Размещено на http://www.allbest.ru/

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ РОДА HEDYSARUM

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Федорова Юлия Сергеевна

Самара 2011

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Кузнецов Петр Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Егорова Светлана Николаевна

кандидат химических наук, доцент Ткаченко Михаил Лукич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «___» ноября 2011 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан «____»____________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук,

доцент И.К. Петрухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Задачи по разработке и исследованию оригинальных фитопрепаратов из малоизученного растительного сырья, (к которому относятся и растения рода Hedysarum - копеечник, сем. Fabaceae), в настоящее время не теряют своей актуальности. Из 250 видов растения данного рода сегодня изучено не более 10, при этом химический состав копеечников весьма разнообразен и уникален. Он представлен различными аминокислотами, углеводами, фенольными соединениями (флавоноиды, изофлавоны, ксантоны, дубильные вещества и др.), эфирными маслами и т.д. (А.А.Семенов и соавт., 2004 г.).

В 80-е годы в ВИЛАР (СССР) был рекомендован к производству противовирусный препарат «Алпизарин», в состав которого входит ксантон мангиферин, выделенный из копеечника желтеющего. В настоящее время из некоторых видов копеечника (Н. neglectum, Н. theinum, Н. alpinum и др.) выпускаются биологически активные добавки: капли «Красный корень» (Россия, г.Бийск, «Эвалар»), таблетки «Копеечник - М» (Россия, г.Барнаул, «Алтай-Фарм»,) и др. Данные растения также входят в состав различных фитосборов («Бережник», «Фитопан М», Россия, г. Новосибирск) и др. К сожалению, данные средства выпускаются фирмами-производителями только в качестве биологически активных добавок и зачастую при их разработке не проводится исследование химического состава и фармакологической активности. Производители основываются на уже имеющихся литературных данных. Так как данные растения широко применяются в народной и официнальной медицине, исследования в этой области продолжают оставаться крайне актуальными и своевременными.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлся сравнительный фитохимический анализ ФП растений рода Hedysarum (H. theinum, H. neglectum, H. alpinum).

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработка оригинального метода получения ФП из некоторых видов растений рода копеечников (H. theinum, H. neglectum, H. alpinum).

2. Исследование полученных ФП копеечников химическими и физико-химическими методами анализа.

3. Проведение сравнительного исследования фармакологической активности полученных ФП из растений рода копеечник.

4. Определение наиболее важных групп веществ, ответственных за фармакологическую активность для стандартизации и видовой идентификации копеечников.

Научная новизна исследования.

По оригинальной авторской методике (патент РФ 2402344) получены ФП растений рода копеечник (H. theinum, H. neglectum, H. alpinum). Впервые проведено сравнительное изучение полученных ФП различными хроматографическими методами. Для жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) впервые наряду с широко используемым в химии природных соединений сефадексом LH-20 изучены хроматографические свойства перешитых сефарозных гелей (сефароза 4B-CL, сефароза 6B-CL) и некоторых азоадсорбентов аффинного типа на основе полисахаридных гелей. Проведено сравнительное изучение ФП копеечников методом газожидкостной хромато - масс - спектрометрией (ГЖХ-МС) и высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), впервые обнаружены и идентифицированы: группа фитостероидов, ряд ароматических и гетероциклических соединений (производные морфинана, пиридазина и др.) и ряд серосодержащих соединений (1,1-диметилтетрадецилгидросульфид и др.). Впервые проведен биохимический и фармакологический анализ данных ФП. Показано различное влияние на картину периферической крови и биохимических показателей крови крыс, а также наличие антиоксидантной активности. Впервые проведено сравнительное изучение антибактериальной и фармакологической активностей. фармакологический фитопрепарат растение копеечник

Практическая значимость. Разработана оптимальная методика получения ФП из растений рода копеечник, которая создает необходимые условия для серийного производства.

Проведенный анализ различными физико-химическими методами позволил выявить подробный химический состав ФП копеечников чайного, забытого и альпийского. Полученные данные могут быть использованы для видовой идентификации копеечников чайного и забытого, что до настоящего времени затруднено из-за отсутствия четких систематических морфологических признаков.

Выявленные биохимические и фармакологические эффекты позволяют дифференцировать данные ФП по действию на организм.

Запатентованный способ получения фитопрепаратов из некоторых видов копеечников (патент РФ 2402344) внедрен в работу лаборатории фитофармакологии Научно-исследовательского института фармакологии со РАМН, г. Томск (Акт внедрения от 13.01.2010г.). Результаты по антибактериальной активности внедрены в научно-исследовательскую работу МЛПУ «Детская городская больница №1», г. Томск (Акт внедрения от 12.01.2010г.). Полученные фитопрепараты из корней копеечников чайного и забытого используются в научной и учебной работе ЦНИЛ и кафедры фармацевтической и токсикологической химии ГОУ ВПО Кемеровской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию при хроматографическом изучении новых эпоксиазоадсорбентов аффинного типа (Акт внедрения от 14.01.2010г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Особенности получения ФП из растений рода копеечник (H. theinum, H. neglectum, H. alpinum).

2. Результаты исследования химическими и физико-химическими методами качественного и количественного состава ФП.

3. Особенности фармакологической активности ФП.

