Влияние лимфоидспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность проблемы.

В последние годы предметом интенсивного исследования стали эмбриональные стволовые клетки (ЭС клетки) млекопитающих. ЭС клетки представляют собой уникальную модель для изучения процессов, лежащих в основе онтогенеза. Как и в ходе развития зародыша in vivo, ЭС клетки в культуре способны давать начало всем трём зародышевым слоям: энтодерме, мезодерме и эктодерме, а, соответственно, и всем развивающимся из них типам клеток. Исследования дифференцировки ЭС клеток в том или ином направлении в ответ на воздействие специфических индукторов (факторов роста, цитокинов) или на непосредственную генетическую модификацию позволяют приблизиться к пониманию функции исследуемых факторов и генов в данном процессе. Большой интерес в последние годы вызывает направление, связанное с поиском подходов к направленной дифференцировке ЭС и стволовых клеток различных тканей и органов млекопитающих в определённые типы клеток in vitro. Использование экзогенных факторов, позволяющих направить развитие дифференцировки ЭС клеток в том или ином направлении, а также генетические модификации этих клеток открывают перед экспериментатором возможности получения клеток с необходимыми свойствами, позволяющими, в перспективе, использовать их в трансплантологии и заместительной клеточной терапии нейродегенеративных, сердечно-сосудистых и других заболеваний. В связи с этим по-прежнему остается актуальным поиск новых генов, вовлеченных в дифференцировку ЭС клеток в разных направлениях.

В настоящей работе проводилось изучение влияния на рост и дифференцировку ЭС клеток мыши гена pub, который кодирует белок, относящийся к семейству TRIM (tripartite motif) белков. Белки этого семейства вовлечены в процессы клеточного роста, дифференцировки и регуляции транскрипции. Мутации и перестройки в разных доменах этих белков приводят к таким заболеваниям как семейная средиземноморская лихорадка (FMF familian Mediterranean fever), синдром Опица, карликовость, а также способны вызывать злокачественные заболевания: лейкемию (промиелоцитная), карциному щитовидной железы. Это позволяет предполагать, что белки - члены TRIM-семейства играют важную роль в фундаментальных биологических процессах. Структура Pub свидетельствует о том, что он может обладать регуляторными свойствами. Однако его функция в организме не определена.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что ген pub человека (hpub) повышенно экспрессируется при лимфогенезе (Tarantul V. et al., 2001). Кроме того, известно, что белок Pub является ингибитором транскрипционного фактора PU.1, который участвует в гемопоэзе, в частности, влияет на развитие лимфоидной системы. Эти данные позволяют предположить, что ген pub может воздействовать на процесс дифференцировки ЭС клеток и способствовать их специлизации по лимфоидному пути.

Цели и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение влияния лимфомоспецифического гена pub на рост и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro, а также оценка онкогенного потенциала данного гена.

В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

1. Изучить профиль экспрессии эндогенного гена pub на начальных этапах дифференцировки эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши (при образовании эмбриоидных тел);

2. Получить стабильно трансфицированные поликлональные линии ЭС клеток мыши с повышенной экспрессией гена pub человека (hpub) и подавленной экспрессией эндогенного гена pub мыши;

3. Изучить влияние как подавления экспрессии эндогенного гена pub, так и усиления экспрессии гена hpub на пролиферацию и дифференцировку ЭС клеток мыши в разных направлениях (эктодермальном, энтодермальном, мезодермальном);

4. Оценить онкогенный потенциал гена hpub человека на культуре псевдонормальных клеток крысы линии Rat-2.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые показано, что ген pub экспрессируется в ЭС клетках мыши, и уровень его экспрессии увеличивается при образовании эмбриоидных тел. Использован двунаправленный подход к изучению влияния гена pub на дифференцировку ЭС клеток мыши: получены клеточные линии с повышенной экспрессией гена человека hpub и подавленной экспрессией эндогенного гена мыши pub.

