Значение определения в периферической крови циркулирующих раковых клеток в диагностике и лечении злокачественных новообразований

Во время фильтрации постоянное давление, составляющее примерно 3.45Ч10³ Pa, применяется для движения образцов крови через устройство. Весь процесс фильтрации занимает 3-5 минут. Количество захваченных клеток подсчитывается вручную под флуоресцентным микроскопом сразу после фильтрации [238,254].

Повреждение для отдельно взятой клетки может возникнуть на одной из двух стадий фильтрационного процесса. Первая стадия наступает, когда клетка начинает взаимодействовать с гранью поры, пока не попадет в ловушку полностью. Этот динамический процесс в экспериментальных условиях происходит в пределах миллисекунды. Вторая стадия длится от полного захвата до конца всего фильтрационного процесса. На этой стадии клетка будет испытывать статическое давление. Концентрированное давление, оказываемое гранями устройства - основной источник повреждений.

В настоящее время в мире стала шире использоваться основанная на вакуумной фильтрации технология выделения ЦРК по размеру (ISET), которая характеризуется высокой чувствительностью, так и специфичностью[258].

Согласно методике, разведенная буферным раствором кровь фильтруется через одноразовый пластиковый фильтрационный модуль, состоящий из 5 отсеков объемом 10 мл и 1 отсека объемом 50 мл. Данный модуль позволяет осуществлять фильтрацию количества крови от 1 до 10 мл. Разведенная кровь с помощью вакуумного насоса фильтруется через поликарбонатную пористую мембрану с калиброванными цилиндрическими порами диаметром 8 мкм. После фильтрации мембрана извлекается из модуля, высушивается, промывается фосфатно-буферным раствором и раствором Мэй-Грюнвальд и окрашивается по Гимзе либо гематоксилином.Окрашенные препараты анализируются врачом-цитологом с помощью светового микроскопа.

ЦОК представляют собой гетерогенную популяцию клеток опухоли, которые попали в кровеносное русло. По последним данным, ЦОК могут включать фракцию стволовых опухолевых клеток, а также претерпевать фенотипические изменения, известные как эпителиально-мезенхимальная трансформация, которые позволяют им распространяться к месту формирования метастазов, будучи нечувствительными к воздействию обычных цитостатических агентов [218].

В ряде работ показано, что ЦОК могут обнаруживаться при ранних стадиях болезни, в том числе до ее клинических и рентгенологических проявлений [259,260]. По мере развития опухоли число ЦОК возрастает и достигает пика в терминальной фазе заболевания. Показано, что динамика количества ЦОК в ходе лечения коррелирует с эффективностью терапии распространенного рака молочной железы, простаты, толстой кишки [212,261,262].

В то же время, изучение феномена ЦОК затруднено разнообразием и недостаточной эффективностью применяемых методик, поскольку речь идет о выявлении единичных клеток в среде, насчитывающей миллиарды обычных клеток крови. Наиболее распространенные на сегодняшний день иммунные и молекулярно-генетические методики выявления и анализа ЦОК высокочувствительны, однако, недостаточно специфичны и не позволяют изучать морфологические особенности ЦОК [263,264].

В случае заболевания на ранней стадии использование таких индикаторов как размер опухоли или ее класс для предсказания исхода и улучшения клинической практики принятия решений хорошо зарекомендовало себя, но не является идеальным. В то же время хотя сегодня используются в качестве инструментов прогнозирования несколько специфических биомаркеров, они также не вполне определенные[265]. Поэтому существует потребность в усовершенствованных инструментах для точного и надежного прогноза исхода заболевания. ЦРК могут послужить новым прогнозным маркером, однако их изучение в дополнительных (адъювантных) условиях затруднено из-за очень малого количества ЦРК, подлежащих выявлению, и из-за того, что соотношение пациентов с определяемыми ЦРК ниже, чем при запущенном заболевании, поэтому их значимость на ранней стадии болезни остается неясной.

ЦРК могут быть обнаружены у 20-54% пациентов с раком легкого на ранней стадии с применением анализов на основе RT-PCR для CK-19 [266-268] и у 10-31% пациентов при использовании системы CellSearch [269,270]. Во многих случаях ЦРК связывают с плохим исходом заболевания с учетом показателей отсутствия прогрессирования и общей выживаемости [271]. Подобным образом у пациентов, перенесших хирургическую резекцию по причине колоректального рака на ранней стадии, ЦРК, обнаруженные при помощи CK-20 и карциноэмбрионального антигена положительности молекулы РНК в течение 24 часов после резекции, указывали на возможный рецидив, особенно в сочетании с нодальным статусом [44]. Это открытие недавно было подтверждено другими авторами [272-275]. Другое изучение локализованного рака простаты не обнаружило такой взаимосвязи - анализ ЦРК, проведенный либо с использованием системы CellSearch, либо RT-PCR для разных транскриптов, продемонстрировал, что ЦРК редко обнаруживались у пациентов с локализованным заболеванием [276].

В общем и целом, клиническая роль ЦРК при заболевании на ранней стадии не подвергалась такому обширному изучению, как при метастатической стадии. При раке груди в особенности нет достаточных доказательств того, что выявление и подсчет ЦРК может быть полезным для принятия клинических решений в адъювантной среде, и будущие клинические исследования должны послужить основанием для подтверждения использования данного анализа в качестве прогнозного биомаркера [277]. В этой области рекомендательный Совет Американского общества клинической онкологии по опухолевым маркерам все еще считает, что доступные в настоящий момент ЦРК результаты, связанные с раком груди на ранней стадии, следует признать недостаточными для принятия решений в текущей стандартной клинической практике [278].

В условиях наличия метастазов новые клинические средства, способные указать на прогрессирование болезни и/или предсказать реакцию на терапию будут особенно полезными при выборе режима терапии, который будет оказывать воздействие с наибольшей вероятностью и с наименьшей токсичностью. В настоящее время подсчет ЦРК очень многообещающ для обнаружения распространения метастазов, которые, в конечном счете, ассоциируют с плохим прогнозом [279].

