Различные макролидные соединения используются в качестве иммуносупрессивных агентов для профилактики отторжения трансплантата при трансплантации органов, а также для лечения различных аутоиммунных заболеваний. Одним из широко применяемых иммуносупресантов является циклоспорин, но побочные эффекты, вызываемые этим соединением, такие как нефротоксичность, расстройства центральной нервной системы и гепатотоксичность, привели к необходимости поиска альтернативного метода лечения [1].

Такролимус (FK 506) иммуносупрессивный препарат, относящийся к группе природных макролидов. Впервые был выделен из культуральной жидкости Streptomyces tsukubaensis в Японии в 1984 году [2]. В экспериментах in vitro такролимус в 100 раз активнее подавлял пролиферацию Т-лимфоцитов по сравнению с циклоспорином [3]. В 1993 году в Японии такролимус получил первое одобрение для клинического применения для лечения и/или профилактики отторжения трансплантата у больных после пересадки почки и печени. В следующем году такролимус был так же одобрен для применения в США и Великобритании.

Многолетняя клиническая практика применения препарата показала, что такролимус обеспечивает надежную профилактику острого отторжения трансплантата, в том числе резистентного к терапии кортикостероидами. Некоторые результаты клинических исследований указывают на то, что такролимус способен снизить частоту хронического отторжения, а также риск сердечнососудистых заболеваний, которые являются основными причинами утраты трансплантата на сроках более 1 года после трансплантации [4].

Помимо этого, такролимус обладает широким спектром иммуномодулирующих эффектов при различных заболеваниях кожи. В настоящее время в зарубежных исследованиях получены данные об эффективности такролимуса, кроме атопического дерматита, также при красном плоском лишае (особенно на слизистых оболочках) [5], розацеа (в том числе стероидной) [6], очаговой алопеции [7], гангренозной пиодермии [8], эритематозе [9], псориазе [10] и других кожных заболеваниях.

Условия эксперимента

Продуцент такролимуса и среда для культивирования. В качестве исходного штамма использовали штамм St. tsukubaensis DSM 42081, продуктивность которого составляла 0.1 г/л такролимуса. Для выращивания, поддержания и хранения штамма использовали агаризованную среду следующего состава (г/л): агар-агар - 20.0, мальт экстракт - 15.0, дрожжевой экстракт - 5.0, растворимый крахмал - 5.0, CaCO_{3 -} 3.0, дистиллированная вода - до 1000 (рН - 6.8-7.0). Исходный штамм и полученные из него изоляты культивировали при температуре 28°С в течение 5-7 дней. На используемой агаризованной среде исходная культура St. tsukubaensis образует округлые колонии, воздушный мицелий белого цвета, споры чёрные, гладкие, профиль колонии плоский, вросший в агар, структура однородная, размер колоний 3-4 мм.

УФ-мутагенез. Мицелий 5-7-дневной культуры смывали с поверхности агаризованной среды стерильной водой и фильтровали через ватный фильтр для отделения крупных конгломератов мицелия. Затем суспензию фильтровали через стеклянный фильтр (размер пор - 100 мкм) для получения равномерной суспензии мелких фрагментов мицелия и облучали коротковолновой ультрафиолетовой (100-280 нм) лампой Short Wave Ultra-violet Mineralight (США) мощностью 12.5 Вт. Расстояние от источника облучения до обрабатываемой суспензии составляло 40 см. После облучения 0.1 мл суспензии высевали на поверхность агаризованной среды на каждую чашку Петри и инкубировали в термостате при температуре 28°С в течение 7-10 дней.

Скрининг и отбор мутантных штаммов. На первом этапе были построены кривые выживаемости колоний исходной культуры St. tsukubaensis в зависимости от времени облучения, а также определена зависимость частоты возникновения морфологических мутаций от продолжительности облучения. С учетом этих данных было определено оптимальное время облучения, дающее максимальное число морфологически изменённых изолятов, и, в то же время, обеспечивающее определенную степень выживаемости колоний. Степень выживаемости колоний определяли по соотношению выросших колоний до и после УФ-облучения. Колонии с измененной морфологией отбирали, пересевали на свежую агаризованную среду для дальнейшего культивирования в ферментативной среде и определения количественного содержания такролимуса в культуральной жидкости (КЖ) с последующим отбором наиболее продуктивных изолятов.

Ферментация. Отобранные изоляты St. tsukubaensis выращивали на ферментативной среде в колбах объемом 50 мл, содержащих 10 мл питательной среды. С помощью микробиологической петли кусочек мицелия 5-7-дневной культуры переносили в колбы с ферментативной средой следующего состава (г/л): кукурузный декстрин - 60.0; глюкоза - 35.0; перьевая мука - 10.0; сухие дрожжи - 15.0; дрожжевой экстракт - 5.0; соевое масло - 1.0; CaCO₃ - 1.0; CaCl₂ - 1.0; кукурузный экстракт - 5.0; солевой сток - 0.83 мкл; дистиллированная вода - до 1000 (рН - 6.8-7.0). Колбы инкубировали при температуре 26°С в течение 240-336 ч на термостатируемой качалочной установке “Inforce HT” (Дания) при 280 об/мин (эксцентриситет 2.5 см). После отбора анализируемые пробы культуральной жидкости смешивали в микропробирках с этилацетатом в соотношении 1: 2 и экстрагировали при постоянном перемешивании в течении 2 часов, далее центрифугировали при 13400 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отбирали, высушивали до полного улетучивания этилацетата, осадок смывали 1 объёмом метанола и анализировали при помощи ВЭЖХ.