4. Методология стандартизации и видовой идентификации копеечников.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа была выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Кемеровской государственной медицинской академии (№ Государственной регистрации 0120.0 506552)

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии профилактики, диагностики и лечения основных заболеваний человека» (Ленинск-Кузнецкий, 2009); межрегиональной научно-практической конференции «Фармацевтическая наука, образование и практика: реалии и перспективы развития» (Тюмень, 2009); межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 2009, 2010); межрегиональной научно-практической конференции «Инновационные образовательные программы - условия повышения качества подготовки современных специалистов в системе СПО» (Томск, 2010); международной научно-практической конференции «Природные и интеллектуальные ресурсы Сибири» (Кемерово, 2010); всероссийской научно-практической конференции «Создание лекарственных средств на основе продуктов природного происхождения» (Пермь, 2010).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 18 работ, в том числе в рекомендуемых ВАК журналах - 5 работ, получен патент РФ 2402344.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объектам и методикам исследований, 3-х глав собственных исследований, выводов, а также списка литературы, включающего 234 наименований, в т.ч. 94 источника иностранных авторов. Работа изложена на 179 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц и 63 рисунка.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований растений рода Hedysarum, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологической активности и применению в медицинской практике данных растений.

В главе 2 представлена характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики химического, физико-химического и фармакологического изучения ФП копеечников (H. alpinum, H. neglectum. H. theinum).

В главе 3 экспериментальной части приведен способ получения ФП из некоторых видов растений рода Hedysarum.

В главах 4, 5 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по сравнительному изучению химического состава и фармакологической активности ФП из некоторых видов растений рода Hedysarum.

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах и на рисунках, которые приведены в тексте диссертации. В приложения вынесены хроматограммы ВЭЖХ, ИК - спектры.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования были выбраны ранее малоизученные виды копеечника - чайный (H. theinum), забытый (H. neglectum), а также альпийский (H. alpinum).

Способ получения ФП: 30г. измельченного растительного сырья корней копеечника забытого, копеечника чайного или травы копеечника альпийского обрабатывали в три этапа водно-спиртовым раствором с различной концентрацией спирта, при периодическом встряхивании при комнатной температуре в затемнённом месте.

Химические и физико-химические методы исследования

Для разделения и выделения БАВ из водно-спиртовых извлечений копеечников чайного, забытого и альпийского применялся метод ЖКХ. Исследование ФП проводили в режиме гельпроникающей хроматографии на хроматографической колонке («Pharmacia», Швеция) в различных режимах элюции. В качестве сорбентов использовали ряд полисахаридных гелей (сефароза 4B-CL, сефароза 6B-CL, сефадекс LH-20) и некоторые их эпоксимодифицированные аналоги (сефароза CL-4-БЭП п-нитрогидразид-фтивазид, сефадекс LH-20-БЭП-гСК-пНАН). Режимы элюции: режим А -элюент - 0,01М NaOH; режим Б - H₂O, C₂H₅OH / H₂O (1:1), 0,01М NaOH; режим В - H₂O, C₂H₅OH / H₂O (1:1), 0,01М NaOH, насыщенный раствор Na₂B₄O₇, 0,1н NaOH.

Обнаружение БАВ в ФП копеечников методом ВЭЖХ проводили на приборе системы Альянс («Waters») с детектором с фотодиодной матрицей на колонке Aliance C18. Хроматографическая идентификация найденных БАВ проводилась с образцами свидетелей.

Обнаружение БАВ в ФП копеечников методом ГЖХ-МС проводили на приборе: хромато-масс-спектрометр Finnigan Trace DSQ (США), колонка TR-ms, газ - носитель гелий (скорость потока 5м/мин.).

Изучение ФП методом ИК-спектроскопии осуществлялось на приборе Excalibur (FTS 3500 GX) с детектором из дейтерированного триглицинсульфата (DTGS). Диапазон 400-4000см^-1.

Для исследования ФП методом тонкослойной хроматографии использовались пластины «Сорбфил» (ЗАО Сорбполимер, г.Краснодар), применялись системы растворителей: n-бутанол--этанол--вода (13:7:2); хлороформ--метанол--вода (13:7:2).

Реакции фитохимического скрининга проводили известными способами (Н.И. Гринкевич, 1983г.). Реактивы имели квалификацию «х.ч.» и «ч.д.а.».

Количественное определение дубильных веществ осуществляли методом перманганатометрии (ГФ ХI).

Фармакологические методы исследования

Эксперимент выполнен на 30 беспородных крысах - самках (массой 250-300г). Животные содержались в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Животных содержали в стандартных климатических условиях на стандартном рационе питания. Опыт проводили в весенний период. Животные были разделены на 4 группы: группа №1 - контрольная; группа №2 - получала ФП H. theinum, группа №3 - ФП H. neglectum, группа №4 - ФП H. alpinum. Крысам ежедневно вводили в желудок через зонд ФП в дозе 200мг/кг массы тела животного в течение 30 дней. Контрольной группе водили по 2 мл воды очищенной. Подготовка ФП - рассчитанную дозу сухого экстракта разводили в требуемом количестве воды очищенной.

Исследование влияния ФП копеечников на картину периферической крови опытных крыс проводили стандартными методами (Ю.Ю. Елисеев, 2007г.). Показатели картины периферической крови также были исследованы на анализаторе ABX MICROS 60 (Horiba ABX, Франция). Анализ биохимических показателей крови опытных крыс выполняли в сыворотке и плазме крови унифицированным колориметрическим методом на приборе производства ООО «Ольвекс Диагностикум». ТУ 9398-019-44276594-2004, серия 11082009. Интенсивность окраски и оптической плотности реакционной среды определяется фотометрическим методом на биохимическом полуавтоматическом анализаторе Stat Fax 1904.

Изучение влияния ФП копеечников на работоспособность, ориентировочно-исследовательское поведение, эмоциональную реакцию опытных крыс, а также на формирование условного рефлекса активного избегания (УРАИ) у опытных крыс проводилось стандартными методами (J.V. Brady, W.J.H. Nauta, 1953г; Р.У. Хабриев, 2005г.).

