Применение штаммов собственных лактобактерий для восстановления нарушенного биоценоза влагалища

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Применение штаммов собственных лактобактерий для восстановления нарушенного биоценоза влагалища

14.00.01 - акушерство и гинекология

03.00.07 - микробиология

Денисова Наталья Георгиевна

Самара - 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Мельников Владимир Александрович

доктор медицинских наук, профессор Жестков Александр Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Целкович Людмила Савельевна

доктор медицинских наук, профессор Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

Ведущая организация: ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Защита диссертации состоится « » сентября 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.085.04 при ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ» (443079, г.Самара, пр-т К.Маркса, 165 ''б'').

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»» (443001, г.Самара, ул.Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан « » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук С.Н.Черкасов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Несмотря на значительные успехи в фармакологии и клинической микробиологии, вопросы лечения бактериальных вагинозов (БВ) и, в особенности, восстановления биоценоза после антимикробной терапии БВ продолжают оставаться актуальными в гинекологии и акушерстве. Среди заболеваний бактериальной этиологии большой удельный вес составляют патологические состояния, связанные с нарушениями нормальной микрофлоры женского репродуктивного тракта. Частота возникновения таких заболеваний, как вагиниты, бактериальные вагинозы, первым этапом лечения которых является антимикробная терапия, не имеет тенденции к снижению (Анкирская А.С., 2005; Мельников В.А. и соавт., 2006).

Опубликованные результаты И.С.Сидоровой и соавт. (2005) позволили доказать существование прямой связи между дисбиозом влагалища и осложнениями в первом триместре беременности, такими как самопроизвольный выкидыш, неразвивающаяся беременность и риск развития внутриутробного инфицирования плода.

Нарушение биоценоза влагалища возникает при ряде инфекционных и соматических заболеваний, широком использовании антимикробных и контрацептивных препаратов, вследствие неблагоприятных внешних воздействий, подавлении локального и общего иммунного ответа (Буданов П.В., Стрижакова М.А., 2005; Серов В.Н., Тихомиров А.Л., Олейник Ч.Г., 2005).

Одним из распространенных заболеваний, связанных с нарушением биоценоза, является бактериальный вагиноз - полимикробный клинический синдром, в основе которого лежит нарушение нормального микробиоценоза влагалища (Кира Е.Ф., 2001; Hiller S. L., 2002).

К настоящему времени сформулирована и обоснована этапность в лечении бактериального вагиноза: I этап - санация влагалища, II - восстановление микробиоценоза влагалища (Сметник В.П., Тумилович Л.Г., 2001; Подзолкова Н.М., 2005).

Однако бактериальные препараты (аллогенные лактобактерии), предназначенные для восстановления микробиоценза влагалища, не оправдали надежд из-за их невысокой эффективности. Это связано с низкой колонизацией и быстрой элиминацией вводимых бактериальных штаммов из влагалищной среды, а наблюдаемый кратковременный эффект не предотвращает рецидивы бактериального вагиноза. По-видимому, использование чужеродных штаммов лактобактерий не приводит к восстановлению индивидуального биоценоза влагалища.

Применение биопрепаратов для восстановления биоценоза влагалища, содержащих аллогенные лактобактерии вагинального происхождения «Жмелик», также не оправдали надежды на устойчивое восстановление биоценоза.

В последние годы в России (Ван Ликуй, 2006) и Германии (R.Kirkaam, 2001) осуществлены попытки выделения аутоштаммов лактобактерий у женщин, страдающих бактериальным вагинозом, до начала антимикробной химиотерапии. Первый автор применил этот способ у 9 женщин с БВ и отметил эффективное приживление собственных лактобактерий во влагалище и снижение рецидивов заболевания. Второй автор предложил только технологию выделения аутоштаммов лактобактерии. Маточные культуры, по данным обоих авторов, сохранялись путем лиофилизации. Предложенные технологии селективного выделения аутолактобактерий являются трудоёмкими и дорогостоящими, что ограничивает их применение в клинике.

Таким образом, использование аутоштаммов лактобактерий для восстановления биоценоза влагалища является перспективным направлением и требует глубокого клинического изучения.

Цель исследования: оптимизация технологии выделения аутоштаммов лактобактерий и изучение терапевтической и профилактической эффективности коррекции нарушенного биоценоза живой культурой собственных лактобактерий у женщин с бактериальным вагинозом.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние биоценоза влагалища после лечения бактериального вагиноза метронидозолом.

2. Освоить выделение аутоштаммов лактобактерий у женщин, страдающих бактериальным вагинозом, с использованием стандартной среды.

3. Усовершенствовать технологию выращивания аутолактобактерий путем использования среды, состоящей из растительного гликогена.

4. Провести рандомизированное исследование для изучения эффективности использования живой культуры аутолактобактерий при восстановлении биоценоза влагалища.

Научная новизна.

Впервые проведены клинические исследования эффективности восстановления биоценоза влагалища живой культурой собственных лактобактерий.

Модифицирована технология выращивания собственных штаммов лактобактерий с использованием среды из растительного гликогена (рац. предложение ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава № 586 от 02.04.2008 года).

