Роль цАМФ–связывающих белков Eрас в регуляции сократимости кровеносных сосудов и сердца

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность проблемы. цАМФ был открыт в конце 50-х годов прошлого века как вторичный посредник, передающий сигналы в клетку от множества гормонов, нейротрансмиттеров, простагландинов, ряда других субстанций, которые активируют аденилатциклазу. До недавнего времени считалось, что универсальным механизмом действия цАМФ является активация протеинкиназы А. В 1998 г. были обнаружены новые внутриклеточные мишени цАМФ - белки Epac1 и Epac2 (Exchange Proteins Activated by cAMP). Они широко распространены в организме и по крайней мере один из этих белков, Epac1, выявлен во всех исследованных тканях. Связывая цАМФ, белки Epac взаимодействуют с низкомолекулярными G-белками Rap1A/2B и стимулируют замещение ГДФ на ГТФ в их регуляторном центре, поэтому их обозначают также как cAMP-GEF (guanine nucleotide exchange factor). Белки Rap активируют протеинкиназу B-Raf, которая, в свою очередь, активирует протеинкиназный каскад MEK/Erk. Несколько позднее было установлено, что помимо Rap, белки Epac активируют специфичную к фосфоинозитидам фосфолипазу С-, KATP-каналы, влияют на функционирование хлорных каналов (Holz, 2006). В кардиомиоцитах мыши выявлен макромолекулярный комплекс Epac1 с рианодиновыми рецепторами, протеинкиназой А и фосфодиэстеразой цАМФ (Dodge-Kafka et al., 2005).

Изучение роли белков Epac в регуляции цАМФ-зависимых физиологических процессов находится на начальной стадии. Показано, что, наряду с протеинкиназой А, белки Epac активируют секрецию, влияют на межклеточные взаимодействия, процессы дифференцировки и апоптоза, принимают участие в регуляции ионных каналов и передачи сигнала в синапсе. (Holz, 2006). цАМФ играет ключевую роль в регуляции работы сердца и всей сердечно-сосудистой системы, вызывая расслабление кровеносных сосудов (Kotlikoff, 1996) и стимуляцию сократимости сердца (Kammerer, 2003). Доказано, что в реализации этих эффектов цАМФ участвует протеинкиназа А, однако роль белков Epac в проявлении действия цАМФ на сосуды и сердце не исследовалась.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению механизмов цАМФ-зависимой регуляции сократимости сосудов и сердца и выяснению роли белков Epac в проявлении действия цАМФ на эти органы.

В работы были поставлены следующие задачи:

1. Определить, участвуют ли белки Epac в цАМФ-зависимой регуляции сосудистого тонуса.

2. Оценить специфичность действия аналогов цАМФ, использованных для активации белков Epac.

3. Исследовать влияние цАМФ на кальциевый обмен в культивируемых гладкомышечных клетках аорты крысы.

4. Оценить роль белков Epac и протеинкиназы А в цАМФ-опосредованной регуляции сократимости сердца, используя в качестве модели изолированное сердце виноградной улитки Helix pomatia.

5. Исследовать на модели изолированного сердца виноградной улитки цАМФ-независимые пути активации сердечной сократимости.

Научная новизна и практическая значимость работы. Установлено, что расслабление аорты крысы, вызванное цАМФ, опосредовано активацией не только протеинкиназы А, но и белков Epac. Показано, что одним из механизмов цАМФ-индуцированного расслабления кровеносных сосудов является подавление повышения концентрации ионов кальция в цитоплазме гладкомышечных клеток в ответ на вазоконстрикторные стимулы.

Показано, что подавление под влиянием цАМФ агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, опосредовано протеинкиназой А без участия белков Epac.

Обнаружено, что активаторы белков Epac и протеинкиназы А увеличивают амплитуду вызванного серотонином сокращения сердца виноградной улитки Helix pomatia. Это свидетельствует об участии данных мишеней цАМФ в регуляции сократимости сердца. Установлено, что активация сократимости сердца виноградной улитки H.pomatia, вызванная серотонином, опосредована двумя видами рецепторов. Рецепторы одного вида сопряжены с аденилатциклазой и повышают уровень цАМФ. Второй вид подобен 5НТ3-рецепторам, относящимся к типу ионотропных рецепторов и активирующих сердце по цАМФ-независимому механизму.

Установлено, что цАМФ-независимый механизм реализуется при активации сокращений сердца виноградной улитки тромбином. Полученные данные свидетельствуют, что тромбин активирует в сердце улитки рецепторы, гомологичные активируемым протеазами рецепторам 1-го и 4-го типов млекопитающих.