При изучении антимикробной активности ФП копеечников использовали классические микробиологические методы (В.А. Галынкин, В.И. Кочеровец, 2003г.) Определение антибиотикочувствительности проводили стандартизированным диско-диффузионным методом (С.В. Сидоренко, В.Е. Колупаев, 1999г.). В качестве тест-культур микроорганизмов для определения антимикробной активность были выбраны грамположительные бактерии (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis) и грамотрицательные (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli), в соответствии с рекомендациями ГФ ХI.

Антиоксидантную активность исследуемых ФП оценивали по степени ингибирования образования малонового диальдегида (МДА) (Ю.А. Владимиров, И.М. Арчаков, 1972г.).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ фирмы «Stat soft 8,0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Способ получения фитопрепаратов и его перспективы

Способ получения ФП из копеечников представлен на схеме (рис. 1).

Экстрагент H2O / C2H5OH 95% (2:1)		Экстрагент H2O / C2H5OH 95% (1:1)		Экстрагент H2O / C2H5OH 95% (1:2)

Растительное сырье		Остаток		Остаток

Слив I фракция		Слив II фракция		Слив III фракция		Шрот

Фитопрепарат

Рис. 1 Схема получения ФП из копеечников

В настоящее время все существующие ФП из корней копеечника забытого (H. neglectum) и копеечника чайного (H. theinum) обладают различным количественным и качественным составом, отличаются фармакологическими свойствами и эффектом лечебного применения. Это объясняется использованием различных методов получения ФП.

Задачей работы являлась разработка технологического метода, при использовании которого возможно получение ФП в нативном виде с более высоким суммарным содержанием БАВ, что, как правило, приводит к усилению фармакологического эффекта.

Предложенный нами метод получения ФП основан на изменяющейся полярности используемых экстрагентов. Основной принцип - исчерпывающая экстракция растворителем. В итоге ФП образуется при сливании всех трёх фракций. Полученные ФП представляют собой прозрачные растворы красно-коричневого цвета с приятным вкусом и запахом, с количественным содержанием экстрактивных веществ от 1,7% до 4,8%, ФП травы копеечника альпийского получен аналогично.

2. Изучение состава фитопрепаратов химическими и физико - химически- ми методами анализа

2.1. Фитохимический скрининг

Полученные экспериментальные данные по общему фитохимическому скринингу исследуемых фитопрепаратов показали, что ключевым типом биологически активных веществ являются конденсированные танины (положительная желатиновая проба, реакции с 1% раствором ванилина и др.). Также показано наличие других фенольных соединений: ксантонов, флавоноидов (реакция с берлинской лазурью, борной и щавелевой кислотами, цианидиновая проба). По результатам фитохимического анализа ключевых пиковых фракций (I и III) фитопрепаратов после хроматографирования на Sepharose CL-4В, можно предположить наличие в I ключевом пике полисахаридов (реакции в-нафтолсерной кислотой, Cu(OH)₂ и др.), а в III ключевом пике - конденсированных танинов (реакция с FeCI₃ и др.). Фракции третьего пика давали слабую положительную реакцию с 1% раствором желатины.

2.2 Количественное определение дубильных веществ в фитопрепаратах копеечников

В таблице 1 приведены данные количественного содержания дубильных веществ в ФП копеечников (H. theinum, H. neglectum, H. alpinum), в качестве препарата сравнения - капли «Красный корень» (Россия, г. Бийск).

Таблица 1

Количественное содержание дубильных веществ в исследуемых ФП

Фитопрепарат	Vср. KMnO4, мл	С %
Фитопрепарат корней H. neglectum	14,0	1,0
Фитопрепарат корней H. theinum	14,2	1,014
Фитопрепарат травы H. alpinum	7,5	0,54
Капли «Красный корень» (Россия, г.Бийск)	17,3	1,24
1% раствор танина*	14,0	1,0

1% раствор танина * - контроль

Таким образом, результаты количественного определения дубильных веществ подтверждают данные фитохимического скрининга.

2.3 Выделение биологически активных веществ методом жидкостной колоночной хроматографией

Для выделения БАВ из ФП растений рода Hedysarum методом ЖКХ в качестве сорбентов использовали полисахаридные гели (Sephadex LH-20, Sepharose 4B-CL, Sepharose 6B-CL и их химически модифицированные аналоги). Использование эпоксимодифицированных гелей показало, что они являются универсальными, так как имеют все основные сорбционные зоны (гель-фильтрационную, распределительную и сорбционную). Таким образом, данные исследования в этой области крайне актуальны.

При хроматографическом разделении ФП копеечников на эпоксимодифицированных агарозных гелях (Sepharose 4B-CL, Sepharose 6B-CL) нами было опробовано несколько режимов элюции. В хроматографическом режиме А вещества ФП копеечников чайного и забытого на группы конденсированных танинов выходят фактически одним пиком. В режиме Б их удалось частично разделить (рис.2).

Рис. 2 Хроматографическое разделение БАВ ФП копеечников на Sepharose CL-4В (режим Б)

УФ-спектры ключевых пиковых фракций ФП копеечников чайного и забытого однотипны, имеют относительно слабые полосы поглощения в зоне л 265-280 нм и совпадают с литературными данными по УФ-спектрам конденсированных танинов.

Режим Б оказался также наиболее оптимальным и при разделении фенольных веществ ФП травы копеечника альпийского. УФ-спектры его ключевых пиковых фракций имели полосы поглощения в зоне 220-240 нм.

Тем не менее оказалось, что применение систем элюентов А и Б не позволяло выделить около 15% сорбировавшихся БАВ ФП корней копеечников чайного и забытого, однако при применении перешитого полисахаридного сорбента Sepharose CL-4B сохранялась нативность элюатов.