Доказано, что у женщин, страдающих бактериальным вагинозом, применение живой культуры собственных штаммов лактобактерий позволяет эффективно восстанавливать молочнокислую флору.

Предложен комплекс современных микробиологических технологий по эффективному восстановлению биоценоза влагалища (рац. предложение ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава № 579 от 5.02.2008 года).

Практическая значимость.

Предложены микробиологические клеточные технологии по аутотрансплантации собственных бактерий.

Разработанные методы выращивания и трансплантации собственных влагалищных лактобактерий дают возможность эффективно восстанавливать микробиоценоз влагалища, нарушение которого обусловлено воздействием различных факторов.

Применение живой культуры собственных влагалищных лактобактерий имеет явное преимущество перед чужеродными биопрепаратами, доказанное проведенным рандомизированным исследованием.

Положения, выносимые на защиту.

1. Применение санации влагалища на первом этапе лечения бактериального вагиноза приводит к дисбиотическим процессам во влагалище, что удлиняет процесс восстановления нормального биоценоза, а в части случаев приводит к рецидиву заболевания.

2. Стандартные микробиологические технологии селективного выращивания штаммов лактобактерий являются трудоёмкими, что затрудняет внедрение их в практическую медицину.

3. Использование растительного гликогена в качестве среды для выращивания лактобактерий позволяет упростить технологию культивирования и получить живую культуру собственных влагалищных лактобактерий.

4. Способ восстановления нарушенного биоценоза влагалища, основанный на использовании живой культуры собственных лактобактерий, позволяет с высокой эффективностью восстанавливать молочнокислую флору влагалища при дисбиотических состояниях.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на Межвузовской конференции молодых ученых «Аспирантские чтения» (Самара, 2003, 2004, 2005, 2006), региональном научном форуме по вопросам акушерства, гинекологии и педиатрии «Дитя и Мама» (Самара, 2006), Всероссийском научно-практическом семинаре «Инновационные технологии в акушерстве и гинекологии» (Москва, 2006), VIII Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2006), I Международном семинаре «Инфекция в акушерстве и перинатологии» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы репродуктивного здоровья и безопасного материнства» (Пермь, 2007), Республиканской научно-практической конференции «Инновационные технологии в охране репродуктивного здоровья женщины» (Екатеринбург, 2007).

Диссертационная работа апробирована на совместном научном заседании кафедр акушерства и гинекологии № 1, общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии, акушерства и гинекологии №2, акушерства и гинекологии ИПО ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава.

Внедрение результатов исследования в практику.

Материалы диссертации внедрены в практическую работу «Клиники репродуктивного здоровья ЭКО», женской консультации муниципальной поликлиники № 1 г.о. Самара, отделения ВРП «Клинического центра клеточных технологий». Полученные данные используются в учебном процессе на кафедрах акушерства и гинекологии № 1, общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них в центральных журналах, рекомендуемых ВАК РФ, - 3.

Получено два удостоверения на рационализаторское предложение - № 579 от 5 февраля 2008 года ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава, № 589 от 2 апреля 2008 года ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, главу результатов собственных исследований и их обсуждения, выводы, практические рекомендации, 8 таблиц, 30 рисунков. Список литературы содержит 175 источников, в том числе 110 отечественных и 65 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

бактериальный вагиноз аутотрансплантация

Материал и методы исследования

Настоящая работа состоит из двух частей: микробиологичесих исследований, в которых отработаны методы забора вагинального содержимого, культивирования собственных лактобактерий и заселения влагалища собственными лактобактериями, и клинической части, в которой проведено рандомизированное исследование у пациенток с бактериальным вагинозом с целью изучения терапевтической и профилактической эффективности восстановления биоценоза влагалища собственной лактофлорой и аллогенными биопрепаратами (в наших исследованиях был использован «Ацилакт»).

Микробиологические исследования проведены в микробиологической лаборатории ГУЗ СОКБ имени М.И.Калинина и на кафедре общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава.

Рандомизированное исследование проведено в «Клинике репродуктивного здоровья» г.о. Самара. В исследование были включены 165 пациенток с бактериальным вагинозом. Микробиологические технологии были отработаны на 15 больных.

Для рандомизированного исследования было определено 150 пациенток с бактериальным вагинозом, данное исследование продолжалось 12 месяцев. На контрольных осмотрах присутствовало 132 пациентки: 70 женщин, которым проведено восстановление биоценоза собственными лактобактериями, - I группа, и 62 женщины, которым проведено восстановление биоценоза «Ацилактом», - II группа.

Диагноз бактериального вагиноза верифицировался во время первого посещения на основании наличия следующих критериев: бели, влагалищное рН>4,5, обнаружение «ключевых клеток» в микроскопическом препарате, положительные результаты КОН-теста (критерии Амсела) и исключения специфической инфекции.

В исследуемой группе женщин с бактериальным вагинозом проведено анонимное анкетирование для выявления определяющих факторов развития заболевания.

Все проводимые мероприятия были разделены на клинические и лабораторные. Клинические включали общегинекологическое и специальное обследование, проводимые во время приема и консультирования пациенток.