Выявление ЦРК в периферической крови пациентов с метастатическим раком показывает значительную вариацию между разного рода исследованиями, выполненными с использованием разнообразных методик определения; и большинство доказательств в поддержку клинического применения ЦРК было получено при использовании системы CellSearch [280]. Общие имеющиеся данные свидетельствуют в пользу использования ЦРК в качестве прогнозного маркера у пациентов с метастатическим раком груди [213]. Одним из ранних сигналов их прогнозного потенциала являлся отчет 2004 года Cristofanilli и коллег, которые пришли к наблюдению, что 60-70% больных с метастатическим раком груди имеют ?2 ЦРК на 7.5 мл крови, в то время как в контрольных группах ЦРК обнаруживались редко. Они также заметили, что пациенты с ? 5 ЦРК на 7.5 мл крови в качестве исходного значения имели худшие показатели отсутствия прогрессирования болезни и общей выживаемости, чем пациенты с ЦРК <5 на тот же объем крови. Последующие изучения продемонстрировали подобные результаты для метастатического рака простаты и колоректального рака, но с отличными пороговыми числами ЦРК. Для больных с раком простаты критерий отбора в группу с плохим прогнозом был ? 5 как стартовый коэффициент и ? 3 для пациентов с колоректальным раком [261,262].

Подсчет ЦРК может быть особенно полезен при отслеживании реакции на терапию. У пациентов с метастатическим раком груди, простаты и колоректальным раком, у которых невозможно определить масштаб болезни, снижение уровня ЦРК от 2 до 5 недель после начала системной терапии коррелировало с улучшившимися показателями отсутствия прогрессирования и общей выживаемости. [212,214]. В некоторых случаях было обнаружено, что ЦРК анализ более надежен в прогнозировании реакции на лечение, чем обычноприменяемые методы, как радиологическая оценка при раке груди [211] и измерение антигена, специфичного для рака простаты.

Тем не менее, отсутствует информация для исследования на предмет того, улучшает ли исход болезни изменение лечения на основе изменений числа, подсчитанных ЦРК. Этот вопрос будет изучаться в предполагаемом исследовании III стадии, проводимом Юго-западной онкологической группой (SWOG 0500) и финансируемом Национальным раковым институтом. Это клиническое испытание охватит 500 женщин с метастатическим раком груди, у которых будет произведен подсчет ЦРК на старте и после одного курса первичной химиотерапии. Исследование протестирует стратегию изменения химиотерапии в сравнении с продолжением прежней химиотерапии для пациентов с метастатическим раком груди, у которых наблюдается повышенный уровень ЦРК во время первого промежуточного оценивания. Те, у кого постоянно повышенное число ЦРК, на данном этапе будут в произвольном порядке отобраны либо для продолжения первоначальной терапии пока не будут получено клиническое или радиографическое подтверждение прогрессирования болезни, либо для перехода на другой химиотерапевтический агент. Этот эксперимент предположительно предоставит информацию касательно того, что является более эффективным - изменять схему лечения в период увеличения ЦРК или ждать клинического прогрессирования заболевания[227].

Роль HER2-положительных ЦРК при метастатическом раке груди [281,222] также в настоящий момент изучается в клинических испытаниях. Примером такого продолжающегося исследования является изучение лапатиниба (lapatinib) у пациентов с метастатическим раком груди c не увеличивающейся HER2 первичной опухолью и HER2-положительными (или EGFR-положительными) ЦРК.

Текущие руководящие положения по опухолевым маркерам Американского общества клинической онкологии пока не одобряют регулярное использование анализа ЦРК с целью установления стадии болезни и/или принятия клинических решений при метастатическом раке груди и других типах рака [282,283] в основном из-за широкого диапазона используемых методологий [248].

Основная техническая сложность определения ЦРК возникает из-за их редкости, на уровне одной ЦРК в 7,5 мл крови (или одна ЦРК против 10¹⁰ клеток крови), тем самым, делая эффективное обогащение предварительным условием обнаружения ЦРК в большинстве случаев. Различные методы обогащения ЦРК используют важные различия между эпителиально полученными ЦРК и кроветворными клетками крови. Традиционно используется центрифугирование с градиентом плотности для обогащения мононуклеоцитной фракции, в которую входят ЦРК из-за их схожей плавучей (способной держаться на поверхности) плотности [285-287]. Интерпретирование результатов иммунофлуоресцентного окрашивания требует наличие обученного патолога, чтобы он(а) исследовал(а) каждый слайд на присутствие ЦРК, что затратно по времени и субъективно. Кроме того, центрифугирование с градиентом плотности имеет максимальный коэффициент восстановления - около70%. Более новые технологии извлекают преимущества из особых антигенов с эпителиальным покрытием, как молекула сцепления эпителиальной клетки (EpCAM) для избирательного захвата ЦРК. Cellsearch™ - единственная одобренная Американской администрацией по контролю продуктов и лекарств автоматизированная система для захвата и оценки ЦРК с целью прогнозирования и мониторинга лечения при метастатическом раке молочных желез, простаты и колоректальном раке. Он основан на иммуномагнитном разделении [216, 288-290], при котором EpCAM- сопряженные магнитные шарики используются для захвата EpCAM- положительных ЦРК из крови под воздействием магнитного поля. И хотя множество клинических исследований подтверждали его прогнозную значимость, анализ дорогостоящ, трудозатратен и имеет большой диапазон значений коэффициента восстановления (9-90%) во многом из-за изменчивой экспрессии поверхностных маркеров. Не так давно основанный на иммунном сходстве «ЦРК-чип», когда ЦРК захватываются антителами, сопряженными с поверхностью из микроклемм в микропотоковой камере, с успехом продемонстрировал захват ЦРК и обнаружил множество метастатических опухолей из образцов крови пациентов [227]. Несмотря на то, что могут быть получены хорошо очищенные жизнеспособные ЦРК, эффективность захвата ограничена изменчивостью экспрессии поверхностного антигена, также пропускная способность и время обработки ограничены скоростью потока.