Продемонстрировано влияние гена pub (hpub) на разные пути дифференцировки ЭС клеток мыши. Показано, что высокоэкспрессирующийся в лимфомах ген человека hpub не обладает выраженным онкогенным потенциалом.

Вовлеченность гена pub в разные пути дифференцировки ЭС клеток мыши свидетельствует о его важности в процессах онтогенеза. Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения функции гена pub, как в ходе эмбрионального развития, так и во взрослом организме. В работе получены стабильные клеточные линии, которые могут в дальнейшем использоваться как модели для изучения влияния взаимодействия генов на разные пути дифференцировки ЭС клеток. Трансфицированные клеточные линии могут применяться для тестирования фармакологических препаратов, а также для оценки влияния различных цитокинов и факторов роста. Результаты диссертационной работы могут быть использованы в дальнейшем при разработке подходов к направленной дифференцировке ЭС клеток по лимфоидному пути для их использования в заместительной клеточной терапии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Ген pub повышенно экспрессируется на ранних этапах дифференцировки ЭС клеток мыши, при образовании эмбриоидных тел.

2. Повышенная экспрессия генов человека hpub и мыши pub, а также подавление экспрессии гена мыши pub не оказывают влияние на пролиферативную активность ЭС клеток мыши.

3. Повышенная экспрессия генов человека hpub и мыши pub стимулирует образование эмбриоидных тел из ЭС клеток мыши, в то время как снижение экспрессии гена мыши pub негативно влияет на образование эмбриоидных тел.

4. Ген человека hpub не обладает выраженным онкогенным потенциалом.

5. Экспрессия генов hpub и pub не влияет на дифференцировку ЭС клеток в энтодермальном направлении.

6. Гиперэкспрессия гена человека hpub в ЭС клетках приводит к значительному увеличению кластеров сокращающихся кардиомиоцитов и к существенному снижению образования нейрональных клеток; подавление экспрессии эндогенного гена pub стимулирует дифференцировку нейрональных клеток и негативно влияет на образование кластеров сокращающихся кардиомиоцитов. Негативное влияние гена человека hpub на нейрональную дифференцировку также показано на линии клеток феохромацитомы крысы PC-12.

7. Под влиянием повышенной экспрессии гена человека hpub происходит стимуляция дифференцировки ЭС клеток в лимфоидном направлении.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на третьем съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2005), на VI международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2005), на конкурсах аспирантов, проводимых в Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной генетики РАН (Москва, 2005-2007), на ежегодной Всероссийской научной конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2006), на заседании Ученого Совета Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН (Москва, 2008), на межлабораторном семинаре Учреждения Российской Академии Наук Института биологии развития РАН им. Н.К. Кольцова (Москва, 2008).

1. Материалы и методы исследования

Культивирование клеток млекопитающих.

В работе были использованы следующие линии клеток: ЭС клетки мыши линии R1, первичные эмбриональные фибробласты мыши, псевдонормальная линия эмбриона крысы Rat-2, клетки феохромацитомы крысы РС-12, лейкемические клетки человека Jurkat.

Все клетки культивировали при при 370С и 5% СО2. Смену среды осуществляли каждые 3 дня.

Культивирование ЭС клеток проводили в среде альфа-МЕМ (“Sigma”, США), содержащей 15% фетальной сыворотки коровы (ФСК) (“Gibco”, США), 0,1 mM 2-меркаптоэтанол, 2 mM L-глутамин, заменимые аминокислоты (“Gibco”, США), нуклеозиды, витамины и антибиотик гентамицин (20 мкг/мл). В качестве питающего (фидерного) слоя для ЭC клеток использовали первичные фибробласты, полученные из эмбрионов мышей, пролиферация которых была блокирована митомицином С (5 мкг/мл). Ростовой средой для первичной культуры фибробластов служила среда ДМЕМ (“Sigma”, США), содержащая 10% ФСК, 2 mM L-глутамин и антибиотик гентамицин (20 мкг/мл).