Для исследования отбирались женщины с первым эпизодом БВ. Пациентки, принимавшие в последние две недели перед осмотром антибиотики или использовавшие спринцевания, влагалищные души и местно действующие препараты, исключались из исследования. Обязательным условием являлось отсутствие полового контакта в последние 72 часа до обследования. При первом визите проводилось анонимное анкетирование пациенток для получения демографических и анамнестических данных.

При первом визите оформлялось письменное информированное согласие на проведение исследования. Для сбора демографических и других данных использовалась стандартизованная анкета, которая включала вопросы о частоте половых контактов, используемой контрацепции, особенностях интимной гигиены, таких как спринцевание, вид белья и одежды, использования нижнего белья во время сна и т.д.

Планировалось четыре повторных визита: первый через десять дней после I-го этапа лечения БВ (метронидазол по 500 мг в течение 7 дней); второй через десять дней после II-го этапа лечения (восстановление биоценоза влагалища культурой собственных штаммов лактобактерий); третий и четвертый визиты соответственно через шесть и двенадцать месяцев. При возникновении рецидива БВ пациентка самостоятельно обращалась к врачу.

Ключевым моментом при проведении лабораторных исследований является изучение параметров влагалищной жидкости (ВЖ).

Проведение микробиологического анализа предусматривало изучение прежде всего биоценоза влагалища у пациенток с БВ с целью диагностики и эффективности его восстановления в процессе лечения и стойкости излеченности данного заболевания.

Влажные препараты для микроскопии готовили тщательным перемешиванием петли выделений с петлей 0,85% нормального физиологического раствора (1-й влажный мазок) и такого же количества белей с петлей 10% раствора КОН (2-й влажный мазок). Эти препараты рассматривали в нескольких полях зрения при 900-кратном увеличении. В первом случае обращали внимание на наличие ключевых, эпителиальных и парабазальных клеток, скопление бактериальных телец, трихомонад и лейкоцитов. Во втором препарате определяли наличие или отсутствие псевдогифов грибов.

Мазок с левой стенки влагалища наносился на предметное стекло, высушивался и передавался в лабораторию для окраски по Граму и микроскопии. Микробиолог, проводящий исследование, не знал о том, какой препарат был использован для восстановления биоценоза и пациентки. Для определения среднего количества морфотипов бактерий Lactobacillus, Gardnerella, Bacteroides и Mobiluncus использовалась стандартная система подсчета в поле зрения при 900-кратном увеличении и оценка по шкале Нагента (Nugent R.P et al., 1991). После доставки транспортной среды Кэри Блэйр для бактерий-анаэробов образец сразу же помещался в 1,5 мл фосфатного буферного раствора и центрифугировался, затем 100 мкл помещалось на селективный агар Rogosa Lactobacillus. Данная среда содержит казеиновый пептон, экстракт дрожжей, глюкозу, твин, калий дигидрофосфат, нитрат аммония, цитрат натрия, сульфат магния, сульфат железа, карбонат кальция и агар. Засеянный агар Rogosa Lactobacillus икубировался при 37°С в анаэробной камере (Sheldon Laboratories, Cornelius, OR) в течение 48-72 часов. Затем чашка использовалась для качественного определения лактобактерий. После индентификации лактобактерий производился посев в маточную среду из растительного гликогена, которая также инкубировалась при 37°С в анаэробной камере (Sheldon Laboratories, Cornelius, OR) в течение 48-72 часов. На рисунке 1 представлены основные методы, использованные нами для решения поставленных задач исследования.

Клинический этап

Ш Гинекологическое обследование;

Ш Анонимное анкетирование;

Ш Посев влагалищного содержимого;

Ш Взятие влагалищного мазка;

Ш Определение рН влагалищного содержимого;

Ш Аминотест (реакция с гидроокисью калия);

Ш Кольпоскопия;

Ш Изучение психофизиологического статуса.

Лабораторный этап

Ш ПЦР диагностика (исследование специфической микрофлоры влагалища с помощью полимеразной цепной реации);

Ш микроскопия влагалищного мазка, окрашенного по Граму;

Ш цитологическое исследование влагалищных мазков;

Ш определение степени чистоты вагинального содержимого;

Ш определение кариопикнотического индекса (КПИ);

Ш бактериологическое исследование - выделение собственных штаммов лактобактерий из вагинального содержимого на селективной среде агар Rogosa Lactobacillus;

Ш культивирование собственных лактобактерий в среде из растительного гликогена, после переноса из селективной среды.

Вспомогательные исследования

Ш эпидемиологический анамнез;

Ш сбор, хранение, математический анализ;

Ш фотографическое документирование материалов.

Рис 1. Методы исследования женщин с бактериальным вагинозом.

С целью изучения терапевтической и профилактической эффективности восстановления биоценоза культурой собственных штаммов лактобактерий в нашей работе использовано рандомизированное двойное слепое исследование.

Сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии № 1 ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава был разработан график рандомизации и обеспечена верификация распределения. Для случайного распределения пациенток с БВ на группы, получавшие культуру штаммов собственных лактобактерий или «Ацилакт», использовалась компьютерная программа - генератор случайных чисел с балансом по десяткам (без участия и информирования врачей, проводящих подбор пациенток). Непрозрачные конверты были пронумерованы случайным образом и содержали информацию об исследуемом препарате для их распределения по группам.

Для получения объективных данных и выявления закономерностей течения изучаемых процессов применяли стандартные и модифицированные методы статистического исследования.

В работе использован этапный метод математической обработки получаемых результатов, который состоял из следующих последовательных стадий: обоснование однородности и сравнимости исследуемых групп, определение закона распределения случайной величины, выбор метода обработки результатов, статистический анализ полученного материала и компьютерная обработка с использованием как стандартных, так и авторских компьютерных программ (Черкасов С.Н., 1995, 2002).

Полученные данные подвергались статистической обработке, которая осуществлялась с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 5.1, фирмы StatSoft). Для оценки статистической достоверности различий между категориями использовались метод ?-квадрат и критерий Фишера, а для оценки непрерывных переменных применялся t-тест с поправкой для неравной дисперсии. Оценка различий для количеств и результатов проводилась при помощи регрессионной модели. Логистическая регрессия использовалась для бинарных результатов с целью расчета уровня Р для сравнения между группами пациенток. Достоверность различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента и его аналогу для непараметрических распределений - Критерию Манна-Уитни. Достоверными считали различия при степени доверительной вероятности 95% и выше (Углов Б.А., Котельников Г.П., Углова М.В., 1994).

Для анализа и интерпретации результатов исследований использовали средства обработки данных статистического пакета STATISTIKA (версия 6) фирмы StatSoft (Боровиков В.П., Боровиков И.П., 1998; Боровиков В.П., 2003), табличного процессора Microsoft Excel 2002 (Новиков Ф.А., Яценко А.Д., 1999) и пакета MathCad 2001 (Макаров Е.Г., 2003).

Результаты исследования и их обсуждение

Все 165 пациенток были репродуктивного периода, средний возраст составил 31,0±2,27 год. Из них 29 (17,6%) женщин были связаны с физическим трудом и 117 (70,9%) - с интеллектуальным, 19 (11,5%) являлись домохозяйками. Из всех женщин 81 (49,1%) имели высшее образование, 32 (19,4%) - среднее специальное и 52 (31,5%) - только среднее.

Из опрошенных женщин больше всего было замужних (97 или 58,8%), к которым себя причисляли пациентки, ведущие совместное проживание без регистрации брака (23 или 13,9%). Остальные были одинокие, разведенные и вдовы. Возраст вступления в брак варьировал от 18 до 35 лет, но в среднем был равен 22,1±1,6 года.

Анализ анкетирования показал, что 63,7% пациенток с БВ начали половую жизнь до замужества и 36,3% - в браке. Обращают на себя внимание данные о периоде между началом половой жизни и вступлением в брак. Так, среди 105 анкетированных больных, которые начали половую жизнь до замужества, 34% вступили в брак через год, 16% - через два, 15% - через три, 20% - через четыре, 15 - через пять и более лет после начала сексуальной жизни. Таким образом, у 63,7% больных с БВ до замужества был довольно продолжительный период с относительно частой сменой половых партнеров.

Анализ активности сексуальной жизни среди 165 пациенток с БВ показал, что у 27,7% больных отмечена моногамность в сексуальных отношениях, 2-3 половых партнеров имели 48,3% и более трех - 24,0%. Среднее число половых партнеров составило 3,3 ± 0,28.

Ритм половой жизни в данной группе женщин составил у 17,5% меньше одного раза в неделю, у 39,1% - 2-3 в неделю и у 39,4% - 4-8 в неделю.

Контрацепцию использовало 72,0% женщин: внутриматочную спираль применяли 15,5% пациенток, гормональную оральную контрацепцию - 6,7%, механическую - 25,3%, физиологическую - 9%, спринцевания - 15,5%.

В настоящее время достаточно четко сформулированы подходы к лечению дисбиоза влагалища. Европейские стандарты предлагают одноэтапное лечение, заключающееся в применении антимикробных химиопрепаратов, воздействующих на анаэробную флору. Российские стандарты предполагают второй этап лечения - восстановление микробиоценоза влагалища пробиотиками и симбиотиками (Кира Е.Ф., 1995, 2001, 2007; Сметник В.П., Тумилович Л.Г., 2001; Серов В.Н., 2005; Подзолкова Н.М., Глазкова О.Л., 2005).

Однако бактериальные препараты (аллогенные лактобактерии растительного или кишечного происхождения), предназначенные для восстановления микробиоценза влагалища, не оправдали надежд из-за их малой эффективности. Это связано с низкой колонизацией и быстрой элиминацией вводимых чужеродных бактериальных штаммов из влагалищной среды, которая является для них нехарактерным биотопом. Наблюдаемый кратковременный бактериологический эффект не предотвращает рецидив бактериального вагиноза. Применение биопрепаратов «Жмелик» для восстановления биоценоза влагалища, содержащих аллогенные лактобактерии вагинального происхождения, также не позволили достичь устойчивого восстановления биоценоза.