Проведенные исследования расширяют представления о биохимических основах работы сердечно-сосудистой системы. Они создают предпосылки для более детального изучения механизмов действия на сосуды и сердце гормонов и нейротрансмиттеров, связывающихся с рецепторами, активирующими аденилатциклазу. Полученные результаты могут иметь значение при разработке научно обоснованных подходов к лечению сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку многие фармакологические препараты, влияющих на сердце и сосуды, оказывают свое действие через систему обмена цАМФ.

Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 2 статьи. Результаты диссертации были представлены на 13-м международном совещании по эволюционной физиологии (СПб, 2006), на Международной конференции по простым нервным системам, (Казань, 2006) и на конференциях молодых ученых ИБР РАН (2005,2006) .

1. Материалы и методы исследования

серотонин сердце гормон

Аналоги цАМФ, избирательно действующие на белки Epac и протеинкиназу А

Основной подход, который применяется для изучения физиологических функций белков Epac, заключается в использовании аналогов цАМФ, избирательно активирующие белки Epac (Schwede et al, 2000, Kang et al, 2003). Специфические ингибиторы этих белков отсутствуют. В настоящей работе для активации белков Epac были использованы соединения 8-(4-метоксифенилтио)-2'-O-метиладенозин-цАМФ (8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP) и 8-(4-хлорофенилтио)-2'-О-метиладенозин-цАМФ (8-CPT-2'-O-Me-cAMP). Для избирательной активации и ингибирования протеинкиназы А применяли Sp-8-Br-cAMPS и Rp-8-Br-cAMPS, соответственно (рис. 1).

Рис. 1. Структура аналогов цАМФ, избирательно действующих на белки Epac и протеинкиназу А

Измерение силы изометрического сокращения изолированных фрагментов аорты крысы.

Измерение силы сокращения изолированных фрагментов грудного отдела аорты крысы при действии на них вазоактивных гормонов и нейротрансмиттеров проводили в изометрическом режиме (Кожевникова и соавт., 2006).

Культивирование гладкомышечных клеток аорты крысы.

Гладкомышечные клетки выделяли из препаратов аорты крыс-самцов линии Wistar методом эксплантов. Для экспериментов использовали клетки 2-8 пассажей. Их культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка.

Измерение амплитуды сокращений изолированного сердца улитки.

Исследования проводились в июле-сентябре на Кропотовской биологической станции Института биологии развития им. Н.К. Кольцова. В опытах использовали крупных виноградных улиток Helix pomatia с размером раковины 35-45 мм. Эксперименты проводили при температуре 23-25С. Сокращения изолированного желудочка сердца H.pomatia регистрировали по ранее описанному методу в изотоническом режиме (Suslova, Solomonova et al, 2005). На рисунках показаны изменения амплитуды сокращений сердца.

Измерение активности аденилатциклазы в препаратах мембраны сердца улитки.

Для выделения мембран 10 свежепрепарированных сердец разрушали гомогенизатором типа “Политрон” в охлажденном до +4С буфере (20 мМ трис-Cl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4), далее проводили центрифугирование при температуре +4С в течение 1 часа при 100000g. Полученный осадок мембран ресуспендировали в этом же буфере. Активность аденилатциклазы определяли в среде объемом 50 мкл, содержащей 0,5-1 µCi [-32P]ATФ, 0,05 мМ ATФ, 1 мМ цAMФ, 10 мкМ ГTФ, 1 мМ MgCl2, 2 мМ креатинфосфата, 0,1 мг/мл креатинфосфокиназы, 10 мМ HEPES-Na (pH 7,2). Инкубацию проводили в течение 20 минут при 25oC. Образовавшийся [32P]цAMФ отделяли от [-32P]ATФ и продуктов его распада путем хроматографии на колонках с Al2O3 (White, 1974).

Измерение агрегации тромбоцитов.

Измерение агрегации проводили по изменению светопропускания по стандартному методу Борна на приборе фирмы «Биола» (Москва). Агрегацию индуцировали добавлением 5 мкМ АДФ. Для определения действия активаторов протеинкиназы А и белков Epac тромбоциты преинкубировали с этими веществами в течение 10 минут при 37C перед добавлением АДФ.

Измерение концентрации цитоплазматического кальция с помощью флуоресцентного зонда Fura-2.

Для измерения концентрации цитоплазматического кальция использовались клетки 2-8 пассажей. Прокраску клеток проводили с 8 мкМ Fura-2(АМ) в присутствии 0,0002% Pluronic в течение 40 минут при температуре 23-25 oC. Измерение цитоплазматической концентрации кальция проводили на инвертированном микроскопе Nikon оборудованном CCD камерой CoolSnap-fx (“Roper Scientific”,США). Данные, полученные при помощи Ca2+ чувствительного зонда Fura-2 представлены как отношение интенсивностей флуоресценции, возбуждаемой при длинах волн 340 и 380 нм (F340/F380). Все растворы готовили на буфере состава (мМ): NaCl - 145; KCl - 5; MgCl2 - 1; CaCl2 - 1; Hepes - 5; D-глюкоза - 10 (pH = 7,4 при 25°С) и добавляли путем полной замены раствора в камере с клетками.