Культивирование клеток псевдонормальной линии эмбриона крысы Rat-2 проводили в среде ДМЕМ (MP Biomedicals, Inc. Франция) содержащей 10% ФСК (HyClone, США), 2 мМ L-глутамин. Смену среды производили каждые 3 дня. Клетки РС-12 культивировали на среде RPMI 1640 с добавлением: 15% ФСК и 80 мкг/мл гентамицина и 2 mM L-глутамина.

Клетки Jurkat культивировали на среде RPMI 1640 с добавлением 10% ФСК и 80 мкг/мл гентамицина и 2 mM L-глутамина.

Плазмиды, использованные в работе.

1. pcDNA3 («Promega», США) - контрольная плазмида

2. pPB - на основе плазмиды pcDNA3, содержит вставку кДНК гена человека hpub.

3. pIneo («Invitrogen», США) - контрольная плазмида.

4. pRNAi - на основе плазмиды pIneo. Данная плазмида позволяет обеспечить транскрипцию в клетках миРНК, гомологичной определенному участку гена pub.

5. pBR322 - контрольная плазмида.

6. pEJ6.6 - на основе плазмиды pBR322, содержит активированный клеточный онкоген c-Ha-ras1.

7. pEGFP-C1 («Clontech», США), плазмида, содержащая ген зеленого флуоресцирующего белка.

8. k-pub-myc - контрольная плазмида.

9. pub-myc - на основе плазмиды k-pub-myc, содержит вставку кДНК гена мыши pub.

Плазмидную ДНК выделяли из трансформированных клеток E.coli XL1 на колонках с помощью набора реактивов фирмы «Qiagen», США.

Трансфекция клеток млекопитающих.

Трансфекцию клеток осуществляли методом электропорации или с помощью липофектамина. Для каждой клеточной линии были экспериментально подобраны оптимальные условия трансфекции. Из клеток, трансфицированных плазмидами, содержащими ген устойчивости к неомицину, после селекции на содержащей антибиотик среде были получены стабильные поликлональные линии. Для оценки частоты трансфекции использовали плазмиду pEGFP-C1, содержащую ген белка, флуоресцирующего зеленым светом.

Изучение пролиферации клеток.

Для оценки пролиферативной активности трансфицированных линий клетки рассевали по 15х104 на чашки диаметром 35 мм, покрытые желатином (0,01%) с добавлением leukemia inhibitory factor (LIF) (фактор, ингибирующий лейкемию) (10 нг/мл). Количество клеток оценивали на 3-и сут после посева прямым подсчетом под микроскопом Olympus СКХ41 (“Olympus”, Япония) в камере Горяева. Для каждой линии просчитывали не менее 6 чашек.

Вестерн-Блоттинг.

Клетки осаждали центрифугированием и осадок лизировали в RIPA-буфере, содержащем соответствующие детергенты и ингибиторы протеаз. Электрофоретическое разделение проводили в 10-12% ПААГ. После разделения, белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL («Amersham») или мембрану PVDF («Amersham Parmacia Biotech»). Для детекции белка hРub человека использовали первичные кроличьи антитела к TRIM 14 («Aviva Systems biology», США) и вторичные антитела против IgG кролика, коньюгированные с пероксидазой хрена («ИМТЕК», Россия). Для детекции белка Pub мыши использовали мышиные моноклональные антитела anti-myc («Invitrogen», США) и вторичные антитела против IgG мыши, коньюгированные с пероксидазой хрена («ИМТЕК», Россия). Визуализацицию комплексов проводили с использованием набора ECL («Amersham»).

Анализ дифференцировки ЭС клеток в кардиомиоциты.

ЭС клетки рассевали на 96-ти луночные U-образные плашки («Costar», Нидерланды) по 103 клеток на лунку, в 100 мкл стандартной среды для ЭС клеток без LIF для образования эмбриоидных тел. Подсчет ЭТ с сокращающимися кластерами проводили с 7 по 12 сут культивирования.

Иммуноцитохимический анализ.