Кроме того, интенсивная антимикробная химиотерапия, в которой препаратами выбора являются метронидазол и клиндамицин, ликвидируя условно патогенные микроорганизмы, не создает условий для восстановления нормальной микрофлоры влагалища, что в свою очередь приводит к развитию рецидивов вагиноза в различные сроки лечения (Ван Ликуй, 2006).

В ходе проведенного нами рандомизированного исследования в рамках данной работы рецидивы бактериального вагиноза через 6 месяцев после восстановления биоценоза «Ацилактом» у 60 пациенток были в 10% случаев, а в течение года - в 25% случаев.

Эти результаты согласуются с данными других авторов. Hiller S., Holmen K., (1990) указывают на рецидивы бактериального вагиноза через 3-6 месяцев после лечения в 15-30% случаев, а Wilson J. (2004) через 1 год после лечения выявил рецидив заболевания в 50-70% случаев.

Аналогичные проблемы возникают у женщин во время беременности. Так, по данным Стрижакова А.Н. и соавт. (2003) в 10-15% наблюдений после лечения бактериального вагиноза у беременных отмечаются рецидивы заболевания, в 6-12% случаев развивается вагинальный кандидоз.

Состояние микробиоценоза влагалища на 3-е сутки после лечения метронидазолом нами изучено у 125 пациенток с БВ. У всех пациенток при предварительном обследовании были исключены хламидиоз, трихомониаз, гонорея, сифилис, ВИЧ-инфекция.

Терапия назначалась в соответствии с Европейскими стандартами лечения БВ (2003): метронидазол по 500 мг два раза в день в течение 7 дней.

При микроскопии окрашенных по Граму вагинальных мазков на 3-е сутки после лечения метронидазолом в вагинальном микробиоценозе было выявлено четыре варианта бактериально-клеточных ассоциаций.

I вариант биоценоза характеризовался почти полным отсутствием как лактобактерий, так и отсутствием других бактерий и грибов, наличием единичных лейкоцитов и «чистых» эпителиальных клеток. Подобная картина встречается у 41% женщин после санации метронидазолом, мы его назвали условно «стерильным биотопом» влагалища.

II вариант биоценоза характеризовался умеренным количеством лактобактерий, которые, однако, значительно доминируют над другой бактериальной флорой: грамположительными кокками, грамотрицательными палочками и др.; обнаруживаются единичные лейкоциты, эпителиальные клетки. Подобная картина встречается у 27,9% женщин после санации метронидазолом и мы его условно назвали «формирующийся биотоп» влагалища.

III вариант биоценоза выражался в незначительном количестве или полном отсутствии лактобактерий, в наличии большого количества лейкоцитов и эпителиальных клеток, обильной полиморфной грамотрицательной и грамположительной палочковой и кокковой микрофлоры. Подобная картина встречается у 15,2% женщин после санации метронидазолом и мы его условно назвали «воспалительный биотоп» влагалища.

IV вариант биоценоза - полимикробная картина мазка, большое количество лейкоцитов, эпителиальных клеток, наличие грибов. Подобная картина встречается у 15,9% женщин после санации метронидазолом и мы его условно назвали «кандидозным биотопом» влагалища.

Анализируя сформировавшийся микробиоценоз влагалища после лечения БВ метронидазолом, можно предположить, что третий и четвертый варианты являются основными источниками возможного рецидива БВ и развития вагинального кандидоза.

Для подтверждения данной гипотезы мы провели ретроспективный анализ исходного состояния биоценоза среди женщин, у которых в течение 12 месяцев после восстановления микробиоценоза влагалища «Ацилактом» и культурой собственных лактобацилл был отмечен рецидив заболевания.

Всего с рецидивом заболевания оказалось 25 женщин: из группы, в которой использован «Ацилакт», - 20 пациенток, а из другой группы - 5 пациенток.

Как следует из представленной диаграммы (рис. 2), II вариант биоценоза, при котором преобладают лактобактерии над остальной флорой, даёт всего 4% рецидивов БВ, I вариант биоценоза - 24% рецидивов заболевания. При IV варианте биоценоза в 24% случаев также выявлены рецидивы, однако у 2/3 женщин с данным вариантом биотопа развивается кандидозный кольпит.

Наибольшая частота случаев рецидивов заболевания выявлена при III варианте биоценоза влагалища (48%), что статистически достоверно выше по сравнению с группой женщин со II вариантом биоценоза (р<0,01). Также достоверные различия получены в сравнении с группами женщин с I и IV вариантом биоценоза (р<0,05).

Рис. 2. Соотношение рецидивов БВ в зависимости от варианта сформировавшегося микробиоценоза после лечения метронидазолом

Таким образом, наиболее благоприятным является формирование второго варианта биоценоза влагалища после лечения метронидазолом. Формирование «условно стерильного биотопа» и «воспалительного биотопа» приводит, в основном, к рецидиву БВ, а IV вариант биоценоза в большинстве случаев является источником кандидозного кольпита.