В продолжение сравнительного изучения химического состава ФП копеечников чайного и забытого нами в режиме гельпроникающей хроматографии на Sepharose CL-4В в условиях градиентного элюирования (режим В) показано наличие 5-6 пиков ключевых и минорных компонентов (рис. 3). Полученные пиковые фракции (зона 13 - 19 фракций) давали фитохимические реакции на группу конденсированных танинов.

Рис. 3 Хроматографическое разделение БАВ ФП корней копеечников чайного и забытого (режим В)

Таким образом, в режиме В получен удовлетворительный результат, так как ФП копеечников удалось нацело сконцентрировать мощным пиком насыщенным раствором натрия тетрабората (рН=9,2).

Сравнительное хроматографическое разделение ФП корней копеечника забытого на сорбентах Sepharose CL-4В и Sepharose CL-6В в условиях режима Б, показано на рисунке 4.

Рис. 4 Хроматографическое разделение БАВ ФП корней копеечника забытого на сорбентах Sepharose CL-4В, Sepharose CL-6В

Полученные хроматографические данные свидетельствуют о несущественных хроматографических изменениях при выделении БАВ, в зависимости от использованния сефарозных сорбентов. Аналогичные данные были получены при разделении фитопрепарата копеечника чайного.

Для разделения ФП копеечников забытого и чайного также был опробован химически модифицированный аналог сефарозы: Sepharose CL-4-БЭП п-НБГ-ФТИВАЗИД. В результате хроматографирования (режим В) были получены три четких пика (рис. 5).

Рис. 5 Хроматографическое разделение БАВ ФП корней копеечника забытого на сорбенте Sepharose CL-4-БЭП п - НБГ-фтивазид

Аналогичное разделение было отмечено и при хроматографировании ФП копеечника чайного.

Таким образом, полученные данные доказали эффективность использования Sepharose CL-4В и его химически модифицированного аналога в качестве носителей для ЖКХ при хроматографическом разделении ФП копеечников.

Исследование сорбента Sephadex LH-20 и его эпоксиазоаналога (Sephadex LH-20- БЭП-гСК-пНАН) для хроматографирования изучаемых ФП в режиме Б, показало наличие трех ключевых пиковых фракций и несколько пиков минорных компонентов. Однако, при хроматографировании фракций, составляющих исходный ФП, отмечена необратимая сорбция при использовании данной системы элюентов (около 15%). Интересно, что полученные пиковые фракции (зона 12 - 16 фракций) не давали основных фитохимический реакций (реакция с FeCI₃, 1% раствором желатины). Применением элюэнта натрия тетрабората (режим В) при хроматографировании ФП на Sephadex LH-20 и его эпоксиазоаналоге, удалось получить вполне удовлетворительный результат (см. рис. 6).

Рис. 6 Хроматографическое разделение БАВ ФП корней копеечника забытого на Sephadex LH-20 и Sephadex LH-20 БЭП ГСК n-НАН

Интересно, что элюат фракции 13 (пиковая фракция, режим В) давал с реактивом FeCI₃ лишь красновато-желтую окраску (исходный ФП моментально давал черно-зеленое окрашивание), причем желатиновая проба оказалась отрицательной. Объяснить наблюдаемые феномены можно тем, что элюент раствор натрия тетрабората эффективно видоизменяет исходную нативную структуру исследуемых ФП корней копеечников (H. neglectum, H. theinum), возможно по принципу супрамолекулярного взаимодействия, или образует неизученный боратный комплекс с ключевым типом БАВ (конденсированными танинами).

Таким образом, проведенное нами исследование доказало эффективность использования не только широко известных полисахаридных гелей, но и их химически модифицированных аналогов в качестве носителей для ЖКХ водно-спиртовых извлечений, полученных из растений вида Hedysarum.

При изучении ФП методом тонкослойной хроматографии показано наличие в них как высокомолекулярных полифенолов (R_f < 0,3), так и низкомолекулярных соединений фенольного характера (R_f > 0,3).

2.4 Исследование фитопрепаратов из растений рода копеечник методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрии

В условиях проведенного анализа получены нижеприведенные данные по составу летучих компонентов исходных ФП из растений рода копеечник, а также их составных фракций.

Так, нами впервые найдена в копеечнике забытом группа фитостероидов (эстра-1,3,5(10)-триен-17-в-ол, андрост-5,7-диен-3-ол-17-он и др.). Данная группа биологически активных веществ (в меньших количествах) также обнаружена в копеечнике чайном (рис. 7).

а) б)

Рис. 7 а) эстра-1,3,5(10)-триен-17-в-ол б) андрост-5,7-диен-3-ол-17-он

В составе ФП корней копеечника забытого, в отличие от ФП корней копеечника чайного, наряду с фитостероидами обнаружен антиэстрогенный компонент (рис. 8).

Рис. 8 антиэргоста-5,7,9-триен-3-он

Интересно, что в копеечнике альпийском БАВ из группы фитостероидов не обнаружены.

Данные анализа показали также наличие производных морфинана только в ФП корней копеечника чайного (рис. 9)

Рис. 9 6-[7-нитробензофуразан-4-ил]амино-морфинан-4,5-эпокси-3,6-ди-ол

В ФП травы копеечника альпийского содержится наибольшее количество эфиров карбоновых кислот, производных пирана, порфирина (рис.10, 11).

Рис. 10 2-(12-пентадецинилокси)тетрагидро-2Н-пиран



Рис. 11 5-[4-(карбоксиадамантил-3)-фенил]010,15,20-трифенил-21Н,23Н-порфин

Впервые для рода Hedysarum был обнаружен ряд производных фталевой кислоты: бутилундецилфталат (H. theinum), бутилтетрадецилфталат, моно(2-этилгексил)фталат (H. neglectum), диизооктилфталат, дибутилфталат (H. alpinum).