Статистическая обработка результатов.

Статистическая обработка данных проводилась в программе MS Exel. При оценке достоверности различий показателей использовали t- критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при p < 0,05.

2. Основные результаты работы

Влияние форсколина и аналогов цАМФ, активирующих белки Epac и протеинкиназу А, на сократимость изолированной аорты крысы.

Для того, чтобы оценить влияние цАМФ на сократимость сосудов был использован активатор аденилатциклазы форсколин. На рис.2 показано, что форсколин (0,2 мкМ) вызывает расслабление изолированной аорты, предсокращенной норадреналином. Высокоселективный ингибитор протеинкиназы А Rp-8-Br-cAMPS почти полностью снимал расслабляющий эффект форсколина (рис.2В). Однако при повторном добавлении к сосудам более высокой концентрации форсколина (0,4 мкМ) его расслабляющее действие на аорту вновь проявлялось. Причем в данном случае расслабление происходило более медленно, чем в контроле при использовании меньшей концентрации форсколина (рис.2Б). Ингибитор протеинкиназы А (Rp-8-Br-cAMPS) является конкурентным по отношению к цАМФ. Поэтому при увеличении концентрации форсколина до 0,4 мкМ уровень цАМФ в клетке возрастает в большей степени , что может приводить к вытеснению Rp-8-Br-cAMPS из участка связывания на регуляторной субъединице протеинкиназы А.

Рис 2. Расслабление изолированной аорты, вызванное форсколином (Ф) и влияние селективного ингибитора протеинкиназы А Rp-8-Br-cAMPS (R) на действие форсколина. Форсколин применяли в концентрациях 0,2 мкМ (Б), 0,2 и 0,4 мкМ (В). Концентрация Rp-8-Br-cAMPS составляла 100 мкМ, норадреналина (НА) - 10 мкМ

В то же время нельзя исключить и существования альтернативного цАМФ-зависимого механизма расслабления, который реализуется при более высокой концентрации цАМФ, чем требуется для активации протеинкиназы А. Мы предположили, что белки Epac принимают участие в процессе цАМФ-зависимого расслабления сосудов. Для оценки возможного влияния белков Epac на сократимость аорты были использованы высокоизбирательные активаторы этих белков - 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP и 8-CPT-2'-O-Me-cAMP.

Рис. 3. Расслабление кольца аорты крысы под влиянием активаторов белков Epac и протеинкиназы А. Показано влияние 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP (100 мкМ) и Sp-8-Br-cAMPS (40 мкМ) на сокращение аорты, вызванное норадреналином (А,В) и влияние 8-pCPT-2'-O-Me-cAMP (100 мкМ) на сокращение вызванное фенилэфрином. Концентрации норадреналина (НА) и фенилэфрина (ФЭ) сотавляли 0,1 мкМ

Оказалось, что эти соединения вызывают расслабление аорты, предсокращенной норадреналином и фенилэфрином (рис. 3А,Б).

Расслабление аорты наступает также при избирательной активации протеинкиназы А с помощью селективного активатора этого фермента Sp-8-Br-cAMPS (рис 3В).

Нами показано, что релаксирующее действие активаторов белков Epac и протеинкиназы А является дозозависимым. Полумаксимальные эффекты на сократимость аорты наблюдаются при концентрациях Sp-8-Br-cAMPS (активатор ПКА) и 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP (активатор Epac) 17,0+0,6 и 64+7 мкМ, соответственно (рис.4). Из приведенных на рисунке 4 данных видно, что даже при насыщающих концентрациях активатора Epac 8-pMeOPT-2'-O-Me-сAMP расслабление было неполным, тогда как активация протеинкиназы А вызывает 100%-ое расслабление аорты.

Рис. 4. Зависимость степени расслабления предсокращенной норадреналином аорты от концентрации Sp-8-Br-cAMPS (активатор протеинкиназы А) и 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP (активатор Epac)

Принципиально важно было выяснить, действительно ли действие активаторов Epac (8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP и 8-CPT-2'-O-Me-cAMP) специфично и не опосредовано активацией протеинкиназы А. Специфичность действия активаторов белков Epac доказывают опыты, проведенные на тромбоцитах. Известно, что в тромбоцитах повышение уровня цАМФ блокирует увеличение концентрации цитоплазматического Са2+ и подавляет их агрегацию (Авдонин и соавт., 1985). Установлено, что цАМФ-зависимое подавление агрегации тромбоцитов происходит при участии протеинкиназы А. Действительно, как видно из приведенных в таблице данных, активация эндогенной протеинкиназы A Sp-8-Br-cAMPS полностью блокировала АДФ - индуцированную агрегацию тромбоцитов человека (таблица). В отличие от этого, активатор белков Epac 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP в концентрации 200 мкМ не влиял на данный процесс. Аналогичные результаты были получены и в опытах на тромбоцитах крысы. Следовательно, белки Epac не ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Второй вывод, который следует из этих результатов - это то, что активатор белков Epac 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP даже в концентрации 200 мкМ не вызывает активацию протеинкиназы A, то есть является специфичным по отношению к белкам Epac.

Из этого следует, что расслабляющее действие активатора белков Epac на сосуды также не связано с активацией протеинкиназы А, поскольку использованная в этом случае концентрация 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP была как минимум в два раза ниже, чем в экспериментах с тромбоцитами.

Таблица 1. Влияние активаторов белков Epac (8-p-MeOPT-2'-O-cAMP) и протеинкиназы А (Sp-8-Br-cAMPS) на агрегацию тромбоцитов человека, индуцированную АДФ

Для каждого значения приведены данные 3-х измерений и стандартные ошибки среднего.

Дополнительным подтверждением вышесказанного являются опыты с ингибитором протеинкиназы A Rp-8-Br-cAMPS, добавление которого в концентрации 100 мкМ не предотвращало расслабление аорты под действием 100 мкМ 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP (данные не приводятся). Следует отметить, что данный ингибитор протеинкиназы А в концентрации 100 мкМ уменьшал релаксирующее действие форсколина (рис. 2).

Рис. 5. Оценка влияния ингибитора протеинкиназы G Rp-8Br-cGMPS (100 мкМ) на расслабляющее действие активатора белков Epac 8-pCPT-2'-O-Me-cAMP (100 мкМ) и нитроглицерина. Нитроглицерин использовали в концентрациях 11, 22, 44, 110 нМ и 4,4 мкМ. Добавление нитроглицерина обозначено тонкими стрелками. Аорту предсокращали путем добавления 0,1 мкМ фенилэфрина (ФЭ)

Важнейший механизм релаксации сосудов реализуется через NO/цГMФ-сигнальный путь. Если расслабление при участии белков Epac каким-то образом сопряжено с этим сигнальным путем, то эффект активаторов Epac на сосуды можно заблокировать при помощи селективного ингибитора цГМФ-активируемой протеинкиназы G. Для проверки этой гипотезы нами было исследовано влияние ингибитора цГМФ-активируемой протеинкиназы Rp-8-бромогуанозин-3',5'-циклического монофосфоротиоата (Rp-8-Br-cGMPS) на вызываемое активатором белков Epac 8-CPT-2'-O-Me-cAMP расслабление аорты. Как видно на рисунке 5, в присутствии ингибитора протеинкиназы G расслабление аорты под влиянием 8-CPT-2'-O-Me-cAMP было таким же, как в контрольном эксперименте. Для того, чтобы проверить, эффективен ли используемый ингибитор протеинкиназы G в условиях нашего эксперимента, было определено его действие на эффект донора NO - нитроглицерина. Оказалось, что ингибитор цГМФ-активируемой протеинкиназы подавлял действие нитроглицерина, делая его эффект обратимым (рис.5). Полученные результаты говорят о том, что расслабление аорты при действии активаторов белков Epac не связано с NO/цГМФ-сигнальным путем.

Таким образом, поставленные нами контрольные эксперименты доказывают, что действие 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP и 8-CPT-2'-O-Me-cAMP специфично, и именно один из белков или оба белка Epac вызывают расслабление аорты. Вопрос о том, каков механизм действия этих белков, остается пока открытым. Можно предположить, что они действуют непосредственно в гладкомышечных клетках, подавляя вызванный вазоконстрикторными гормонами или нейротрансмиттерами подъем [Ca2+]цит, вызывают эндотелий-зависимое расслабление сосудов или ингибируют Са-независимый механизм сокращения гладких мышц сосудов.

Исследование влияния цАМФ на повышение концентрации кальция в гладкомышечных клетках сосудов под действием серотонина

Расслабление сосудов, предсокращенных гормонами или другими вазоактивными веществами, может происходить в результате ингибирования подъема уровня цитоплазматического кальция ([Ca2+]цит), вызванного вазоконстрикторами в гладкомышечных клетках (ГМК). Известно, что серотонин является мощным индуктором, повышающим уровень цитоплазматического кальция в ГМК. Мы оценивали влияние цАМФ на уровень повышения кальция под действием серотонина, регистрируя изменение концентрации [Ca2+]цит при помощи флуоресцентного зонда Fura-2. В контрольном эксперименте повторное добавление серотонина через 20 минут после первой добавки практически не снижало амплитуду кальциевого сигнала (рис. 6А). Однако после преинкубации клеток в течение 10 минут с 10 мкМ форсколина перед повторным добавлением серотонина амплитуда кальциевого сигнала уменьшалась более, чем в два раза (рис. 6 Б,В)

Рис. 6. Влияние форсколина на повышение концентрации цитоплазматического кальция вызванной серотонином. А,Б - кинетика изменения [Ca2+]цит. В гладкомышечных клетках без преинкубации (А) и с преинкубацией с форсколином (Б). В- изменения реакции клеток при повторном добавлении в отсутствии и в присутствие форсколина. Концентрация серотонина составляла 10 мкМ, концентрация форсколина -10 мкМ. n - количество клеток

Таким образом, можно предположить, что одним из механизмов действия цАМФ приводящим к расслаблению сосудов является ингибирование повышения концентрации цитоплазматического кальция в гладкомышечных клетках аорты крысы.