С другой стороны, изоляция ЦРК на основе размера клетки проявила себя как потенциально эффективный, недорогой и быстрый способ обогащения ЦРК [291-295], возвращаясь обратно к 60-м годам. ЦРК в большинстве случаев являются эпителиальными клетками; считается, что они значительно превосходят окружающие их клетки крови [254]. Размер поры около 8 мm (мкм =микрометр) в диаметре был показан как идеальный для удерживания ЦРК [296]. Однако, ранее описанные поликарбонатные фильтры сделаны с использованием направления гравирования (вытравливания), которое может генерировать поры только в случайных местах. Невысокая частота пор и множественное объединение пор приводят к низкой эффективности захвата ЦРК (примерно 50-60%) и частому закупориванию образца в фильтре. Недавно созданные микрофильтры больше обнадеживают в плане обогащения ЦРК на основе размера. Ранее уже описана полезность сконструированного двухслойного (2D) микрофильтра для обогащения ЦРК [120,234]. Фильтры с часто посаженными единообразными круглыми порами были сделаны, используя процессы фотолитографии. Устройство показало потрясающие результаты в обогащении ЦРК из клинических образцов, взятых у пациентов с метастатическим раком. В другом исследовании - ловушки в микрожидкостном потоке камеры захватывают раковые клетки из крови под низким давлением сдвига с большой чистотой (беспримесностью) и жизнеспособностью [297]. Более позднее микрополостное устройство, созданное путем никельного электроформирования (гальванопластика), продемонстрировало высокую эффективность поимки и жизнеспособность выявленных опухолевых клеток из крови [252].

Версия 3D микрофильтрового устройства с порами подходит для подсчета ЦРК в крови метастатических раковых пациентов, отличаясь при этом высокой долей восстановления клеток и недолгой длительностью самого процесса обработки. Способность захватывать жизнеспособные и пролиферативные ЦРК может подготавливать почву для функциональных исследований, таких как недавно предложенные раковые стволовые клетки, порождающие рецидив у раковых больных [298-300].

Отделение и подсчет редко встречающихся чужеродных клеток, обычно не присутствующих в периферической крови, вызывали большой интерес в последние 10 лет, и на сегодня это явление закрепилось как т.н. «анализ редких явлений». У этого анализа есть важные биологические и клинические следствия, в частности, эпителиальные ЦРК, часто обнаруживаемые в крови раковых пациентов, а также их подсчет - играют роль прогностического биомаркера, что в свою очередь может помочь подобрать системную терапию.

С технической точки зрения был достигнут существенный прогресс в изоляции и количественном подсчете ЦРК. Тем не менее, с учетом вариативности, присущей определению редких явлений, нужны дополнительные исследования для установления порогов чувствительности, кроме того, методы необходимо стандартизировать при помощи крупных мультиинституциональных испытаний до широкого применения данных тестов в клинической практике.

Молекулярная диагностика ЦРК, в особенности, может осуществить важный вклад в наше понимание феномена метастаз. Однако новые возникающие технологические платформы, специально предназначенные для данного типа исследований, все еще нуждаются в значительной оптимизации для надежной изоляции жизнеспособных ЦРК, прежде чем известные на сегодня молекулярные подходы могут получить распространение.

Критическая роль специфического числа ЦРК в фиксированном объеме крови, необходимая для разграничения плохого и хорошего прогнозов, также должна быть уточнена. С биологической точки зрения логично предположить, что чем большое число ЦРК в крови пациента, тем агрессивнее заболевание, но это до сих пор не было полностью подтверждено. Поэтому следует с осторожностью использовать пороговые числа для разделения пациентов на различные прогнозные подгруппы. Вдобавок, другие факторы могут повлиять на статистическую точность различных ЦРК анализов, включая эффективность восстановления/сохранения ЦРК во время подготовки образца, качество первичной пробы, частота встречающихся явлений, специфичность выбранных маркеров и вариативность (изменчивость, непостоянство) операторов/лабораторий.

Все эти факторы считают важными, в особенности для определения возможного клинического влияния ЦРК на ранней стадии болезни. Несколько исследований по оценке количественного измерения ЦРК и их диагностике на ранних этапах развития рака продолжаются в настоящий момент, однако необходимо больше данных и длительное наблюдение, чтобы дать окончательный ответ.

Клиническая значимость ЦРК может послужить как в сфере клинической онкологии, так и в биологии рака, способствуя выявлению индивидуальной терапии. Характеристика генотипа и фенотипа этих клеток приведет к дополнительным открытиям и откроет новые направления в противораковых исследованиях. И хотя крупномасштабных клинических данных о том, как молекулярная диагностика ЦРК может быть использована в качестве средства принятия клинических решений, все еще не хватает, данный вид анализа весьма многообещающ в плане лучшего биологического понимания метастатического процесса, усовершенствованного деления пациентов и, в ближайшем будущем, определения генетического профиля каждой опухоли при помощи ЦРК. По этим причинам крайне важно разрабатывать более чувствительные методики, позволяющие избегать давления (нагрузки) на клетки во время манипуляций, чтобы сохранить жизнеспособность клеток и их способность к пролиферации, а также чтобы способствовать последующей культуре invitro для дальнейшего молекулярного анализа ЦРК. Безусловно, стоимость таких методов - другой важный вопрос, который следует изучать в свете более широкого клинического применения [227].

Проблема диагностики и лечения злокачественных новообразований остается актуальной в силу распространенности заболеваний, высокой смертностью и летальности, неудовлетворительной выживаемостью. Не решенной проблемой остается ранняя диагностика злокачественных новообразований, особенно до визуализации, что обуславливает высокий удельный вес при выявлении опухолей III-IV стадий процесса. Не менее трудной проблемой остается профилактика и ранняя диагностика рецидивов у радикально оперированных больных, требующих новых подходов к решению. Все это побуждает возврат на новом уровне к проблеме иммунобиологии злокачественных новообразований, молекулярным основам опухолевого роста и трансформации клеточного клона. Среди новых подходов в диагностике злокачественных опухолей в последние годы привлекает диагностика циркулирующих клеток, что имеет важное значение в раннем выявлении процесса, определению гистологической формы, принятию решения о применении химиотерапии и т.д. Осуществление вышеуказанных задач обеспечивается процессом технологии диагностики циркулирующих раковых клеток.