Данным методом также был изучен состав летучих компонентов, выделенных методом ЖКХ, пиковых фракций ФП корней копеечников чайного и забытого.

Интересно, что I, II и III ключевые пики исследуемых ФП, кроме II пика фитопрепарата копеечника забытого (летучих компонентов не обнаружено), показывают наличие только алифатических соединений (2,6,10-триметилтетрадекан, гексадеканол-2 и др.). Остальные фракции, включая минорные наряду с алифатическими, содержат группу ароматических соединений - производные нафталина, фенантрена и др.. На наш взгляд, наличие в достаточно большом количестве в ФП H. theinum и H. neglectum 4а-метил-1-метилен-1,2,3,4,4а,9,10,10а-октагидрофенантрена, позволяет считать его основным реперным компонентом для данных видов копеечника. (рис. 12. а).



а) б) в)

Рис. 12 а) 4а-метил-1-метилен-1,2,3,4,4а,9,10,10а-октагидрофенантрен; б) 1,1-диметилтетрадецилгидросульфид; в) 2,7-дифенил-1,6-диоксопирадазино[4,5:2^?,3?]пирроло[4?,5?-d]пиридазин

Интересно, что в V минорном пике ФП H. neglectum содержится серосодержащее производное - 1,1-диметилтетрадецилгидросульфид (рис 12. б), обнаруженное нами впервые среди БАВ копеечников. В VI минорном пике ФП H. theinum впервые найдено необычной структуры азотсодержащее соединение (рис. 12. в). Наконец, производные фитостероидов обнаружены в VI пике ФП H. theinum (производное андрогенов), в V пике ФП H. neglectum (производное эстрогенов). Только в V минорном пике ФП обнаружены некоторые витамины: H. theinum - ретиналь, H. neglectum - 24, 25-дигидроксихолекальциферол. Таким образом, наши исследования доказали важность и перспективность изучения летучих компонентов ФП копеечников (впервые обнаружено значительное количество групп природных соединений в растениях данного рода).

2.5 Исследование фитопрепаратов копеечников методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Предварительное исследование суммарных ФП корней копеечников чайного и забытого данным методом показало близость их хроматографических профилей (рис. 13).



а) б)

Рис. 13 а) хроматографический профиль ФП корней H. theinum; б) хроматографический профиль ФП корней H.neglectum

Однако хроматографический профиль ФП травы копеечника альпийского, полученный данным методом, значительно отличался (рис. 14).

Рис. 14 Хроматографический профиль ФП травы Н. alpinum

В составе исследуемых ФП копеечников методом ВЭЖХ обнаружены следующие типы БАВ: жирные и оксикоричные кислоты, ксантоны, флавоноиды (табл. 2). Состав жирных кислот ФП существенно отличается. Так, в ФП корней H. theinum отмечено отсутствие капроновой и лауриновой кислот, в ФПе корней H.neglectum - каприновой и г-линоленовой кислот, в ФП травы Н. alpinum найдено наименьшее количество жирных кислот, при этом отсутствуют: капроновая, лауриновая, гадолеиновая и пальмитолеиновая кислоты. Поэтому вполне можно считать, что отсутствие вышеуказанных жирных кислот в копеечнике альпийском и наличие в копеечниках чайном и забытом, является их дифференцирующим признаком, а данные кислоты, на наш взгляд, можно отнести к реперным БАВ. Интересно, что только в ФП корней H.neglectum содержится одна реперная оксикоричная кислота - хлорогеновая (табл. 2).

Таблица 2

Содержание БАВ в исследуемых ФП копеечников чайного, забытого и альпийского

Идентифицированные соединения	С, мг/100мл
	Hedysarum theinum	Hedysarum neglectum	Hedysarum alpinum
Оксибензойные кислоты
1. Галловая кислота	0,264	0,28	0,12
Оксикоричные кислоты
1. Цикоревая кислота	0,042	0,06	-
2. Кофейная кислота	0,091	0,1	-
3. Хлорогеновая кислота	0,34	0,12	0,94
4. Неохлорогеновая кислота	0,017	-	-
Флавоноиды
1. Гиперозид	0,25	-	13,4
2. Рутин	-	-	6,1
3. Кверцетин	-	-	0,79
Изофлавоны
1. Даидзеин	0,25	-	-
Флаван-3-олы
1. Эпигалокатехин	5,91	3,36	-
2. Катехин	2,14	2,46	-
3. Эпикатехин	6,53	4,73	-

В составе ФП копеечников чайного, забытого и альпийского также обнаружена группа ксантонов - мангиферин и изомангиферин. В качестве стандартного образца был применен мангиферин, выделенный методом ЖКХ на сорбенте Sephadex LH-20 (рис. 15 а) из спиртового раствора препарата «алпизарин» (Россия, ВИЛАР).



а) б)

Рис. 15 а) Хроматографический профиль выделенных ксантонов методом ЖКХ на Sephadex LH-20 (режим А)

б) Спектр мангиферина - стандарта

В дальнейшем выделенные ксантоны были идентифицированы методом ВЭЖХ (рис. 15 б).

Полученный образец мангиферина - стандарта использован нами при исследовании этой группы БАВ ФП копеечников. Показано, что ФП корней копеечников H. theinum и H. neglectum имеют лишь минорные концентрации ксантона мангиферина (рис. 16 а), в отличие от ФП травы Н. alpinum, в котором он представлен основным пиком (рис. 16 б). Наряду с мангиферином, в ФП травы Н. alpinum обнаружено его производное - изомангиферин. Изомангиферин в ФП H. theinum и H.neglectum не обнаружен. Таким образом, показано, что ФП корней копеечников чайного и забытого имеют лишь минорные концентрации мангиферина, в отличие от ФП травы копеечника альпийского, в котором он представлен основным пиком. Мангиферин в корнях копеечников чайного и забытого обнаружен впервые.