Идентификация полученного мутантного штамма. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК использовали универсальную праймерную систему: прямой праймер 5?AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3? и обратный праймер 5?AAGGAGGTGATCCANCCRCA3? [11].

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США) согласно рекомендациям производителя.

Количественное определение содержания такролимуса

Оценку количественного содержания такролимуса адсорбирующегося на смоле и в КЖ проводили методом ВЭЖХ на хроматографической системе "Agilent Technologies". Анализ проводили на колонке Nucleosil 100-5C8 (4мм х 125 мм), 215 нм, температура колонки 60°С, подвижная фаза: 74.9% ацетонитрилл, 24.95% бидистилированная вода, 0.15% уксусная кислота.

Стандарт такролимуса для проведения ВЭЖХ был приобретён в компании Sigma, St. Louis, США.

Результаты

УФ-мутагенез. На первом этапе были определены степень выживаемости и частота появления морфологически изменённых колоний под воздействием УФ-облучения. Зависимость степени выживаемости от времени УФ-облучения показана на рис.1. Частота возникновения морфологических мутантов является косвенным признаком эффективности УФ-мутагенеза, что, в свою очередь, может коррелировать с появлением колоний с повышенной продуктивностью [12]. Максимальный уровень возникновения мутантов наблюдался при продолжительности облучения 15-20 мин; были отмечены как колонии с измененной морфологией и пигментацией мицелия, так и колонии, отличающиеся замедленным ростом.

Рис.1 - Выживаемость и частота проявления мутаций штамма St. tsukubaensis DSM 42081 в зависимости от продолжительности УФ-облучения

Таким образом, для отбора морфологически изменённых колоний в основном использовали экспозиции 15 и 20 мин. Количество морфологически изменённых изолятов при этом составляло примерно 6%.

Для определения возможной взаимосвязи между морфологическими характеристиками и повышенной продуктивностью колоний, все типы возникающих морфологических форм были протестированы на уровень биосинтеза такролимуса при глубинном культивировании. Были отобраны 5 различных морфологических типа колоний (табл.1).

такролимус макролидный почвенная культура

Таблица 1 - Связь между морфологическим типом колоний и их способностью к биосинтезу такролимуса

Примечание: * - Здесь и далее ошибку опыта определяли, как случайную ошибку прямых измерений по формуле: Дх= (х_max-x_min) /2, где х_max и x_min - максимальное и минимальное значения из ряда полученных при повторных измерениях [13].

В ходе тестирования было выявлено, что колонии типа 2 обладали способностью к повышенному уровню биосинтеза такролимуса. Штаммы с повышенным уровнем биосинтеза отбирали для дальнейших циклов УФ-мутагенеза.

В результате ряда последовательных циклов мутагенеза с последующим скринингом колоний, в том числе колоний с морфологией 2 типа, был получен высокоактивный штамм Т 44-7, характеризующийся повышенной продуктивностью такролимуса в ферментационной среде (0.22 ± 0.07 г/л). В отличие от исходного штамма, воздушный мицелий полученного штамма имел красный пигмент.

Идентификация мутантного штамма. Для генетической идентификации полученного штамма Т 44-7 было проведено секвенирование исходного и полученного штаммов. Была определена практически полная последовательность (1479 нуклеотидов) амплификата гена, кодирующего 16S рРНК. Нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов для обоих образцов оказались идентичными между собой.

Последовательность гена 16S рРНК полученного мутантного штамма и исходного штамма на 99% совпадает с аналогичной последовательностью штамма Streptomyces tsukubaensis 9993 на всем протяжении, поддающемся достоверной расшифровке.

Влияние внесения синтетических адсорбирующих смол на биосинтез такролимуса штаммом Т 44-7. Синтетические адсорбенты являются сверхсшитыми полимерами сферической формы, характеризующимися пористой структурой с площадью поверхности в диапазоне 500-1200 мІ/г сухого вещества. Особенностью смол LPS 500 и НР21 является размер пор достаточный для того, чтобы пептиды, белки, полифенолы и иные соединения с молекулярной массой 1000 и более могли быть подвергнуты адсорбционной хроматографической очистке. Дополнительно, LPS 500 демонстрирует великолепную эффективность разделения в хроматографической колонке, благодаря порам с радиусом 260 Е. Смолы амберлиты XAD4 и XAD7 - это гранулированные (0,05…0,12 мм) синтетические смолы, высокая механическая прочность которых обусловлена сильными поперечными связями. Смола XAD4 характеризуется размером пор 100 Е и площадью поверхности 750 м²/г, в свою очередь XAD7 имеет размер пор 300-400 Е и площадь поверхности 380 м²/г.

Помимо использования адсорбирующих смол для хроматографического разделения или выделения конкретных веществ после проведения ферментации, их так же используют непосредственно во время ферментации как добавку к среде. Это делается для того чтобы нерастворимые в воде соединения адсорбировались во время ферментации на смоле и уменьшали процесс самоингибирования [14].

В ходе эксперимента использовались адсорбирующие смолы 4 видов: LPS 500 (Sorbent Technologies, США), HP21 (Sorbent Technologies, США), XAD4 (Servachrom, Германия), XAD7 (Aldrich Chemical Company, США), смолы добавлялись ферментационную среду перед стерилизацией в концентрации 20 г/л. При культивировании со смолами LPS 500, НР21 и ХАD7 наблюдалось покраснение как самой смолы, так и культуральной жидкости, чего не было при культивировании без использования абсорбирующих смол. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Влияние внесение адсорбирующих полимерных смол на биосинтез такролимуса

В дальнейших экспериментах адсорбирующая смола LPS 500 в концентрации 20 г/л использовалась в контрольной среде.