На 21-е сут культивирования клетки, полученные из эмбриоидных тел фиксировали 4% парафармальдегидом. После трехкратной отмывки 1х PBS, обрабатывали раствором PBS, содержащим 0,1% Triton Х100 и 5% ФСК (PBS-Tr-FBS), в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляли первичные антитела к -III тубулину («Promega», США) и инкубировали при + 4о С в течение ночи. После трехкратной отмывки раствором PBS-Tr-FBS вносили биотинилированные вторичные антитела к Ig мыши и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Затем после трехкратной отмывки PBS-Tr-FBS вносили пероксидазу, коньюгированную со стрептавидином («ИМТЕК», Россия). Инкубировали 1 ч при комнатной температуре и после трехкратной отмывки раствором PBS-Tr-FBS вносили 0,2% раствор субстрата 3-амино-9-этилкарбозола («Sigma», США) в ДМСО. Визуальный контроль за развитием окраски осуществляли под микроскопом Olympus СКХ41 («Olympus», Япония). Для остановки реакции клетки 3-4 раза промывали дистиллированной водой.

Индукция дифференцировки стабильно трансфицированных клеток РС-12 под действием ФРН (фактор роста нервов).

Полученные линии клеток рассевали на 24-луночные плашки, предварительно обработанные полилизином (poly-D-Lysine hydrobromide) по 12,5х103 на лунку. Клетки культивировали в бессывороточной среде RPMI с добавлением 80 мкг/мл гентамицина и 2 mM L-глутамина с одновременным добавлением ФРН в концентрации 100 нг/мл. Подсчет дифференцированных клеток проводили на 9 и 15 сут культивирования под микроскопом (Olympus CKX41., Japan).

2. Результаты и их обсуждения

Экспрессия эндогенного гена pub в недифференцированных ЭС клетках мыши линии R1 и эмбриоидных телах.

Экспрессия эндогенного гена pub обнаружена как в недифференцированных ЭС клетках мыши линии R1, так и в эмбриоидных телах, сформированных в ходе спонтанной дифференцировки. При этом уровень его экспрессии в эмбриоидных телах увеличивается. Это может свидетельствовать о том, что продукт гена pub задействован уже на самых ранних этапах дифференцировки ЭС клеток.

Получение и анализ трансфицированных ЭС клеток.

Конструкции, несущие гены человека hpub, мыши pub и вектор, обеспечивающий подавление экспрессии эндогенного гена pub в результате РНК-интерференции, были использованы для получения стабильно - и транзиентно-трансфицированных поликлональных культур ЭС клеток мыши.

Стабильно-трансфицированные поликлональные линии:

1. ЭС-hPub (линия с повышенной экспрессией гена человека hpub),

2. ЭС-DNA3 (контрольная линия),

3. ЭС-RNAi (линия с пониженной экспрессией эндогенного гена pub)

4. ЭС-Ineo (контрольная линия).

Транзиентно-трансфицированные поликлональные линии:

1. ЭС-pub-myc (линия с повышенной экспрессией гена мыши pub)

2. ЭС-myc (контрольная линия)

Наличие трансгенов hpub и pub было обнаружено методом ОТ-ПЦР и с помощью Вестерн-блоттинга. Также методом ОТ-ПЦР было показано подавление экспрессии эндогенного гена pub в линии ЭС-RNAi.

В связи с тем, что в работе проводилось изучение влияния повышенной экспресии гена человека hpub и пониженной экспрессии гена мыши pub на дифференцировку ЭС клеток мыши, перед нами встал вопрос в какой степени допустимо сравнивать влияния этих генов? Поэтому мы провели сравнительный анализ трансфицированных культур по их пролиферативной активности и способности образовывать ЭТ и соответствующих контрольных линий.

При сравнении пролиферативной активности опытных и контрольных клеток всех шести линий достоверных различий между ними обнаружено не было (рис. 1а,б,в).

Рис. 1. Влияние на пролиферативную активность ЭС клеток повышенной экспрессии генов hpub и pub, а также пониженной экспрессии гена pub. а. 1,3. ЭС-DNA3 (контроль). 2,4. ЭС-hPub. б. 1,3. ЭС-myc (контроль). 2,4. ЭС-pub-myc. в. 1,3. ЭС-Ineo (контроль). 2,4. ЭС-RNAi

эмбриональный ген кардиомиоцит липофектамин

По оси ординат - число клеток, по оси абсцисс - время культивирования (сутки).**р < 0.01.

Эти результаты позволяют предположить, что продукт гена pub и hpub не играет существенной роли в регуляции клеточного цикла ЭС клеток.

В дальнейшем было проведено сравнение этих линий по времени и количеству образующихся ЭТ. Было показано, что в линии клеток ЭС-hPub, несущих экспрессирующийся ген hpub человека, а также в линии клеток ЭС-pub-myc с повышенной экспрессией гена pub мыши ЭТ образуются примерно на сутки раньше и их количество в два раза больше чем в контрольных вариантах. Тогда как в клетках с пониженной экспрессией гена pub (ЭС-RNAi), ЭТ появляются на сутки позже, при этом количество образованных ЭТ было в два раза меньше, чем в контрольном варианте.

Рис. 2. ЭТ, сформированные трансфицированными ЭС клетками на 3-ии сут культивирования (Х200): а - контрольные линии клеток (ЭТ-DNA3 и ЭТ-Ineo), б - ЭТ-hРub, в - ЭТ-RNAi

Таким образом, мы показали, что повышенная экспрессия генов hpub и pub приводит к увеличению количества ЭТ, а подавление экспрессии гена pub негативно сказывается на формировании ЭТ. На основании этих экспериментов можно также сделать вывод, что экспресиия генов hpub и pub оказывает одинаковое воздействие на рост и начальные этапы дифференцировки ЭС клеток. Онкогенный потенциал гена hpub человека.

Для определения онкогенного потенциала гена hpub проводили трансфекцию первичных фибробластов крысы (линия Rat-2) плазмидой, несущей трансген (hpub). Действие гена hpub оценивали по способности трансфицированных клеток образовывать многослойные колонии на фоне монослоя, так называемые фокусы морфологической трансформации. В качестве положительного контроля образования фокусов морфологической трансформации использовали плазмиду, содержащую кДНК активированного клеточного онкогена c-Ha-ras1. На 23 сут культивирования, клетки окрашивали метиленовым синим и проводили подсчет образованных фокусов морфологической трансформации под микроскопом. Было показано, что клетки, несущие трансген, не образовывали фокусы морфологической трансформации, что говорит в пользу отсутствия онкогенного потенциала у данного гена (табл. 1). Тогда как, при трансфекции плазмидой pEJ6.6, несущей активированный онкоген c-Ha-ras1 было выявлено образование фокусов морфологической трансформации (рис. 3).

Табл. 1. Влияние трансгенов hpub и c-Ha-ras1 на образование фокусов морфологической трансформации в псевдонормальной линии клеткок Rat-2

*Данные таблицы - результат трех независимых экспериментов. *- p<0.05

Рис. 3. Фокус морфологической трансформации на 23 сут. после трансфекции (Х200). Стрелкой указана многослойная колония на фоне монослоя трансфицированных клеток

Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на дифференцировку ЭС клеток мыши.

Использование в качестве модели для исследования ЭС клеток мыши позволило нам изучить влияние генов pub и hpub на разные пути дифференцировки клеток, а именно в эктодермальном, энтодермальном и мезодермальном направлениях.

Дифференцировка в эктодермальном направлении дает начало клеткам нервной системы и эпителию, энтодермальном - клеткам печени, поджелудочной железы, щитовидной железы и легких, и мезодермальном - клеткам крови, скелетной и сердечной мускулатуры. В трансфицированных ЭС клетках четырех линий (ЭС-hРub, ЭС-DNA3, ЭС-Ineo, ЭС-RNAi) при удалении фидерного слоя клеток наблюдалась «спонтанная» дифференцировка. Наличие экспрессии специфических генов-маркеров, характеризующих разные типы клеток, определяли с помощью метода ОТ-ПЦР. Анализ проводили на 10-е сут - для выявления маркеров энтодермальной и мезодермальной дифференцировки, а на 21-е сут культивирования - для маркеров эктодермальной дифференцировки.

Для выявления процесса дифференцировки в энтодермальном направлении был проведен анализ экспрессии соответствующих генов-маркеров: vimentin, somatostatin, GATA-4, GATA-6. Был обнаружен одинаковый уровень экспресии генов-маркеров как в клетках с повышенной экспрессией гена hpub, так и в клетках с пониженной экспрессией гена pub, а также в соответствующих контрольных линиях. Исходя из этих данных, можно предположить, что усиление экспрессии гена hpub не влияет на дифференцировку клеток в энтодермальном направлении.

При исследовании дифференцировки в мезодермальном направлении была проведена оценка экспрессии генов trI sk (скелетный тропонин) и trI card (сердечный тропонин), а также генов, ответственных за дифференцировку ЭС клеток в лимфоидном направлении - с-kit и IL-7. Было показано, что уровень экспрессии этих генов в трансфицированных клетках с гиперэкспрессией гена hpub, выше, чем в контрольной линии. При подавлением экспрессии эндогенного гена pub обнаружен более низкий уровень экспрессии генов trI sk trI card и генов c-kit и IL-7, по сравнению с контрольной линией (рис. 4).

Рис. 4. Экспрессия генов, вовлеченных в лимфоидную дифференцировку, в стабильно трансфицированных ЭС клетках (10 сут дифференцировки): а) экспрессия гена c-kit, б) экспрессия гена IL-7, в) экспрессия гена «домашнего хозяйства» tub: 1 - ЭС-клетки линии ЭС-hРub, 2 - ЭС-клетки линии ЭС-DNA3, 3 - ЭС клетки линии ЭС-pIneo, 4 - ЭС клетки линии ЭС-RNAi, 5 - тимус мыши (положительный контроль), 6 - отрицательный контроль

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия гена hpub способствует дифференцировке ЭС клеток по лимфоидному пути. Также нами было показано, что повышение уровня экспрессии гена hpub существенно ускоряет процесс дифференцировки ЭС клеток в кардиомиоциты, а подавление эндогенного гена pub напротив замедляет их дифференцировку (табл. 2).

Табл. 2. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на количество образующихся кардиомиоцитов

В таблице представлены данные 3-х независимых экспериментов. *p<0.05.

Было проведено иммуноцитохимическое окрашивание кластеров кардиомиоцитов антителами к сердечному тропонину (рис. 5).

Рис. 5. Иммуноцитохимическое окрашивание кластеров кардиомиоцитов линии ЭС-hPub, (Х200)

Для изучения влияния генов hpub и pub на дифференцировку в эктодермальном направлении были проведена оценка экспресии генов-маркеров дифференцировки нейральных клеток, а именно гены nestin, в-III tubulin, gfap. Мы показали, что в клетках с повышенной экспрессией гена hpub наблюдается снижение экспрессии данных маркерных генов, а в клетках с подавлением экспрессией pub, напротив, ее увеличение по сравнению с контролями. Методом иммуноцитохимии с использованием антител против в-III тубулина мы также показали негативное влияние повышенной экспрессии гена hpub на дифференцировку ЭС клеток в нейрональном направлении, тогда как подавление экспрессии эндогенного гена, напротив, стимулировало образование нейронов (рис. 6,7).

Рис. 6. Влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена pub на процессы нейрональной дифференцировки ЭС клеток in vitro. *p<0.05. Подсчёт нейронов проводили на 21-е сут культивирования после посева ЭТ

Рис. 7. Иммуноцитохимическое окрашивание ЭС клеток антителами к в-III тубулину на 21-е сут после посева ЭТ, стрелками указаны нейроны, (Х200): а -- клетки ЭС-RNAi, б -- клетки ЭС-hPub

Влияние гена hpub человека на нейрональную дифференцировку было также исследовано на линии клеток феохромацитомы крысы РС-12. Эта линия является удобной и широко используемой моделью для изучения процессов нейрональной дифференцировки и клеточной гибели, поскольку под действием фактора роста нервов (ФРН), добавляемого в культуральную среду, клетки приобретают нейрональноподобный фенотип. В результате трансфекции и последующей селекции, были получены две стабильно-трансфицированные поликлональные линии клеток:

1. линия клеток РС12-hpub (несущая трансген hpub).

2. линия клеток РС12-DNA3 (контроль).

Было показано, что в условиях трофического голодания (при содержании 1% ЭБС в культуральной среде) при добавлении на 1, 3 и 5-е сут в культуральную среду 100 нг ФРН клетки РС-12, несущие трансген hpub и контрольная линия дифференцировались в нейрональноподобные клетки уже на вторые сутки культивирования, а к 7-8 сут в обеих линиях наблюдались нейрональноподобные клетки с хорошо развитыми отростками. При этом количество дифференцированных клеток в контрольной и опытной линии было одинаковым (рис. 8).

Рис. 8. Влияние повышенной экспрессии гена hpub на нейрональную дифференцировку трансфицированных клеток РС-12 при добавлении ФРН в условиях трофического голодания (1% ЭБС), (Х200), 8 сут культивирования: а) дифференцированные клетки линии PC12-hpub, б) дифференцированные клетки линии PC12-DNA3

Однако, при добавление в культуральную среду ФРН в условиях бессывороточной среды, дало другой результат. Количество дифференцированных клеток в линии PC12-hpub было существенно ниже, чем в контрольной линии PC12-DNA3. Эти различия появились на 5 сутки культивирования и сохранялись на протяжении всего эксперимента (рис. 9).

Рис. 9. Влияние повышенной экспрессии гена hpub на нейрональную дифференцировку трансфицированных клеток РС12 при добавлении ФРН в условиях бессывороточной среды. Результат трех независимых экспериментов

Результаты эксперимента на клеточной линии феохромацитомы крысы РС-12 может служить подтверждением полученных нами ранее данных о негативном влиянии гена человека hpub на нейрональную дифференцировку ЭС клеток мыши (см. рис. 6,7). Однако нужно иметь в виду, что этот эффект проявляется только в условиях бессывороточной среды, тогда как при пониженном содержании сыворотки (1%) мы не обнаружили различий в характере дифференцировки клеток, несущих трансген hpub и контрольной линии клеток.

Заключение

Выводы.

1. Экспрессия эндогенного гена pub увеличивается на начальных этапах дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши.

2. Изменения в экспрессии генов hpub человека и pub мыши не оказывают влияния на пролиферативную активность эмбриональных стволовых клеток мыши.

3. Повышенная экспрессия гена hpub человека стимулирует, а пониженная экспрессия гена pub мыши ингибирует образование эмбриоидных тел in vitro.

4. На клеточной линии Rat-2 показано, что ген hpub человека не обладает выраженным онкогенным потенциалом, повышение его экспрессии не приводит к формированию фокусов морфологической трансформации.

5. Не обнаружено влияния генов hpub и pub на уровень экспрессии генов-маркеров энтодермальной дифференцировки (vimentin, somatostatin, GATA-4, GATA-6) в эмбриональных стволовых клеток мыши.

6. Повышенная экспрессия гена hpub человека усиливает потенциал эмбриональных стволовых клеток мыши к дифференцировке в мезодермальном направлении: обнаружено увеличение количества сокращающихся кардиомиоцитов, усиление экспрессии генов скелетного и сердечного тропонина (tr sk, tr card), а также лимфоидспецифичных генов c-kit, IL-7. Пониженная экспрессия гена pub мыши приводит к уменьшению количества сокращающихся кардиомиоцитов и снижению экспрессии этих генов по сравнению с контролем.

7. Повышенная экспрессия гена hpub человека оказывает ингибирующее действие на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши в эктодермальном направлении, приводя к уменьшению количества образующихся нейронов и к снижению экспрессии генов в-III tubulin, nestin, тогда как пониженная экспрессия гена pub мыши, напротив, способствует усилению экспрессии этих генов и стимулирует образование нейронов in vitro. Негативное влияние повышенной экспрессии гена hpub на нейрональную дифференцировку подтверждено также в экспериментах на клеточной линии феохромацитомы крысы РС-12.

Литература

1. Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В., Долотов О.В., Иноземцева Л.С., Козаченков К.Ю, Тарантул В.З., Гривенников И.А. Разнонаправленное влияние повышенной и пониженной экспрессии гена pub на образование эмбриоидных тел в культуре эмбриональных стволовых клеток мыши // Клеточные технологии в биологии и медицине. №3. 2005. С. 174-179.

2. Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В., Долотов О.В., Иноземцева Л.С., Ситникова О.В., Тарантул В.З., Гривенников И.А Эктопическая экспрессия гена pub (hpub) человека в эмбриональных стволовых клетках мыши оказывает разнонаправленное влияние на характер их дифференцировки in vitrо // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. Т.1. №2. 2005. С.14-21.

3. Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В., Лебедев А.Н., Тарантул В.З., Гривенников И.А. Повышенная экспрессия гена hpub стимулирует лимфоидную дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши, но не образование фокусов злокачественной трансформации in vitro // Медицинская генетика. №8. 2008. С.43-46.

4. Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В., Долотов О.В., Иноземцева Л.С., Ситникова О.В., Тарантул В.З., Гривенников И.А. Изучение влияния экспрессии гена pub на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro // 3-й Съезд биотехнологов. Москва. 2005. 25-27 октября. Сборник тезисов. С.14-15.

5. Гривенников И.А, Новосадова Е.В., Ситникова О.В., Арсеньева Е.Л., Долотов О.В., Иноземцева Л.С., Хайдарова Н.В., Мануилова Е.С., Тарантул В.З. Генетические модификации эмбриональных стволовых клеток: подход к их направленной дифференцировке // VI международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород. 2005. 12-16 декабря. Сборник тезисов. С.91.

6. Арсеньева Е.Л., Мануилова Е.С., Новосадова Е.В., Хайдарова Н.В., Иноземцева Л.С., Гривенников И.А., Тарантул В.З. Направленная дифференцировка генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток // VI международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород. 2005. 12-16 декабря. Сборник тезисов. С.86.

7. Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В., Долотов О.В, Иноземцева Л.С., Ситникова О.В, Тарантул В.З., Гривенников И.А. Сравнительное изучение влияния экспрессии экзогенного гена hpub и эндогенного гена pub мыши на процессы дифференцировки эмбриональных стволовых клеток // VI международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород. 2005. 12-16 декабря. Сборник тезисов. С.100.

8. Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В., Долотов О.В, Иноземцева Л.С., Ситникова О.В, Тарантул В.З., Гривенников И.А. Изучение влияния повышенной экспрессии человеческого гена hpub на начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro // Ежегодная Всероссийская научная конференция с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении. Москва. 2006. 24-25 мая. Сборник тезисов. С.93.

9. Гривенников И.А., Новосадова Е.В., Ситникова О.В., Арсеньева Е.Л., Долотов О.В., Иноземцева Л.С., Хайдарова Н.В., Мануилова Е.С., Тарантул В.З. Эмбриональные стволовые клетки, их генетические модификации и проблема направленной дифференцировки // Ежегодная Всероссийская научная конференция с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении». Москва. 2006. 24-25 мая. Сборник тезисов. С.54.

10. Гривенников И.А., Долотов О.В., Новосадова Е.В., Мануилова Е.С. Нейродегенерация в центральной нервной системе: нейропротекция или нейротрансплантация? // Конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». Санкт-Петербург-Колтуши. 2008. 10-12 сентября. Сборник тезисов. С.32-33.

Размещено на Allbest.ru