Глава 2. Материал и методы исследования

2.1 Характеристика материала исследования

В основу работы положены данные о 745 лицах, у которых с целью определения циркулирующих раковых клеток применялось гемофильтроцитологическое исследование (таблица 1).

Таблица 1. Характеристика статуса больных, у которых проведено гемофильтроцитологическое исследование.

Характеристика статуса	Абс. число	%
Больные с подозрением на злокачественные новообразования Больные с отдаленными метастазами с неустановленной локализацией первичной опухоли Больные, радикально оперированные по поводу злокачественных новообразований, в том числе рака легкого рака желудка рака толстой кишки	211 23 338 112 81 145	36,9 4,0 59,1 19,6 14,2 25,4
Всего	572	100,0

Большинство больных были радикально оперированы по поводу злокачественных новообразований (таблица 2).

Таблица 2. Характер заболеваний у больных с установленной локализацией злокачественных новообразований

Нозология	Абс. число	%
Рак легкого	112	33,1
Рак желудка	81	24,0
Рак толстой кишки	145	42,9
Всего:	338	100,0

У 42,9% больных, перенесших радикальную операцию, был рак толстой кишки, у 33,1% - рак легкого, у 24,0% - рак желудка.

Кроме того, обследовано 234 пациента (таблица 1) с подозрением на наличие у них злокачественного новообразования (211 пациентов) или с отдаленными метастазами с неустановленной локализацией первичного очага (23 пациента).

Контрольную группу составили 173 донора без признаков каких-либо заболеваний.

Диагностическая значимость гемофильтроцитологического исследования изучалась у 234 больных и 173 донорах (таблица 3). Оценка прогноза и эффективность лечения проводилась у 338 больных.

Таблица 3. Обследованные контингенты больных и доноров.

Цель исследования	Группа обследованных
	всего	в том числе
		основная	контрольная
	абс. число	%	абс. число	%	абс. число	%
Диагностическая значимость гемофильтроцитологического исследования	407	100,0	234	57,5	173	42,5
Оценка прогноза и эффективности лечения в послеоперационном периоде	338	100,0	ЦРК+	ЦРК -
			259	76,6	79	23,4
Всего:	745	100,0

С целью оценки реальной диагностической ценности гемофильтроцитологического метода исследования были обследованы 407 человек. Выделены в две группы: основная и контрольная. В основную группу вошли 234 (57,5%) пациента с подозрением на наличие у них злокачественной опухоли и больных с отдаленными метастазами без первично выявленного очага. Контрольную группу составили 173 (42,5%) донора, исследованных на предмет отсутствия или наличия у них ЦРК.

С целью оценки прогноза и эффективности лечения обследовано 338 радикально оперированных больных по поводу злокачественных новообразований (ЗНО) легких, желудка и толстого кишечника. Из них 112 пациентов были с ЗНО легких, 81 желудка и 145 толстой кишки. В соответствии с поставленной задачей этим больным на 15 и 20 дни раннего послеоперационного периода была проведена микрофильтрация периферической венозной крови. Последующее цитологическое исследование отпечатка фильтрата венозной крови выявило в нем у 259 пациентов наличие циркулирующих раковых клеток (ЦРК). Таким образом, количество радикально оперированных больных, у которых в послеоперационном периоде были обнаружены ЦРК, составило 76,6% из числа обследованных. Кроме этого динамическое наблюдение за циркулирующими клетками в течение 3 лет проводилось у радикально оперированных больных со злокачественными новообразованиями, в том числе больных получающих адъювантную полихимиотерапию.

Всем 259 онкологическим больным в ходе собеседования, учитывая обнаруженные у них ЦРК, было предложено проведение адъювантной химиотерапии (АХТ). Из них у 185 пациентов согласных на нее, проведена адъювантная химиотерапия по общепринятой схеме.

С целью выяснить, есть ли различия в характеристиках больных с обнаруженными в их периферической венозной крови ЦРК, нами составлены 2 группы пациентов.

В основную группу вошли 185 радикально оперированных больных. Критерием включения в данную группу пациентов с ЗНО являлось их письменное согласие и проведение АХТ. Критерием исключения из этой группы пациентов служил их дальнейший отказ и соответственно незавершенность адъювантной химиотерапии.

Группу сравнения составили 74 радикально оперированных онкологических больных. Критерием включения в эту группу пациентов являлся их отказ от проведения АХТ. Критерием исключения больных из данной группы служило их в последствии принятое решение получать АХТ и начало проведения химиотерапии.

В данное сравнительное проспективное клиническое исследование вошли 87 больных с раком лёгкого, 64 больных с раком желудка и 108 больных с раком толстой кишки. Необходимо отметить тот факт, что у этих больных после радикальной операции были обнаружены ЦРК. Сопоставление групп онкологических больных было проведено по полу, возрасту, морфологической форме, локализации и распространенности процесса по стадиям, объемам выполненных оперативных вмешательств.

Радикально оперированных больных с раком легкого, у которых были обнаружены в венозной крови ЦРК, всего было 87 человек. 62 пациента прошедших адъювантную ПХТ вошли в основную, а 25, не получивших химиотерапию в - группу сравнения. Всего же в двух исследуемых группах были 62 мужчины и 25 женщин больных раком легкого (таблица 4). Половой состав в группах был статистически одинаковым.

Таблица 4. Определение достоверности различий по полу в исследуемых группах у радикально оперированных больных раком легких

Пол	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
Мужчины	37	60,0	16	64,0	0,14	1	0,05
Женщины	25	40,0	9	36,0
Всего	62	100,0	25	100,0

Большинство больных были в возрасте 60-69 лет (таблица 5). По возрастным группам больные раком легкого статистически не различались.

При изучении патоморфологического строения опухолей легких было выявлено превалирование плоскоклеточного рака (таблица 6).