Учитывая высокую частоту рецидивов заболевания при восстановлении биоценоза влагалища «Ацилактом», можно утверждать, что использование чужеродных штаммов лактобактерий не приводит к формированию индивидуального биоценоза влагалища. В этой связи целесообразен поиск способов восстановления именно индивидуального микробиоценоза.

Использование аутоштаммов лактобактерий для восстановления биоценоза после антимикробной химиотерапии бактериального вагиноза применил Ван Ликуй (2006) у 9 пациенток. Выделение чистой культуры собственных штаммов лактобактерий, полученных из влагалища до начала антимикробной химиотерапии, производилось путем неоднократного пересева в ламинарном боксе на среде MRS, маточные культуры сохранялись путем лиофилизации. Аутоштаммы вводились в течение 10 дней интравагинально. Согласно полученным данным, после комплексного лечения у всех женщин в мазке исчезали «ключевые клетки», значения рН вагинального отделяемого не превышало 4,5, аминный тест был отрицательным.

В 2001 году в Германии R. Kirkaam и E. Becker запатентовали средство для лечения дефицита бактерий и метод его производства (DE 199 63 104 A 1). Основу лекарства составляли аутоштаммы бактерий, полученных от человека или млекопитающих животных, а метод заключался в последовательном культивировании на селективной среде бактерий из взятой пробы. После получения достаточного количества бактерий производилась лекарственная форма. Технологию селективного выращивания аутоштаммов бактерий авторы рассмотрели на примере выращивания вагинальных лактобактерий и предложили лечение недостатка лактобактерий при бактериальном вагинозе собственными вагинальными лактобактериями.

Следует отметить, что использование аутоштаммов лактобактерий для коррекции биоценоза и лечения бактериального вагиноза до сих пор не применяется в практическом здравоохранении. По-видимому, это связано с дорогостоящей и трудоёмкой технологией селективного выращивания собственных лактобактерий. Для коррекции дисбиотических состояний во влагалище аутоштаммами лактобактерий нами разработана и предложена модификация способа селективного выделения и культивирования аутоштаммов лактобактерий с использованием маточной среды из растительного гликогена, в которую заселяются лактобактерии после первого выращивания их на селективной среде (рационализаторское предложение ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава № 589 от 9 апреля 2008 года).

Как известно, питательным субстратом для рассматриваемой группы бактерий является гликоген эпителиальных клеток влагалища. В результате температурного и кислотного гидролиза во влагалище гликоген расщепляется до полисахаридов. Их полный гидролиз в присутствии кислот и специфических ферментов дает моносахариды, которые и включаются в анаэробный гликолиз. Преобладающей моносахаридной единицей полисахаридов является D-глюкоза.

Главными резервными полисахаридами в природе являются у животных гликоген и крахмал у растений. Они состоят из D-глюкозидных единиц и представляют собой гомополисахариды. Учитывая однородное строение гликогена и крахмала, последний был нами использован как накопительная среда растительного происхождения для культивирования лактобактерий.

Микроскопия мазков из накопительной среды показала, что процесс размножения в среде из растительного гликогена идет динамично и через 4-5 дней определяются однородные грамположительные палочки в количестве 60-100 в каждом поле зрения при 600-кратном увеличении, другая флора не визуализируется. Среднее значение рН среды снижается до 3,8 ± 0,11.

При идентификации микробных культур в маточной среде из растительного гликогена после культивирования установлено, что Lactobacillus spp. выявляются в количестве 104 и более КОЕ/г и в концентрации lg 6,5±0,21 КОЕ/г, Bifidobacterium spp. в количестве 10 и менее КОЕ/г и в концентрации lg 1,17 ± 0,11 КОЕ/г. Другая микрофлора не выделялась.

При анализе данных, полученных от 15 пациенток, оказалось, что семидневный период инкубации от момента забора материала до готовой маточной среды достаточен, после чего её можно использовать для восстановления индивидуального микробиоценоза влагалища женщины.

Использование растительного гликогена в качестве маточной среды упрощает и удешевляет получение в достаточном количестве собственных штаммов лактобактерий, что существенно отличает нашу технологию получения аутоштаммов лактобактерий от классических технологий, которые применили R.Kirkaam, E.Becker (2001) и Ван Ликуй (2006).

Терапевтическая и профилактическая эффективность собственных штаммов лактобактерий при лечении БВ была изучена путем проведения рандомизированного исследования, в которое было включено 150 женщин с данным заболеванием. В результате рандомизации 66 женщинам восстановление биоценоза проведено культурой собственных штаммов лактобактерий (I группа) и 65 женщинам - аллогенным препаратом «Ацилакт» (II группа). Данное исследование продолжалось 12 месяцев.

Терапевтическая эффективность была исследована с применением критериев клинического улучшения, восстановления микробиоценоза влагалища и исчезновением объективных симптомов, сопровождающих эту инфекцию. Профилактическая эффективность определялась по количеству повторных инфекций, которые имели место в течение всего периода наблюдения, т. е. мы применили те показатели, которыми пользуются большинство исследователей этой проблемы (Кира А.Ф., 2001; Буданов П.В., Баев О.Р., 2002; Ван Ликуй, 2006).