а) б)

Рис. 16 а) Хроматограмма ФП корней копеечника чайного (минорный пик мангиферина в зоне 11,764 min) б) Хроматограмма ФП травы копеечника альпийского (основной пик мангиферина в зоне 11,024 min)

Интересно, что разделение на виды H. theinum и H. neglectum на сегодня затруднено, из-за отсутствия четких систематических морфологических признаков, так как в природных популяциях одновременно встречаются особи с бурым (красным), белым и розовым корнями (бурый корень - это основной диагностический признак, характерный для H. theinum). Для видовой идентификации данных растений применяется трудоемкий метод SDS-электрофореза (В.Г. Конарев, 1993г.).

Таким образом, найденные отличия химического состава изученных нами ФП могут быть рекомендованы для видовой дифференциации H. theinum и H. neglectum. Так, наличие неохлорогеновой, хлорогеновой, цикоревой и кофейной, оксикоричных кислот, а также флавоноидов: дандзина и гиперозида и ряда жирных кислот (кроме капроновой и лауриновой), свойственно только для копеечника чайного. Копеечник забытый, напротив, характеризуется присутствием только одной хлорогеновой кислоты и отсутствием жирных кислот - каприновой и г-линоленовой.

2.6 Перспективы стандартизации фитопрепаратов корней копеечников чайного и забытого

Полученные ФП корней копеечников чайного и забытого при дальнейшей разработке аспектов стандартизации их качества могут быть внедрены в перечень официальных лекарственных средств. Поэтому, из вышеизложенных химических и физико-химических данных, с определенной перспективой могут быть связаны ряд фитохимических реакций, позволяющих определять ключевые типы БАВ (реакции с FeCI₃ в кислой среде, желатиновая проба, реакции на группу полисахаридов и др.). Другим аспектом стандартизации ФП могут являться данные по ВЭЖХ и ГЖХ-МС (ФП копеечников отличаются по составу жирных, оксикоричных кислот и др.). Наконец, для стандартизации ФП копеечников чайного и забытого, безусловно, интересны ИК-спектры. Оказалось, что ИК-спектры ФП корней копеечников чайного и забытого практически идентичны (рис. 17)

Рис. 17 ИК-спектр ФП корней копеечника забытого

Таким образом, в дальнейшем, при получении промышленных образцов изученных ФП копеечников, предложенные нами аналитические принципы могут составить основу при разработке научной документации по качеству данных лекарственных средств.

3. Фармакологическая активность фитопрепаратов копеечников

3.1. Влияние фитопрепаратов копеечников на эмоциональную реакцию крыс

Эмоциональная реакция опытных крыс оценивалась по методу Brady & Nauta, результаты суммарной активности приведены на рисунке 18.

Рис. 18 Влияние ФП копеечников на эмоциональную реакцию опытных крыс

* - достоверные отличия данных по сравнению с контролем при Рt < 0,05

ФП копеечников альпийского и чайного, в отличие от ФП копеечника забытого, вызывают снижение эмоциональной реакции.

3.2 Влияние фитопрепаратов на ориентировочно-исследовательское поведение крыс

По результатам теста открытого поля отмечено усиление горизонтальной активности и норкового рефлекса у подопытных животных, что может говорить о наличии умеренных психостимулирующих свойств копеечников, более выраженных у копеечника альпийского. Вместе с тем нужно отметить отсутствие четких системных закономерностей, это говорит о том, что действие ФП копеечников на ориентировочно-исследовательское поведение в тесте открытого поля не имеет специфического действия и носит косвенный характер.

3.3 Тест вынужденного плавания крыс в сосуде со свободновращающимися колесами

После введения ФП копеечника альпийского у крыс наблюдалось снижение активности, это выражалось в уменьшении числа оборотов колес за 10 мин. наблюдения в 1,64 раза. ФП копеечника чайного также достоверно снижал активность крыс, уменьшая число оборотов колес в 1,47 раза. ФП копеечника забытого не имел достоверных отличий от контроля.

Таким образом, можно предположить, что ФП копеечников альпийского и чайного, в отличие от ФП копеечника забытого, обладают умеренным седативным действием в условиях методики вынужденного плавания в бассейне с колесами.

3.4 Влияние фитопрепаратов копеечников на выработку условного рефлекса активного избегания

По результатам тестирования, крысы контрольной группы достигли критерия обучения на первом этапе эксперимента и воспроизводили полученный результат на второй этапе (рис. 19).

Рис. 19 Результаты обучения контрольных крыс условному рефлексу активного избегания

После введения ФП копеечника альпийского на первом этапе эксперимента у животных было отмечено наличие выработки УРАИ. Во втором этапе побежек рефлекс не вырабатывался (рис. 20). Это говорит о том, что данный ФП приводит к позитивной динамике в процессе обучения, но не оказывает влияние на формирование долгосрочной памяти животных на модели УРАИ.

Рис. 20 Влияние ФП копеечника альпийского на обучение крыс условному рефлексу активного избегания

На фоне введения ФП копеечника забытого у животных, способность к выработке УРАИ была значительно ниже, чем в контрольной группе. Проведенное исследование показало, что крысы не избегали электроболевого раздражителя, а переходили в безопасный отсек сразу после получения удара током (рис. 21).