Таблица 5.Определение достоверности различий по возрасту в исследуемых радикально оперированных группах больных раком легкого

Возрастной период, лет	Группы больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
До 40	1	1,6	0	0	0,99	4	0,05
40-49	5	8,0	1	4,0
50-59	22	35,4	9	36,0
60-69	24	39,0	10	40,0
70 и старше	10	16,0	5	20,0
Всего	62	100,0	25	100,0

Таблица 6. Определение достоверности различий по морфологическому типу опухоли в исследуемых группах радикально оперированных больных раком легкого

Морфологический тип опухоли	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
Плоскоклеточный рак	33	53,2	13	52,0	0,16	2	0,05
Мелкоклеточный рак	9	14,5	3	12,0
Аденокарцинома	20	32,3	9	36,0
Всего	62	100,0	25	100,0

Частота отдельных морфологических типов была одинаковой.

Периферическая форма рака легких преобладает над центральной локализацией в обеих исследуемых группах больных (таблица 7). По формам локализации обе группы были сопоставимы.

Для оценки распространенности рака легкого и других локализаций ЗНО нами использовано 7-е издание Классификации TNM, которое содержит правила руководства по стадированию ЗНО AJCC, выпущенном в 2009 г. Данная классификация позволяет систематизировать различные клинические ситуации, выработать общую тактику лечения, прогнозировать его результаты на основе анатомических параметров опухоли.

Таблица 7. Определение достоверности различий по локализации опухоли в исследуемых группах больных раком легкого

Форма опухоли	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
Центральная	24	38,7	9	36,0	0,05	1	0,05
Периферическая	38	61,3	16	64,0
Всего	62	100,0	25	100,0

Как показывает таблица 8, среди больных раком легкого, лица с IIA стадией болезни отмечались только в основной группе, а пациентов с IIBкак и с IIIAстадиями было меньше в группе сравнения.

Таблица 8. Определение достоверности различий по распространенности опухоли в исследуемых группах больных раком легкого

Стадия заболевания	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
IIA	T1aN1MO	1	1,6	0	0	0,56	5	0,05
IIB	T2bN1MO T3N0MO	8 14	13,0 22,6	3 6	12,0 24,0
IIIA	T2aN2MO T3N1MO T3N2MO	12 18 9	19,3 29,0 14,5	5 8 3	20,0 32,0 12,0
Всего	62	100,0	25	100,0

По стадиям, распространенности процесса обе группы были сопоставимы. Наиболее частым видом операций, выполненных как в основной группе радикально оперированных больных раком легкого, так и в группе сравнения была лобэктомия (таблица 9). По объему выполненных операций исследуемые группы были сопоставимы.

Таблица 9. Определение достоверности различий по видам выполненных оперативных вмешательств в исследуемых группах больных раком легкого.

Объем операции	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
Лобэктомия	30	48,3	13	52,0	0,10	2	0,05
Билобэктомия	3	5,0	1	4,0
Пневмонэктомия	29	46,7	11	44,0
Всего	62	100,0	25	100,0

Проведенный анализ статистически значимой разницы по полу, возрасту, морфологии, локализации, стадиям и операциям между основной группой и группой сравнения, оперированных по поводу рака легкого, не выявил.

В следующую серию исследований вошли 64 пациента, радикально оперированные по поводу рака желудка (таблица 10). Из них у 43 больных (24 мужчины и 19 женщин), составивших основную группу, в послеоперационном периоде помимо хирургического лечения применялась адъювантная химиотерапия. Остальные 21 пациент (12 мужчин и 9 женщин), составивших группу сравнения, были подвергнуты только радикальному оперативному вмешательству, а от адъюватной полихимиотерапии они отказались. Половой состав основной группы и группы сравнения были сопоставимы.

Таблица 10. Определение достоверности различий по полу в исследуемых группах радикально оперированных больных раком желудка

Пол	Группа больных	XІ	f	p>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
Мужчины	24	55,8	12	57,1	0,01	1	0,05
Женщины	19	44,2	9	42,8
Всего	43	100,0	21	100,0

Возраст больных раком желудка варьировал от 40-49 лет до 70 лет и старше (таблица 11). Возрастная структура онкологических больных была в сравниваемых группах следующая: на возрастной период от 60 - 69 лет приходилось наибольшее количество больных раком желудка. В возрастном периоде 40 - 49 лет в обеих группах оказалось наименьшее число пациентов. Возрастной состав обеих групп был сопоставим.

Таблица 11. Определение достоверности различий по возрасту в исследуемых группах радикально оперированных больных раком желудка

Возрастной период, лет	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%	0,11	3	0,05
40-49	5	11,6	2	9,5
50-59	12	28,0	6	28,6
60-69	15	34,8	8	38,1
70 и старше	11	25,6	5	23,8
Всего	43	100,0	21	100,0

У всех больных анализируемых групп гистологической формой опухоли, оказалась аденокарцинома.

По структуре степени зрелости опухоли у 20 пациентов из основной группы и у 10 пациентов из группы сравнения аденокарцинома оказалась низкодифференцированной, у 16 из основной и у 9 из группы сравнения - умеренно-дифференцированной, наконец, у 7 из основной и у 2 из группы сравнения - высокодифференцированной. Таким образом, в исследуемых группах отмечено преобладание низкодифференцированной аденокарциномы (таблица 12).

Таблица 12. Определение достоверности различий по морфологическому типу опухоли в исследуемых группах радикально оперированных больных раком желудка

Морфологический тип аденокарциномы (АДК)	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
высокодифференцированная	7	16,3	2	9,5	0,57	2	0,05
умеренно-дифференцированная	16	37,2	9	42,8
низкодифференцированная	20	46,5	10	47,6
Всего	43	100,0	21	100,0

По морфологическим типам рассматриваемые группы больных были сопоставимы.

В сравниваемых группах самой частой локализацией рака является тело желудка (таблица 13). По локализации новообразований анализируемые группы были сопоставимы.

При сопоставлении обеих групп таблица 14 показывает, что больные раком желудка с T1N2M0 и T4aN0M0 были только в основной группе, а наибольшее количество составили больные раком желудка с Т3N2M0 как в основной, так и в группе сравнения. Второе место по частоте в обеих сравниваемых группах приходилось на больных раком желудка с T3N1M0. По стадиям и распространенности рассматриваемые группы были сопоставимы.