При анализе данных динамического наблюдения и клинико-лабораторных исследований результаты, полученные после применения культуры собственных штаммов лактобактерий для восстановления индивидуального микробиоценоза, были существенно выше, чем в группе женщин с использованием чужеродных лактобактерий.

В результате изменения состава микробиоценоза влагалища под воздействием жизнедеятельности бактерий в I-й группе значительно улучшились его показатели, которые характеризовались при микроскопии мазков окрашенных по Граму, у 51 (82,2%) женщин как нормоценоз, у 11 (17,8%) - как промежуточный тип уже к третьему месяцу наблюдения. Во II-й группе к третьему месяцу наблюдения женщин с нормоценозом было достоверно меньше, чем в I-й группе: нормоценоз - у 37 (61,7%), промежуточный тип - у 19 (31,7%), дисбиоз влагалища - у 3 (5,0%), микотический вагинит - у 1 (1,7%).

Через три месяца после окончания лечения стойкий клинический эффект (нормоценоз влагалища) отмечен у 82,2% пациенток, применявших для восстановления биоценоза влагалища культуру собственных штаммов лактобактерий, и у 61,7% пациенток, применявших препарат «Ацилакт».

Ни у одной женщины из I-й группы в мазках не были обнаружены грибы, в то время как во II-й группе у одной женщины развился микотический вагинит и у двух женщин из трех с дисбиозом влагалища была отмечена смешанная кандидозно-бактериальная инфекция.

Динамика восстановления биоценоза влагалища до нормоценоза достоверно различается в зависимости от способа его восстановления. При использовании культуры собственных лактобактерий уже через три месяца у большинства женщин (82,2%) формируется нормоценоз, достигая максимальных цифр (88,7%) к шести месяцам после лечения, а концу исследования прирост составил всего 1,5%.

При использовании чужеродных бактерий (препарат «Ацилакт») нормоценоз восстанавливается к трем месяцам у 61,7% пациенток, к шести месяцам - у 71,4% и к двенадцати месяцам - у 78,0%. Темп и объём восстановления во II-й группе женщин достоверно отличался от значений их в I-й группе (р?0,05).

Промежуточный тип биоценоза влагалища в три раза чаще формировался у пациенток 2-й группы, такое соотношение сохранялось до конца исследования. Так, при последнем контрольном исследовании данный тип биоценоза выявлен у 2 (3,3%) пациенток из I-й группы и у 6 (12,0%) женщин Iиз I-й группы. Во все контрольные обследования изменения значений между группами женщин были статистически значимы (р?0,05). По-видимому, группа пациенток с промежуточным типом биоценоза чаще дает рецидивы заболевания.

Во II-й группе женщин рецидивы заболевания были выявлены при каждом контрольном осмотре: через 3 месяца - у 4 пациенток, через 6 месяцев - у 6 пациенток, через 12 месяцев - у 5 пациенток. У 5 пациенток выявлен кандидозный вагинит и у 10 - бактериальный вагиноз, причем у 4 из 10 пациенток с бактериальным вагинозом при бактериоскопии определялась смешанная кандидозно-бактериальная инфекция.

В I-й группе женщин был рецидив заболевания у 1 пациентки через шесть месяцев и у 4 пациенток через двенадцать месяцев. Следует отметить, что в этой группе женщин не было случаев кандидозных вагинитов и при бактериоскопии не выявлялась смешанная кандидзно-бактериальная инфекция.

Другие объективные параметры, такие как бели и запах, влагалищное рН, аминный тест также имели свою динамику в зависимости от способа восстановления биоценоза влагалища. Как следует из результатов проведенного рандомизированного исследования, применение собственных штаммов лактобактерий позволяет значительно эффективнее, чем аллогенными штаммами, восстанавливать уровень молочнокислых бактерий во влагалище и снижать риск возникновения рецидивов бактериального вагиноза.

Как известно, эффективный препарат-пробиотик должен обладать набором биологических свойств, позволяющим ему колонизировать определенную микроэкологическую нишу и успешно конкурировать с потенциальными патогенами (Шляпников М.Е., 2005; Кафарская Л.И., Инжеваткина С.М., 2005).

Способность к адгезии является одним из важнейших свойств микроорганизмов, способствующих формированию определенных микробных ценозов, в том числе и аутохтонных ценозов, ведущая роль в которых принадлежит лактобактериям (Кафарская Л.И., Тарабрина Н.П., Ефимов Б.А., 2005). Наши данные подтверждают и дополняют эти положения. Использование аутоштаммов лактобактерий обеспечивает формирование нормоценоза влагалища и достоверно снижает риск развития рецидивов бактериального вагиноза при их применении.

Суммируя результаты исследования эффективности аллогенных штаммов и аутоштаммов лактобактерий, мы пришли к заключению, что аутоштаммы - это тот фенотип лактобактерий, который формирует индивидуальный биоценоз влагалища женщины.

ВЫВОДЫ

1. Антимикробная химиотерапия бактериального вагиноза метронидазолом приводит к снижению уровня неспорообразующих анаэробных бактерий, в том числе и лактобактерий, но не влияет на популяционные уровни грибов рода Candida, которые формируют в 15,9% случаев «кандидозный битоп» влагалища.

2. Санация влагалища метронидазолом приводит к формированию четырёх вариантов биоценоза: вариант I - условно «стерильный биотоп» влагалища (41,0%), вариант II - «формирующийся биотоп» влагалища (27,9%), вариант III - «воспалительный биотоп» влагалища (15,2%) и вариант IV - «кандидозный биотоп» влагалища (15,9%). Рецидивы бактериального вагиноза достоверно связаны с формированием после антимикробной химиотерапии «воспалительного биотопа» в 48,0% случаев, «стерильного биотопа» - в 24,0% и «кандидозного биотопа» - в 24,0% случаев.

3. Использование растительного гликогена в качестве накопительной среды упрощает получение в достаточном количестве собственных штаммов лактобактерий.

4. Аутоштамы вагинальных лактобактерий обеспечивают эффективное восстановление молочнокислой флоры влагалища и формируют индивидуальный биоценоз влагалища, с чем связано достоверное снижение рецидивов бактериального вагиноза по сравнению с использованием для восстановления флоры влагалища аллогенных штаммов лактобактерий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Наиболее благоприятным является формирование второго варианта («формирующегося биотопа») биоценоза влагалища после лечения метронидазолом. Формирование условно «стерильного биотопа» и «воспалительного биотопа» приводит в основном к рецидиву бактериального вагиноза, а IV вариант биоценоза в большинстве случаев является источником кандидозного кольпита.

2. Необходимым условием для начала восстановления биоценоза влагалища является бактериоскопическое подтверждение эффективности воздействия антимикробного препарата и отсутствие элементов грибов.

3. Гликоген растительного происхождения может быть использован в качестве накопительной среды для молочнокислых бактерий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРАЦИИ

1. Миронова Н.Г. Восстановление нарушенного биоценоза влагалища культурой собственных лактобацилл / В.А.Мельников, Н.А.Краснова, О.Б.Калинкина, Н.Г.Миронова, Э.Т.Нурмухаметова, О.В.Тюмина // Материалы 8-го Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - Москва, 2006. - С. 456.

2. Миронова Н.Г. Бактериальный вагиноз. Новый метод восстановления биоценоза влагалища / Н.А.Краснова, Н.Г.Миронова // Вестник Самарского государственного университета. - Самара, 2006. - № 6/2 (46). - С. 95-99.

3. Миронова Н.Г. Снижение частоты осложнений беременности при восстановлении биоценоза влагалища у женщин с синдромом поликистозных яичников / О.Б.Калинкина, В.А.Мельников, Н.Г.Миронова, Т.С.Высоцких, М.А.Усова // Материалы первого регионального научного форума «Мать и Дитя». - Казань, 2007. - С.254-255.

4. Миронова Н.Г. Состояние биоценоза влагалища при беременности. Эффективность ранней коррекции / Н.А.Семенова, Е.В.Павленко, М.А.Усова, Т.С.Высоцких // Материалы I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов. - Ульяновск, 2007. - С.173.

5. Миронова Н.Г. Клиническая эффективность применения культуры собственных лактобацилл для восстановления биоценоза влагалища / В.А.Мельников, Н.А.Краснова, Т.С.Высоцких, Н.Г.Миронова, Е.А.Чернышева // Пермский медицинский журнал. - 2007. - Т. 24, №1-2. - С.36-38.

6. Миронова Н.Г. Восстановление нарушенного микробиоценоза влагалища у беременных в I триместре беременности / В.А.Мельников, Э.Т.Нурмухаметова, Е.А.Чернышева, Н.Г.Миронова, М.А.Усова // Материалы I Международного семинара «Инфекция в акушерстве и перинатологии». - Москва, 2007. - С.101-102.

7. Миронова Н.Г. Основные репродуктивные проблемы молодежи в современных условиях / В.А.Мельников, Н.А.Краснова, О.Б.Калинкина, О.В.Тюмина, Е.Е.Пилягина, М.А.Усова, А.П.Тикина, Н.А.Семенова, Н.Г.Миронова, В.Ю.Щукин, Д.М.Юсупов, М.Х.Беккиева, Е.А.Чернышова, Е.В.Ермолаева // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2008. - Спец. выпуск. - Том 1. - С. 34-41.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Миронова Н.Г. Способ коррекции дисбиоза влагалища после антибактериальной терапии / Т.С.Высоцких, Е.А.Чернышева, Н.Г.Миронова, Д.М.Юсупов. Рационализаторское предложение № 579, принятое ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава 14.02.2008 г.

2. Миронова Н.Г. Способ выращивания культуры влагалищных аутолактобацилл / В.А.Мельников, Т.С.Высоцких, Н.Г.Миронова, О.Б.Калинкина, Н.А.Краснова, М.А.Усова, А.П.Тикина. Рационализаторское предложение № 589, принятое ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава 02.04.2008 г.

Размещено на Allbest.ur