диаметром 1,0 и 0,05 мм, но значительно безопаснее при долгосрочном использовании, так как стимуляция при этом адекватна и требует значительно меньших порогов стимуляции, при которых возникают фосфены.

5. При имплантации микроэлектродных матриц наряду с ретинотопической организацией зрительного анализатора следует учитывать механизмы пластичности мозга.

6. Проведенные исследования доказывают, что созданная нами нейрофизиологическая поведенческая модель на кошке является хорошим инструментом для оценки первичной функциональности разрабатываемых микроэлектродных матриц, которые применяются в кортикальном зрительном протезировании.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Иванова М.Е., Ортманн В.В., Базиян Б.Х. Оценка функционирования ретинальных и кортикальных имплантатов в модели искусственного зрения // Сб. мат-лов I всеросс. научн. конф. мол. ученых "Актуальные проблемы офтальмологии", - Москва, 2006 - С.556-559.

2. Ivanova M.E., Ortmann V.V., Bazyan B. Kh. Evaluation of retinal and cortical implant device fuctionality in the neurosensoric model of artificial vision (e-abstract book) ESC congress, Berlin, 16 October, 2006.

3. Базиян Б.Х., Иванова М.Е. Ортманн В.В. Разработка нейрофизиологической модели искусственного зрения // Сб. тезисов ХХ съезда физиол. общ-ва им. И.П. Павлова, - Москва, 2007 - С.135.

4. Базиян Б.Х., Гордеев С.А., Иванова М.Е., Ортманн В.В. Параметры индуцирующего фосфены электрического раздражения зрительной коры кошки с помощью имплантированных поверхностных и глубинных электродов // Бюлл. эксп. биол. мед. - Москва, 2008 N1 - С.8-11.

5. Базиян Б.Х., Иванова М.Е., Ортманн В.В. Эволюция разработки функционального зрительного протеза. Различные подходы: ретинальный и кортикальный. За и против // Сб. тезисов VII съезда нейроофтальмологов России, - Москва, 2008 - С. 70-72.

6. Ivanova M.E., Baziyan B. Kh., Ortmann V.V. Evaluation of microelectrode array function in cortical visual prosthetic device in feline model // abstr. book ARVO conference, - Fort Lauderdale (USA), 2008 - P.230.

7. Ivanova M.E., Gordeev S.A., Ortmann V.V., Baziyan B. Kh. Evaluation of cortical visual prostheses microelectrode array function. Description of behavioral feline model. // Abstr. book 30th Annual International IEEE EMBS Conference - Vancouver (Canada), 2008 - P.3371- 3374

8. Ортманн В.В., Иванова М.Е., Базиян Б.Х. Интракортикальный интерфейс для использования в протезировании зрения // Журн. Биомед. Радиоэлектр., - Москва, 2008, N8-9, - С. 80-84.

9. Иванова М.Е. Разработка функционального кортикального зрительного протеза. Основные вопросы // сб. XII научн. конф. мол.уч. по физиол. высш. нервн. деят-ти и нейрофизиологии, - Москва, 2008 г. - C.36-37.

10. Иванова М.Е., Базиян Б.Х. Физиологические предпосылки осуществимости кортикального зрительного протеза // сб. конф. мол. уч. "Advances in ophthalmology" - Москва, 2008 г. - С.34.

11. Базиян Б.Х., Иванова М.Е., Гордеев С.А., Ортманн В.В. Адаптация мозга к кортикальному зрительному протезу // сб. конф. "Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии и нейропластичности" - Москва, 2008 г. - С. 667 - 668.

12. Базиян Б.Х., Иванова М.Е., Гордеев С.А., Ортманн В.В. Применение кортикальных электродов для решения задач зрительного протезирования. М., Анналы неврологии, 2009. Т. 3. № 3. С. 25-29.

13. Базиян Б.Х., Иванова М.Е. Перспективы исследования свойств имплантатов с нанопокрытием в экспериментах на нейрофизиологических моделях для создания зрительных протезов - // сборник материалов 3-й международной практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины". Ростов-на-Дону. С.238.

14. Иванова М.Е. Экспериментальное исследование параметров электрического раздражения зрительной коры с целью разработки зрительного протеза // сб. XIII научн. конф. мол.уч. по физиол. высш. нервн. деят-ти и нейрофизиологии, - Москва, 2009 г. С. 50.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского государственного научного фонда в рамках научно-исследовательского проекта РГНФ № 08-06-00401a.

Размещено на Allbest.ru