Таблица 13. Определение достоверности различий по локализации опухоли в исследуемых группах радикально оперированных больных раком желудка

Локализация опухоли	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс.число	%	абс. число	%
Кардиальный отдел	11	25,5	5	0,05	0,06	2	0,05
Тело желудка	17	39,5	9	42,8
Антральный отдел	15	35,0	7	33,3
Всего	43	100,0	21	100,0

Таблица 14. Определение достоверности различий по распространенности опухоли в исследуемых группах радикально оперированных больных раком желудка

Стадия заболевания	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
IIA	T1 N2M0 T2 N1M0 T3 N0M0	1 5 2	2,3 11,6 4,6	0,05	0 14,3 4,7	1,36	6	0,05
II B	T2 N2M0 T3 N1M0 T4a N0M0	6 13 1	14,0 30,2 2,3	2 7 0	9,5 33,3 0
III A	T3 N2M0	15	35,0	8	38,1
Всего	43	100,0	21	100,0

По всем 64 больным со злокачественным новообразованием желудка, вошедшим в основную и группу сравнения, проведена в плановом порядке радикальная операция по удалению опухоли в полном объеме. Дистальная субтотальная резекция желудка по количеству выполненных оперативных вмешательств находится на первом месте, на втором - гастроэктомия и на третьем месте - проксимальная субтотальная резекция желудка (таблица15). По объемам операции группы больных были сопоставимы.

Таблица 15. Определение достоверности различий по видам выполненных оперативных вмешательств в исследуемых группах радикально оперированных больных раком желудка

Объем операции	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
Проксимальная субтотальная резекция желудка	5	11,6	2	9,5	0,21	2	0,05
Дистальная субтотальная резекция желудка	22	51,1	12	57,1
Гастрэктомия	16	37,2	7	33,3
Всего	43	100,0	21	100,0

Полученные результаты анализа доказывают, что статистически значимые различия в сравниваемых группах по полу, возрасту, морфологии опухолей, локализации и стадиям заболевания, а также выполненным оперативным вмешательствам не значимы.

Среди больных раком толстой кишки отмечено преобладание женской части больных над мужской в основной группе и, наоборот, в группе сравнения (таблица 16). Различия показателей по полу между группами были статистически не значимыми.

Таблица 16. Определение достоверности различий по полу в исследуемых группах радикально оперированных больных раком толстой кишки

Пол	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
Мужчины	38	47,5	15	53,6	0,30	1	0,05
Женщины	42	52,5	13	46,4
Всего	80	100,0	28	100,0

Возрастной период, на который приходится наибольшее количество заболевших раком толстой кишки, составляет 60-69 лет (таблица 17). По возрастному составу группы были сопоставимы.

Таблица 17. Определение достоверности различий по возрасту в исследуемых группах радикально оперированных больных раком толстой кишки

Возрастные группы, лет	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
до 40	2	2,5	0	0	0,88	4	0,05
40-49	7	8,7	2	7,1
50-59	23	28,8	9	32,1
60-69	27	33,8	10	35,7
70 и старше	21	26,2	7	25,0
Всего	80	100,0	28	100,0

У всех 108 оперированных больных с раком толстой кишки из обеих групп удаленная опухоль после гистологического исследования по морфологическому строению оказалась аденокарциномой. При сравнении аденокарцинома по структуре зрелости в количественном соотношении в анализируемых группах не различалась. Общепризнаны следующие градации степени дифференцировки: высокодифференцированные опухоли имеют приблизительно строение аденомы, умеренно-дифференцированные представляли опухоли с нарушенной железистой структурой, низкодифференцированные характеризовались малым количеством формирования желез. Больные с данной степенью дифференцировки опухоли в нашем случае оказались наиболее многочисленны (таблица 18).

Таблица 18. Определение достоверности различий по гистологическому строению опухоли в исследуемых группах радикально оперированных больных раком толстой кишки

Морфологический тип аденокарциномы (АДК)	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
высокодифференцированная	16	20,0	5	17,9	0,08	2	0,05
умеренно-дифференцированная	29	36,2	10	35,7
низко-дифференцированная	35	43,8	13	46,4
Всего	80	100,0	28	100,0

В исследуемых группах рак ободочной кишки в 1,5 раза и более превышает рак сигмовидной кишки (таблица 19). По локализации новообразования анализируемых групп больных были сопоставимы.

В сравниваемых группах больные раком толстой кишки в стадииT4aN0M0 были только в основной группе, а наибольшее количество онкологических больных в обеих группах оказались со стадией T3N2bM0 (таблица 20). По стадиям, распространенности процесса обе группы были сопоставимы.

Таблица 19. Определение достоверности различий по локализации опухоли в исследуемых группах радикально оперированных больных раком толстой кишки

Локализация опухоли	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
Ободочная кишка	49	61,2	18	64,2	0,08	1	0,05
Сигмовидная кишка	31	38,8	10	35,7
Всего	80	100,0	28	100,0

Таблица 20. Определение достоверности различий по распространенности опухоли в исследуемых группах радикально оперированных больных раком толстой кишки

Стадия заболевания	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс число	%	абс число	%
IIA	T3 N0M0	9	11,2	3	10,7	2,73	2	0,05
IIB	T4a N0M0	6	7,5	0	0
IIIA	T2 N1M0	12	15,0	5	17,9
IIIB	T3 N1M0 T4a N1M0 T2 N2aM0	10 11 7	12,5 13,8 8,8	3 4 2	10,7 14,3 7,1
IIIC	T3 N2bM0 T4a N2aM0	16 9	20,0 11,2	7 4	25,0 14,3
Всего	80	100,0	28	100,0

Самым распространенным оперативным, выполненным по поводу рака толстой кишки, была гемиколэктомия (таблица 21). По объемам операции рассматриваемые группы были сопоставимы.

Статистический анализ достоверных различий в обеих группах больных по полу, возрасту, гистологической форме опухолей, локализации процесса, стадиям заболевания и видам операций не обнаружил.