Рис. 21 Влияние ФП копеечника забытого на обучение крыс условному рефлексу активного избегания

После введения фитопрепарата копеечника чайного отмечено снижение порога чувствительности животных. Крысы не избегали электроболевого раздражителя, также наблюдалось увеличение латентности перехода в темный отсек (рис. 22). Этот эффект связан с изменением восприятия и оценки психотравмирующей ситуации и является одним из проявлений транквилизирующего действия.



Рис. 22 Влияние ФП копеечника чайного на обучение крыс условному рефлексу активного избегания

У крыс подопытных групп на фоне ФП копеечников чайного и забытого наряду с торможением выработки УРАИ также было отмечено снижение количества межсигнальных реакций.

Полученные результаты тестирования указывают на то, что снижение активности в системе достижения цели при действии ФП копеечников чайного и забытого, сопровождается снижением уровня невротического сопротивления. Нарушение функции прогнозирования при выработке рефлекса в группах, принимающих ФП копеечников чайного и забытого, возможно связано с отрицательным влиянием на дофаминэргическую систему мозга, без нарушения самого инструментального рефлекса.

3.5 Влияние фитопрепаратов копеечников на картину периферической крови крыс

По результатам эксперимента ФП копеечника чайного вызывал достоверное увеличение гранулоцитов, что свидетельствует о наличии гемостимулирующего действия. ФП копеечников забытого и альпийского существенного изменения показателей картины периферической крови животных не вызывали.

3.6 Влияние фитопрепаратов копеечников на биохимические показатели крови крыс

Результаты исследования показали различное влияние ФП копеечников на биохимические показатели крови опытных крыс. Повышение уровня активности щелочной фосфатазы под влиянием ФП копеечника альпийского может быть результатом участия костной ткани в регуляции гемостатического потенциала крови животных. Снижение креатинфосфокиназы сердечной фракции МВ, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы свидетельствует о положительном действии ФП копеечника забытого на энергетический обмен и стабилизацию мембран клеток, в том числе и кардиомиоцитов (В.В. Дунаев, 2002г.).

Тимоловая проба показала отсутствие токсического влияния ФП копеечников на клетки печени (значения <4,0).

3.7 Антиоксидантная активность

Анализ представленных данных позволяет говорить о наличии антиоксидантной активности у всех исследуемых ФП (рис. 23). Наибольшая антиоксидантная активность отмечена у ФП травы копеечника альпийского - 83%.

Рис. 23 Сравнительная характеристика антиоксидантной активности ФП копеечников

Таким образом, исследованные ФП копеечников можно рассматривать как лекарственные средства с очевидной антиоксидантной активностью неферментного характера. Учитывая наличие высокой антиоксидантной активности, данные ФП являются перспективными для лечения воспалительных заболеваний, профилактики старения и развития опухолевых заболеваний.

3.8 Антибактериальная активность фитопрепаратов копеечников

По результатам эксперимента наиболее высокую активность проявил фитопрепарат H. neglectum, а наименьшую - фитопрепарат H. alpinum (табл. 3).

Таблица 3

Результаты влияния ФП копеечников на рост микроорганизмов

Фитопрепарат	Тест - культура
	P. aeruginosa	K. pneumonia	S. aureus	S. epidermidis	E. faecalis	E. coli
H. neglectum	-	-	-	-	+	-
H. theinum	-	±	-	-	+	±
H. alpinum	-	+	+	+	+	+
30% этанол*	+	+	+	+	+	+

(+) - рост микроорганизма; (-) - отсутствие роста; (±) - задержка роста; *- контроль

Таким образом, найденные антимикробные эффекты фитопрепаратов, обуславливаются не только присутствием группы флавоноидов в растениях рода Hedysarum, но и наличием конденсированных танинов. Низкая антибактериальная активность фитопрепарата копеечника альпийского, возможно объясняется практическим отсутствием группы дубильных веществ.

ВЫВОДЫ

1. На основании анализа литературных данных и результатов собственных исследований по определению химического состава и фармакологической активности растений рода Hedysarum (H. theinum, H. neglectum, H. alpinum) разработан новый авторский способ получения ФП из данных растений, позволяющий повысить количественное содержание БАВ в целевом продукте, что приводит к усилению фармакологической активности.

2. Проведено сравнительное изучение особенностей выделения БАВ копеечников на полисахаридных гелях (Sepharose 4В-CL, Sepharose 6В-CL, Sephadex LH-20), в том числе и химически модифицированных по принципу аффинного типа.

3. В растениях рода Hedysarum впервые обнаружены: фитостероиды, производные пирана, пиридазина, морфинана, фталевой кислоты, азулена, порфирина и его аналогов и ряд других соединений. Определена ключевая группа БАВ копеечников чайного и забытого - конденсированные танины, в ФП копеечника альпийского данная группа веществ не обнаружена.

4. Установлены важнейшие различия в химическом составе (жирные, оксикоричные кислоты, флавоноиды и др.), которые позволяют осуществлять видовую идентификацию копеечников чайного и забытого.

5. Проведено сравнительное исследование антибактериальной активности. Показано, что максимальную активность имеет ФП корней копеечника забытого, а наименьшую - ФП травы копеечника альпийского.

6. Выявлено различное действие ФП копеечников на биохимические показатели крови животных, установлено гемостимулирующее действие ФП копеечника чайного, а также показана специфика проявления антиоксидантной активности ФП.

7. Установлено различное влияние ФП копеечников на эмоциональную реакцию, работоспособность, ориентировочно-исследовательское поведение животных. Выявлено умеренное депримирующее действие ФП копеечников чайного и забытого.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Кузнецов, П.В. Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ ХХVII. К феномену хроматографического разделения фитопрепаратов копеечника забытого на сефадексе LH-20 и его химически модифицированном аналоге / П.В. Кузнецов, Ю.С. Фёдорова // Ползуновский вестник. 2009. № 3. С. 338-340.

2) Федорова, Ю.С. К феномену сравнительного изучения методом ВЭЖХ некоторых типов биологически активных веществ в фитопрепаратах копеечников H. neglectum, H. theinum, H. alpinum / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов, А.С. Сухих, К.М. Минаев // Ползуновский вестник. 2010. №3. С.215-217.

3) Федорова, Ю.С. Сравнительный анализ методом газожидкостной масс-спектрометрии летучих компонентов фитопрепаратов из трех видов копеечника (H. neglectum, H. theinum, H. alpinum) / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов, А.С. Сухих // Ползуновский вестник. 2010. №3. С.213-215.

4) Федорова Ю.С., Кузнецов П.В., Сухих А.С., Карелина О.А., Герасимова Р.Н. Сравнительная оценка антибактериальной активности фитопрепаратов из некоторых видов растений рода Hedysarum (сем. Fabaceae) / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов, А.С. Сухих, О.А. Карелина, Р.Н. Герасимова // Фундаментальные исследования. 2011. №3. С.210-214.

5) Федорова Ю.С., Сухих А.С., Кузнецов П.В. Сравнительный хроматографический анализ фракционного состава фитопрепаратов растений рода копеечник / Сорбционные и хроматографические процессы. 2011. Т. 11. Вып. 4, С.575-580.

6) Федорова, Ю.С. К сравнительной оценке биологически активных веществ некоторых видов копеечника методом газожидкостной масс-спектрометрии / Ю.С. Федорова, П.В.Кузнецов // Материалы докладов межрегиональной научно-практической конференции. Тюмень, ТюмГМА, 2009. С. 241-244.

7) Федорова, Ю.С. К проблеме сравнительного изучения некоторых фитопрепаратов рода Hedysarum / Ю.С. Федорова // Тез. докл. Всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии профилактики, диагностики и лечения основных заболеваний человека». Ленинск-Кузнецкий, 2009. С. 245.

8) Кузнецов, П.В. К проблеме стандартизации качества некоторых фитопрепаратов из различных видов копеечника (Hedysarum; сем. Fabaceae) / П.В. Кузнецов, Ю.С. Федорова, А.С. Сухих // Вестник Российской Академии естественных наук (ЗСО). Вып. 11, 2009. С. 185-189.

9) Фёдорова, Ю.С. О сравнительной оценке микробиологической активности фитопрепаратов из некоторых видов растений рода Hedysarum (сем. Fabaceae) / Ю.С. Фёдорова, П.В. Кузнецов, А.С. Сухих, Р.Н. Герасимова // Вестник российской академии естественных наук. Вып. 11, 2009. С. 189-190.

10) Федорова, Ю.С. Сравнительный фитохимический скрининг некоторых фитопрепаратов рода Hedysarum / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов // Медицина в Кузбассе, Кемерово. Вып. 7, 2009. С. 71.

11) Федорова, Ю.С. Особенности хроматографирования фракций фитопрепарата из копеечника забытого на полисахаридном адсорбенте сефароза CL-4B / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов, А.С. Сухих // Медицина в Кузбассе, Кемерово. Вып. 7, 2009. С. 72-73.

12) Федорова, Ю.С. Определение дубильных веществ в фитопрепаратах растения рода Hedysarum / Ю.С. Федорова // Тез. докл. межрегиональной научно-практической конференции «Проблемы медицины и биологии». Кемерово. Вып. 1, 2010. С. 211.

13) Федорова, Ю.С. О феномене антитоксического эффекта водно-спиртовых экстрактов некоторых растений рода Hedysarum / Ю.С. Федорова, Ю.В. Мелентьева // Тез. докл. межрегиональной научно-практической конференции «Проблемы медицины и биологии». Кемерово. Вып. 1, 2010. С. 211.

14) Федорова, Ю.С. Изучение токсического действия продуктов быстрого приготовления / Ю.С. Федорова, Ю.В. Мелентьева // Материалы докладов межрегиональной научно-практической конференции «Инновационные образовательные программы - условия повышения качества подготовки современных специалистов в системе СПО», - Томск. 2010. С. 223-226.

15) Федорова, Ю.С. Влияние фитопрепаратов копеечников (H. neglectum, H. theinum, H. alpinum) на картину периферической крови / Ю.С. Федорова, О.А. Карелина // Вестник ПГФА. 2010. № 7. С. 208-209.

16) Федорова, Ю.С. Получение методом жидкостной колоночной хроматографии стандарта мангиферина для исследования фитопрепаратов из растений рода копеечник / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов, А.С. Сухих // Вестник ПГФА. 2010. № 7.С. 210-214.

17) Федорова, Ю.С. Сравнительный анализ биологически активных веществ некоторых видов копеечников методом ВЭЖХ / Ю.С. Федорова, А.С. Сухих, П.В. Кузнецов, К.М. Минаев // Материалы Международной научно-практической конференции «Природные и интеллектуальные ресурсы Сибири». Кемерово, 2010. Т. 2. С. 142-145.

16. Федорова, Ю.С. Сравнительный фитохимический анализ биологически активных веществ некоторых фитопрепаратов рода Hedysarum / Ю.С. Федорова, П.В. Кузнецов // Вестник Российской Академии естественных наук (ЗСО), Вып. 12, 2010. С. 183-186.

19) Патент РФ 2402344 Федорова Ю.С., Кузнецов П.В., Сухих А.С. Способ получения фитопрепаратов из некоторых видов копеечника (копеечник чайный Hedysarum theinum, копеечник забытый Hedysarum neglectum и др.)

Размещено на Allbest.ru