Исследование механизмов действия цАМФ на сократимость сердца.

Влияние форсколина на сокращение сердца виноградной улитки.

Для изучения цАМФ-зависимых механизмов регуляции сократимости сердца и роли белков Epac мы выбрали хорошо охарактеризованный в нашей лаборатории объект - сердце виноградной улитки Helix pomatia. Сердце улитки является чрезвычайно удобным объектом для проведения физиологических экспериментов, поскольку оно способно часами стабильно самопроизвольно сокращаться, а при хранении при 4оС сохраняет жизнеспособность в течение нескольких суток. В отличие от млекопитающих, у моллюсков активацию сократимости сердца вызывает серотонин, а не катехоламины. В активации сокращений сердца серотонином участвует цАМФ (Wollemann and Rozsa, 1975), однако детали этого процесса и механизмы действия цАМФ не исследованы. Влияние возрастающих концентраций серотонина на сокращения сердца виноградной улитки показано на рис. 7. Серотонин влияет на амплитуду сокращений и, как правило, не приводит к изменению частоты сокращения сердца.

Рис. 7. Активация серотонином (5-HT) сокращения сердца виноградной улитки H.pomatia

R-раствор Рингера. Концентрацию серотонина увеличивали путем смены раствора в канюле, к которой был прикреплен изолированный желудочек сердца улитки.

Мы убедились что серотонин активирует синтез цАМФ в мембранах, выделенных из сердца виноградной улитки (рис. 8). Для того, чтобы оценить влияние цАМФ на сократимость сердца улитки, был использован активатор аденилатциклазы форсколин. Он оказывает значительно более сильный, по сравнению с серотонином, стимулирующий эффект на аденилатциклазу в мембранах, выделенных из сердца улитки (рис. 8). Однако при сравнении влияния серотонина и форсколина на сократимость изолированного сердца улитки оказалось, что действие последнего значительно слабее (рис. 9).

Рис. 8. Влияние серотонина и форсколина на активность аденилатциклазы в мембранах сердца виноградной улитки.

Рис. 9. Влияние форсколина (А) и серотонина (Б) на амплитуду сокращений желудочка сердца виноградной улитки

Исследование роли протеинкиназы А и белков Epac в проявлении активирующего действия цАМФ на сократимость сердца.

Возникает вопрос о том, какова функция цАМФ в регуляции сократимости сердца. Из приведенных ранее данных (рис.9) видно, что просто повышение уровня цАМФ в сердце не приводит к сильному увеличению сократимости: эффект форсколина значительно слабее эффекта серотонина. Мы предположили, что в сердце моллюсков при воздействии серотонина реализуются цАМФ-зависимый и цАМФ-независимый механизмы активации сократимости. Для оценки влияния цАМФ на сократимость сердца улитки и выяснения механизмов его действия были использованы проникающие через мембрану аналоги цАМФ, селективно активирующие протеинкиназу А и белки Epac, Sp-8-Br-cAMPS и 8-CPT-2'-O-Me-cAMP, соответственно. На рис.10 показано, что преинкубация изолированного сердца с каждым из этих соединений достоверно увеличивает амплитуду реакции сердца на серотонин. Ни одно из них в отсутствие серотонина не увеличивает амплитуду сокращения сердца.

Рис. 10. Влияние 8-CPT-2'-O-Me-cAMP и 8-Br-cAMPS на вызываемое серотонином увеличение амплитуды сокращения сердца виноградной улитки

Зависимости амплитуды сокращения сердца от концентрации серотонина определяли в контрольных условиях (нижние кривые) и в присутствии 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP и Sp-8-Br-cAMPS в концентрациях 100 мкМ и 200 мкМ, соответственно. Данные соединения добавляли к сердцу за 20 минут до серотонина. Дозовые зависимости от серотонина (5-НТ) в контрольных условиях определяли за 40 минут до преинкубации сердец с аналогами цАМФ. В отдельных экспериментах показано, что без преинкубации с активаторами протеинкиназы А и белков Epac реакция на серотонин не изменяется.

Причина этого пока не установлена. Можно предполагать, что для усиления сократимости при действии цАМФ необходима одновременная стимуляция протеинкиназы А и белков Epac.

Активация сокращения сердца улитки серотонином через рецепторы, не сопряженные с аденилатциклазой.

Приведенные выше данные говорят о том, что цАМФ не является основным фактором, регулирующим сердечную деятельность у виноградной улитки. При действии серотонина реализуется также другой, независимый от цАМФ механизм активации сократимости сердца. Мы предположили что в сердце виноградной улитки существует несколько видов рецепторов серотонина, активирующих сердце. О существовании более чем одного вида рецепторов серотонина в сердце улитки говорит тот факт, что зависимость амплитуды сократимости сердца от концентрации серотонина при анализе в координатах Скетчарда представляет из себя вогнутую двухфазную кривую (рис. 11).

Рис. 11. Зависимость амплитуды сокращения сердца от концентрации серотонина представленная в координатах Скетчарда. По оси абцисс отложена величина амплитуды сокращений, выраженная в процентах от максимальной. По оси ординат отложено отношение амплитуды сокращения (%) к концентрации серотонина в нМ

Для млекопитающих показано наличие 7 типов серотониновых рецепторов, большинство из которых сопряжены с G белками и влияют на активность аденилатциклазы и фосфолипазы С. Из этих семи типов 5НТ-рецепторов только 5HT3-рецепторы не сопряжены с G-белками и являются ионными каналами, через которые осуществляется транспорт катионов (Aghajanian and Sanders-Bush, 1999). Серотониновые рецепторы улитки не изучены, но, по аналогии с млекопитающими, мы предположили, что в реализации действия серотонина на сердце принимают участие различные типы серотониновых рецепторов, включая 5НТ3. В связи с этим было исследовано действие агониста серотониновых рецепторов третьего типа 5-HTQ (иодида N,N,N-триметил-серотонина). Оказалось, что действие 5-HTQ на сердце улитки вызывает дозозависимое увеличение амплитуды сокращения сердца (рис.12). Помимо этого, специфический антагонист 5HT3-рецепторов 3-тропонил-3,5-дихлорбензоат при концентарции 50 мкМ подавляет реакцию сердца на серотонин. Эти данные доказывают, что в сердце виноградной улитки имеются рецепторы, родственные 5HT3-рецепторам млекопитающих, которые, в отличие от всех остальных рецепторов серотонина, не сопряжены с G-белками и относятся к типу ионотропных рецепторов. Таким образом, существует путь регуляции сократимости сердца который не зависит от цАМФ.

Рис. 12. Увеличение амплитуды сокращения сердца под действием агониста 5HT3 рецепторов 5-HTQ (А) и ингибирование эффекта серотонина блокатором 5HT3-рецепторов 3-тропонил-3,5-дихлорбензоатом (Тр) (Б). Слева приведены контрольные зависимости амплитуды сокращений от концентрации серотонина. При определении действия блокатора 5НТ3-рецепторов его добавляли в концентрации 50 мкМ в отсутствие серотонина, а затем добавляли возрастающие концентрации серотонина одновременно с блокатором (Б, правая часть). R - раствор Рингера.

цАМФ независимый механизм регуляции сократимости сердца улитки тромбином.

Так как действие цАМФ на сократимость сердца имеет, судя по всему, модулирующий характер, возникает закономерный вопрос о наличии полностью независимых от цАМФ механизмов регуляции сердечной деятельности. Мы обнаружили, что тромбин увеличивает амплитуду сокращений сердца (рис.13). Частота сокращений сердца до добавления тромбина составляла 40 ударов в минуту и не изменялась под действием тромбина. Вызванная тромбином активация сокращений сердца была обратимой - после его отмывания амплитуда сокращений быстро опускалась до исходного уровня.

При последующем после отмывания добавлении тромбина прирост амплитуды уменьшался не сильно. Это свидетельствует об избыточном содержании рецепторов тромбина и отсутствии существенной десенситизации. Характерная для лиганд-рецепторного взаимодействия зависимость эффекта тромбина от его концентрации свидетельствует, что тромбин связывается со специфичными для него рецепторами. В такой же области концентраций тромбин вызывает увеличение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме гладкомышечных клеток аорты крысы и человека (Yufu et al, 2005).

Рис. 13. Влияние тромбина на амплитуду сокращений желудочка сердца улитки H.pomatia

Можно предполагать, что тромбин имитирует действие эндогенной протеазы, присутствующей в крови улитки H. pomatia. У млекопитающих действие тромбина на сердце и сосуды опосредовано активируемыми протеазами рецепторами первого, третьего и четвертого типа (Protease Activated Receptor PAR1,3,4 ). Селективные пептидные лиганды рецепторов PAR1 и PAR4, имитирующие действие тромбина, имеют последовательности Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn (SFLLRN) и Glu-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe (QYPGKF), соответственно. Мы обнаружили, что оба эти лиганда влияют на сократимость изолированного сердца H.pomatia, увеличивая амплитуду сокращений (рис.14). Пороговая концентрация, при которой данные пептиды активировали сокращение сердца, составляла около 10 мкМ. При концентрации выше 10-4 М лиганд рецепторов PAR1 вызывал контрактуру сердца. В отличие от серотонина, ни тромбин, ни пептидные лиганды не стимулировали синтез цАМФ в мембранном препарате из сердца улитки (рис.15). В клетках млекопитающих рецепторы тромбина также не активируют, а, наоборот, подавляют синтез цАМФ. Рецепторы PAR1 сопряжены с несколькими видами ГТФ-связывающих гетеротримерных G-белков: Gi, Gz, Gq/11, G12/13 (Barr et al, 1997; Marinissen et al, 2003). Если пептид SFLLRN действительно активирует сердце моллюсков через рецепторы, гомологичные PAR1, тогда он тоже может запускать разные сигнальные механизмы. Диапазон действия рецепторов PAR4, если судить по имеющимся данным, более узкий. Эти рецепторы активируют внутриклеточный кальциевый обмен через белки Gq/11 и фосфолипазу С (Macfarlane, Seatter et al, 2001).

Приведенные в настоящей работе данные свидетельствуют о наличие в сердце моллюска H.pomatia активируемых тромбином рецепторов, гомологичных рецепторам PAR1 и PAR4 млекопитающих.

Рис. 14. Зависимости амплитуды сокращений желудочков сердца H.pomatia от концентраций пептидов SFLLRN и QYPGKF, лигандов рецепторов PAR1 и PAR4, соответственно

Рис. 15. Влияние серотонина, тромбина и пептидных лигандов рецепторов PAR1 и PAR4 (SFLLRN и QYPGKF) на активность аденилатциклазы в мембранах сердца виноградной улитки

Заключение

В настоящей работе показано, что белки Epac участвуют в цАМФ-зависимом расслаблении сосудов. Их активация приводит к уменьшению силы сокращения изолированной аорты, вызываемого вазоконстрикторным нейротрансмиттером норадреналином или альфа1-адреномиметиком фенилэфрином. Однако вопрос о том, по какому механизму осуществляется их действие, остается открытым. Возможно, что белки Epac влияют на обмен ионов Са2+ в гладкомышечных клетках (ГМК). Эксперименты, в которых было показано ингибирование форсколином подъёма [Ca2+]цит в ГМК в ответ на серотонин, позволяют высказывать такое предположение. Нельзя исключить, что активация белков Epac запускает происходящие в эндотелиальных клетках процессы, приводящие к релаксации сосудов. Расслабление сосудов, вызванное активаторами белков Epac не превышает, как правило, 50-ти процентов. В отличие от этого, активация протеинкиназы А приводит к полному расслаблению изолированной аорты, предсокращенной норадреналином. Этот факт свидетельствует в пользу того, что цАМФ-зависимые механизмы расслабления аорты, опосредованные протеинкиназой А и белками Epac, принципиально различаются.

Эксперименты, выполненные на тромбоцитах, показали, что подавление в этих клетках Са-зависимого процесса АДФ-индуцироанной агрегации под влиянием цАМФ происходит без участия белков Epac. Очень важным следствием этих опытов стало доказательство специфичности действия аналога цАМФ, активирующего Epac.

На модели изолированного сердца виноградной улитки мы показали, что обе цитоплазматические мишени цАМФ - и протеинкиназа А, и белки Epac, регулируют сердечную сократимость. Оказалось, что в сердце виноградной улитки, в отличие от сердца млекопитающих, цАМФ не является основным фактором, вызывающим увеличение амплитуды сокращений сердца, а оказывает скорее модулирующее действие. Однако остается не ясным, почему, в отличие от активатора аденилатциклазы форсколина, который вызывает увеличение амплитуды сокращения сердца, ни активатор протеинкиназы А, ни активатор белков Epac сами по себе не вызывали увеличения амплитуды сокращений сердца. Можно предположить что для проявления активаторного действия цАМФ на сердце виноградной улитки необходимо, чтобы эти два механизма работали согласованно.

Нами обнаружены в сердце улитки серотониновые рецепторы. подобные 5НТ3-рецепторам млекопитающих. Эти рецепторы не сопряжены с аденилатциклазой и представляют из себя катионные каналы, проницаемые для ионов натрия и кальция. Активации ими сокращений сердца, по-видимому, обусловлена входом ионов кальция или деполяризацией плазматической мембраны за счет входа ионов натрия и активацией потенциалуправляемых кальциевых каналов. Можно предположить, что цАМФ, образующаяся при активации 5НТ-рецепторов серотонина, сопряженных с аденилатциклазой, потенциирует активность этих каналов, действуя через протеинкиназу А, аналогично тому, как активируются потенциалуправляемые кальциевые каналы в сердце млекопитающих. Основываясь на недавно опубликованных данных о взаимодействии белков Epac с протеинкиназой А и рианодиновыми рецепторами ретикулама в кардиомиоцитах мыши (Dodge-Kafka et al., 2005), можно предположить, что в сердце белки Epac каким-то образом активируют кальциевый обмен и таким образом усиливают сократимость. Выяснение этих вопросов требует дальнейших исследований.

Рис. 16. Предполагаемые механизмы регуляции сократимости сердца улитки

В данной работе описан цАМФ-независимый механизм активации сократимости сердца виноградной улитки под действием тромбина. Полученные данные говорят о том, что тромбин действует через активируемые протеазами рецепторы PAR1 и PAR4. Это первое свидетельство того, что рецепторы данного типа есть не только у млекопитающих, но и у представителей филогенетически отдаленного типа животных - моллюсков. Однако для полной уверенности в том, что такие рецепторы у улитки существуют, их необходимо клонировать. По-видимому, окончательное решение данного вопроса будет достигнуто после расшифровки генома данного представителя брюхоногих моллюсков.

Гипотетическая модель, описывающая возможные механизмы активации сердца виноградной улитки по цАМФ-зависимому и цАМФ-независимому механизмам, изображена на рис.16. Мы предполагаем, что наиболее вероятным путем действия тромбина является активация фосфолипазы С через белок Gq, тогда как серотонин запускает два других механизма - синтез цАМФ и открывание катионных каналов, транспортирующих кальций.

ВЫВОДЫ.

1. Расслабление аорты, вызванное цАМФ, опосредовано активацией протеинкиназы А и белков Epac. Одним из механизмов цАМФ-индуцированного расслабления аорты является подавление рецептор-опосредованного повышения концентрации ионов кальция в цитоплазме.

2. В отличие от сосудов, в тромбоцитах белки Epac не участвуют в проявлении действия цАМФ - подавлении АДФ-индуцированной агрегации. В данном эффекте цАМФ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов принимает участие только протеинкиназа А.

3. Аналоги цАМФ, избирательно активирующие протеинкиназу А и белки Epac, увеличивают амплитуду сокращения сердца виноградной улитки в ответ на серотонин. Это свидетельствует об участии обеих цитоплазматических мишеней цАМФ в регуляции сократимости сердца.

4. Активация сократимости сердца виноградной улитки H.pomatia, вызванная серотонином, опосредована разными видами 5НТ-рецепторов. Одни рецепторы сопряжены с аденилатциклазой и повышают уровень цАМФ. Второй вид рецепторов подобен 5НТ3-рецепторам млекопитающих и относится к типу ионотропных рецепторов.

5. Описан цАМФ-независимый механизм активации сократимости сердца виноградной улитки тромбином. Полученные данные свидетельствуют, что тромбин активирует в сердце улитки рецепторы, гомологичные активируемым протеазами рецепторам 1-го и 4-го типов млекопитающих.

Литература

1. Суханова И.Ф., Кожевникова Л.М., Попов Е.Г., Подмарева О.Н., Авдонин П.В. Активаторы белков Epac вызывают расслабление изолированной аорты крысы // Доклады Российской академии наук, 2006, том 411, №5, с.1-5.

2. Соломонова В.Г., Авдонин П.П., Виниченко Е.С., Суханова И.Ф., Авдонин П.В. Активация сократимости сердца виноградной улитки H. pomatia под действием тромбина. Исследование роли cAMP. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2007, том 43, с.32-38.

3. Бердышева Л.В., Суханова И.Ф., Соломонова В.Г., Авдонин П.В. Кинетика положительной инотропной реакции сердца виноградной улитки Helix pomatia на серотонин. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2007, в печати.

4. Суханова И.Ф., Подмарева О.Н., Кожевникова Л.М., Авдонин П.В. цАМФ подавляет вторую фазу эндотелий-зависимого расслабления крысиной аорты. // 13-ое международное совещание и 6-ая школа по эволюционной физиологии, СПб, 2006, с.24-25.

5. Berdysheva L.V., Solomonova V.G., Sukhanova I.F., Avdonin P.V. The kinetic parameters of positive ionotropic effect of serotonin in the heart of snail Helix pomatia. // Материалы Международной конференции по простым нервным системам, Казань, 2006, с.6.

6. Суханова И.Ф. Исследование роли ПКА и белков Epac в цАМФ - и карбахол-зависимом расслаблении сосудов. // Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им.Н.К. Кольцова РАН, 2005. Онтогенез 2006, т. 37, №4, с.319.

7. Суханова И.Ф. Независимые от протеинкиназы А механизмы регуляции сократимости сердца и кровеносных сосудов циклической АМФ. Роль белков Epac. // Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 2006. Онтогенез 2007, т. 38, №4, с.

Размещено на Allbest.ru