Таблица 21. Определение достоверности различий по видам оперативных вмешательств в исследуемых группах радикально оперированных больных раком толстой кишки

Объем операции	Группа больных	XІ	f	р>
	основная	сравнения
	абс. число	%	абс. число	%
Гемиколэктомия	53	66,2	17	60,7	0,30	2	0,05
Резекция поперечного отдела ободочной кишки	8	10,0	3	10,7
Резекция сигмовидной кишки	19	23,8	8	28,6
Всего	80	100,0	28	100,0

Таким образом, в результате проведенной статистической обработки данных, полученных в ходе сравнения основной группы и группы сравнения у больных со злокачественными опухолями легких, желудка и толстой кишки, статистически значимой разницы не выявлено.

2.2 Методы исследования

Диагноз у 572 больных со злокачественными новообразованиями устанавливался на основании данных физикального и инструментального обследования до операции, интраоперационной диагностики, а также морфологического подтверждения диагноза. Инструментальное обследование больных включало в себя весь современный, в том числе и высокотехнологичный комплекс лучевой и эндоскопической диагностики, направленный на установление причины заболевания. Лучевая диагностика начиналась согласно общепринятым стандартам обследования больных с обязательных методов рентгеноскопии, рентгенографии, ультразвукового исследования внутренних органов и заканчивалась уточняющими видами: компьютерной томографией, магнитно-резонансной томографией. Эндоскопические методы исследования, а именно фибробронхоскопия, фиброэзофагогастроскопия, фиброколоноскопия и ректороманоскопия кроме визуального распознавания опухолей, главное дали возможность забора биопсийного материала. Наконец, применение гистологического исследования вышеупомянутого материала окончательно подтверждало наличие у больных злокачественного новообразования.

Кроме инструментального обследования онкологическим больным проводились следующие лабораторные методы исследования: клинический анализ крови и мочи, биохимический анализ крови, включающий определение амилазы, общего белка, креатинина, мочевины, кальция, хлоридов. Натрий, калий, кальций определяли ион селективным методом на анализаторе ABL-800FLEX. Общий холестерин, мочевину, амилазу кинетическим методом, сахар глюкозооксидным методом, общий белок биуретовым методом, креатинин методом Яффе, общий билирубин методом Йендрашика-Грофа оценивали на анализаторе mindrayBS-400. Тимоловую пробу проводили методом осаждения на аппарате StatFaxc. Также исследовались наиболее информативные серологические опухолевые маркеры: при раке легкого - РЭА, Cyfra 21-1, SCC; при раке желудка CA 72-4, РЭА, CA-19-9; при раке толстой кишки-РЭА, CA-19-9,CA 72-4 и других солидных опухолях.

Для выявления в периферической венозной крови циркулирующих раковых клеток у 572 онкологических больных осуществлена микрофильтрация периферической венозной крови с последующим цитологическим исследованием отпечатка фильтрата венозной крови с целью диагностики в нем циркулирующих раковых клеток.

2.3 Устройство для микропросеивания венозной крови и методика проведения гемофильтроцитологического исследования

Для проведения гемофильтроцитологического исследования использовалось устройство для микропросеивания венозной крови (рисунок 1).

На данное устройство получен патент на изобретение № 24144710 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам, зарегистрированное в Государственном реестре изобретений РФ 20.03.2011 г. Изобретение относится к физиологии и медицине.

Устройство для микропросеивания венозной крови представлено на рисунке 1.

Рисунок 1. Устройство для микропросеивания венозной крови

Устройство содержит стеклянный цилиндр (1), который заключен в пластиковый кожух (2). На дне стеклянного цилиндра установлена пластмассовая решетка (3) с закрепленным на ней с помощью металлического кольца (4) калиброванным фильтром (5). Диаметр пор у калиброванного фильтра равен 6000 нм (6 мкм). Внутри стеклянного цилиндра установлен поршень (6) со штоком (7), который ввинчен не до упора. В поршне выполнены два разных по диаметру канала (8), на стыке которых расположен металлический шарик (9), выполняющий назначение выпускного клапана для воздуха. Стеклянный цилиндр имеет верхнее входное отверстие (10) для подачи венозной крови и нижнее выходное отверстие (11) для оттока венозной крови, последнее снабжено приспособлением (12) для осуществления положений «открыто» и «закрыто».

На предложенный способ определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на ЗНО Роспатентом после соответствующей экспертизы также выдан патент на изобретение № 2425385 зарегистрированный в Государственном реестре изобретений РФ 27 июля 2011 года.

Способ определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с помощью данного прибора проводился следующим образом. Накануне из локтевой вены обследуемого берется в две пробирки типа вакутайнер с антикоагулянтом ЭДТА (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) по 6 мл. венозной крови, независимо от приема им пищи. В день исследования осуществляли сборку устройства. На дно стеклянного цилиндра, заключенного в пластиковый кожух, помещали пластмассовую решетку с закрепленным на ней с помощью металлического кольца калиброванным фильтром.

Для проведения гемофильтроцитологического исследования при закрытом положении нижнего выходного отверстия, в стеклянный цилиндр через верхнее входное отверстие наливали из пробирки венозную кровь обследуемого больного в количестве 12 мл. В стеклянный цилиндр вводили поршень со штоком, ввинченным не до упора.

Поршень продвигался до уровня жидкости в стеклянном цилиндре, при этом воздух из цилиндра выпускали через каналы в поршне с помощью металлического шарика, выполняющего назначение выпускного клапана.

Затем шток завинчивали до упора в поршне и тем самым зажимали металлический шарик (выпускной клапан закрыт). Далее приспособление нижнего выходного отверстия стеклянного цилиндра ставилось в положение «открыто» и пропускали всю исследуемую венозную кровь через калиброванный фильтр, при этом происходила задержка раковых клеток в осадке на калиброванном фильтре.

Осадок наносили на предметные стекла, предварительно обезжиренные и охлажденные, для лучшего прилипания клеток и высыхания. Фиксировали мазки- отпечатки 3% спиртовым раствором Лейшмана 2-4 минуты. Затем смывали дистиллированной водой и красили азур-эозиновой смесью в соотношении 3:1 в течение 6-8 минут.

Рисунок 2. Схема устройства для определения циркулирующих раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные образования.

После покраски промывали дистиллированной водой, сушили на воздухе и приступали к просмотру под микроскопом. В настоящее время в специальной литературе изучены и описаны цитологические картины большинства опухолей, иссходя из которых (размеры, форма, структура) были определены и описаны выделенные из крови циркулирующие раковые клетки.

Уверенное цитологическое заключение о наличии злокачественного новообразования (рака, саркомы), совпадающее с клиническими симптомами и данными других диагностических исследований, следует расценивать как морфологическое подтверждение диагноза злокачественной опухоли. Оно является основанием для назначения больному лечения без выполнения биопсии, что особенно ценно в тех случаях, когда произвести ее невозможно или крайне нежелательно [12]. Уверенное цитологическое заключение о наличии злокачественной опухоли не может быть отвергнуто клиницистом без гистологического исследования, даже если данные и результаты других диагностических исследований противоречат картине злокачественной опухоли и ставят цитологический диагноз под сомнение. Форма клеток зависит от генеза опухоли: плоскоклеточный или железистый. Клетки плоскоклеточного рака содержат крупные ядра, занимающие почти всю клетку, встречаются многоядерные клетки. Контуры ядер неровные, фестончатые, с инвагинациями, с «надкусанными» краями. Структура хроматина в ядрах грубая, комковатая, глыбчатая, бугристая. Цитоплазма скудная, может быть без четких границ или в виде узкого ободка. Клетки могут располагаться одиночно, группами или образовывать симпласты. Клетки железистого рака в периферической венозной крови при микроскопии, в основном, одиночно расположенные или небольшими рыхловатыми скоплениями. Отличительной чертой этих клеток от стволовых клеток гемопоэза является эксцентричность расположения ядер, но при низкодифференцированных вариантах, ядра занимают центральное положение. Клетки призматической и округлой формы, в ядрах содержатся по 1-2 ядрышка, цитоплазма может быть скудной, обильной, расплывчатой без четких границ.

Таким образом, при просмотре под световым микроскопом мазка-отпечатка специалист выявляет наличие в периферической крови опухолевых клеток. В каждом случае размер, цвет, форма опухолевой раковой клетки могут быть разные.

Определив гистологическую форму рака в метастазе (гипернефроидный, мелкоклеточный, перстневидно-клеточный, аденокарцинома и т.д.), тем самым цитолог дает клиницисту информацию для целенаправленного поиска ранее не выявленной первичной опухоли.

В том случае, если получено предположительное цитологическое заключение о злокачественной опухоли, необходимо выполнять повторное исследование, более тщательно проводя забор материала для мазков. Это повышает эффективность цитологической диагностики рака на 7-10 % и позволяет дать уверенное заключение в 90% наблюдений. Гистологический контроль за правильностью цитологических заключений о раке по результатам сопоставления цитологических и гистологических диагнозов, проведенный в 4746 наблюдениях, показал, что частота правильных цитологических ответов составила 92,2 ± 5,2% [12].

2.4 Статистическая обработка полученных данных

В работе применялись методы вариационной статистики. Использовались методики расчета медико-статистических показателей в онкологии, рекомендованные Г.В. Петровой с соавт. 2014 [301].

Проверка гипотезы о значимости на основе критерия х² (хи-квадрат) была использована в нашем исследовании при статистических непараметрических данных, которые были обработаны критерием Пирсона х^2.

В работе также применялся стандартный ?-критерий (универсальный критерий Фишера), что обеспечивалось достаточным количеством наблюдений в каждой из групп и в каждой из таблиц. Для связанных выборок использовался критерий Манна-Уитни. Большие массивы данных обрабатывались на компьютере с помощью программы SPSS21.0.

За последние 10-15 лет достигнут определенный успех в выделении из сосудистого русла ЦРК. Однако до настоящего времени прибора микрофильтрации удовлетворяющего полно требования по недопущению лизиса раковых клеток, эффективности их выделения нет.

Общий недостаток приборов, использующих принцип микрофильтрации для выделения ЦРК - это поликарбонатные фильтры способные вызывать лизис клеток. Указанные фильтры изготавливаются с треком травления, что приводит к случайному размещению пор с относительно малой плотностью и слиянию двух или более пор, что выражается в снижении эффективности забора ЦРК до 60 %. Повреждение клеточной мембраны может быть вызвано при взаимодействии клетки с гранью поры. Величина силы, при которой происходит клеточный лизис, может быть равной 3 мН/м (3 миллиньютон/м) в этих моделях[227].

Предлагаемое в данной работе устройство может сделать процесс выделения ЦРК проще, качественнее и быстрее. Самым большим преимуществом данного прибора является использование в качестве фильтра - полимерной пленки из лавсана (полиэтилентерефталат). Стоит отметить, что лавсан является идеальным строительным материалом для фильтрационного устройства из-за его свойств. Он механически крепкий (коэффициент Янга ГПа гигаПаскаль = 10⁹ Па и предел прочности на разрыв 70 МПа мегапаскаль = 10⁶ Па) и в тоже время пластичный (растяжение до 200 %) полимер. Кроме того, лавсан - высоко биосовместимый полимер не выделяет в фильтрат низкомолекулярной примеси (нет побочного влияния на результат).

Современные микротехнологии позволяют при создании полимерного фильтра из лавсана точно контролировать размер, геометрию и плотность пор. Кроме того, фильтрационные устройства с фильтром из лавсана с его гладкой зеркальной поверхностью и меньшей подверженностью к закупориванию и засорению пор из-за сниженной абсорбции протеина, клеточного сцепления позволяют сохранить неповрежденной клеточную мембрану выделенных ЦРК.

Таким образом, предлагаемое устройство имитирует собой искусственную макрососудистую модель, способную выявлять редко циркулирующие раковые клетки в венозной крови. Имитация достигается за счет пор калиброванного фильтра диаметром 6 мкм, что соответствует основному диаметру капиллярного русла и силы давления создаваемого весом поршня в 3,9 кПа, также равного внутрикапиллярному (32 мм.рт.ст.) давлению. Следовательно, для выделения ЦРК в данном приборе создаются условия кровотока максимально приближенные к естественным, чтобы не допустить отрицательного результата вследствие повреждения клеток.

Глава 3. Диагностическое значение гемофильтроцитологического исследованияпериферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования