Новые иммунобиотехнологические методы для профилактики и лечения вирус-ассоциированных заболеваний
Исследование вирус-индуцированной экспрессии и продукции интерферонов первого и третьего типа in vitro. Изучение генома респираторного синцитиального вируса. Анализ результатов конъюгирования и комбинирования полученных пептидов с иммуномодуляторами.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 18.01.2018 |
| Размер файла | 555,0 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Пептиды моделировали последовательности белков Е7, ответственных за активацию ЦТЛ и ТХЛ (ассоциирующиеся с МНС I и II класса, соответственно). Длинные пептиды, Р-1, Р-236 и NC-725, предназначались для иммунизации, короткие 9-12 аминокислот для анализа иммунных спленоцитов в ELISPOTе. Преимущество пептидных вакцин заключается в их безопасности и легкости их получения. Современные технологии пептидного синтеза позволяют легко нарабатывать 10-40 членные пептиды и масштабировать их производство. Однако, их низкая иммуногенность заставляет применять конъюгаты, либо искать эффективные адъюванты. Как и следовало ожидать, эксперименты на мышах показали, что свободные пептиды из белка L1, за некоторым исключением (пептид С-14), обладали низкой иммуногенностью. Лишь конъюгация с ПО позволила повысить иммуногенность исследуемых препаратов, а коньюгация с KLH - получить высокотитражные антипептидные сыворотки, пригодные для аналитических целей. Наши эксперименты показали, что пептиды в сочетании с адъювантом ПМ индуцировали заметный антиген-специфический Т-клеточный ответ, активируя ЦТЛ и ТХЛ.
Полученные препараты обладают несомненным профилактическим и терапевтическим потенциалом, однако решающие доказательства их активности должны быть получены при испытаниях на биологической модели и в клинических исследованиях.
Изучение роли интерферонов первого и третьего типа при респираторной вирусной инфекции. В данной работе было показано, что при инфицировании риновирусом и вирусом гриппа в эпителии респираторного тракта резко повышается экспрессия интерферонов первого (б и в) и третьего (л) типа. Анализ кинетики индукции данных противовирусных интерферонов в клетках респираторного эпителия выявил то, что ИФН-л экспрессируются и продуцируются практически синхронно с ИФН-б/в. В тоже время экспрессия и продукция ИФН-л выражена значительно сильнее, чем экспрессия и продукция интерферонов первого типа (Рис.4). Характерно то, что данная тенденция имела место как при инфицировании респираторного эпителия риновирусами, так и в эксперименте с вирусом гриппа типа А.
Рис. 4.Оценка уровня экспрессии и продукции интерферонов первого и третьего типа при инфицировании клеток BEAS-2B РВ 16.
В тоже время, изучение популяции мононуклеаров крови продемонстрировало обратную картину: в данных клетках преимущество на стороне интерферонов первого типа, а именно ИФН-б. Очевидно, что факторы естественного иммунного ответа респираторного эпителия играют важнейшую барьерную и защитную роль по отношению к внедряющимся в организм респираторным патогенам. Более того, в последние годы было показано, что развитие вирус-индуцированной бронхиальной астмы тесно взаимосвязано с патологией в развитии факторов естественного иммунного ответа. Так при инфицировании РСВ и NDV мононуклеары периферической крови больных бронхиальной астмой продуцируют значительно меньшее количество ИФН-б по сравнению с мононуклеарами, полученными от здоровых индивидуумов (Gehlhar K, 2006). Также было показано, что клетки бронхиального эпителия астматиков более чувствительны к риновирусной инфекции по сравнению со здоровыми индивидуумами вследствие нарушенной продукции ИФН-в. Причём естественная резистентность клеток респираторного эпителия больных бронхиальной астмой к риновирусами полностью восстанавливалась при добавлении экзогенного ИФН-в (Wark P., 2005). Наконец совсем недавние исследования продемонстрировали, что продукция ИФН-л клетками бронхиоальвеолярного лаважа и бронхиального эпителия при инфицировании риновирусами in vivo также понижена у больных бронхиальной астмой (Contoli M., 2006). Таким образом, в совокупности перечисленные выше данные указывают на наличие дефицита продукции интерферонов первого и третьего типа у больных с вирус-индуцированной бронхиальной астмой, что может являться важнейшим этиопатогенетическим звеном как в формировании самой бронхиальной астмы, так и её вирус-индуцированных осложнений.
Ввиду неясности этиопатогенеза данного состояния повлиять на дефицит продукции ИФН первого и третьего типа у больных бронхиальной астмой в обозримом будущем представляется возможным лишь при заместительной терапии препаратами ИФН. В этой связи крайне любопытными представляются данные, свидетельствующие о том, что к стимуляции ИФН-л чувствительны лишь два типа клеток: плазмоцитоидные дендритные клетки, представляющие собой субтип дендритных клеток, а также эпителиальные клетки (Ank N., 2008). Последнее представляется очень важным, ведь эпителиальные клетки представляют собой первый барьер на пути множества вирусных инфекций при внедрении в организм человека. Так в эксперименте на мышах было показано, что местное введение ИФН-л2 во влагалище экспериментальных животных полностью предотвращало заражение ВПГ-2 (Ank N., 2008). Более того, было показано, что деплеция pDC у экспериментальных животных не приводила к снижению противовирусной защиты при интравагинальном введении ИФН-л и последующем инфицировании ВПГ-2. Эти данные свидетельствуют о том, что основным механизмом действия ИФН-л является локальный, местный механизм, а системный эффект ИФН-л не имеет такого большого значения. Результаты, приведённые в данной диссертационной работе, свидетельствующие о преимущественной роли интерферонов третьего типа над интерферонами первого типа в антивирусной защите при респираторной вирусной инфекции бронхоэпителиальных клеток полностью соответствуют полученным другими исследователями данным. Анализ полученных данных позволяет сделать заключение о том, что, по всей видимости, интерфероны первого типа, к которым относятся уже хорошо изученные ИФН-б и ИФН-в играют центральную, регулирующую роль в системном противовирусном иммунном ответе, а недавно открытые интерфероны третьего типа являются ключевыми факторами местного противовирусного ответа.
Как уже было описано выше, ВПЧ тропен к чешуйчатому эпителию, базальные клетки которого являются источником вирусной персистенции. Полученные в работе новые данные о важнейшей роли ИФН-л как одного из основных факторов местной противовирусной защиты организма, открывают новые перспективы для разработки новых и усовершенствования уже существующих методов лечения заболеваний, ассоциированных с ВПЧ.
Частые ОРВИ и вызванные ими обострения бронхиальной астмы ассоциированы с пониженной продукцией интерферонов первого и третьего типа у больных бронхиальной астмой. Ранее предпринимались попытки использовать препараты ИФН-б для лечения ОРВИ, однако до сих пор их эффективность является дискутабельной, во многом ввиду сложности в подборе оптимальной дозы и доставке препаратов в клетки-мишени. Поэтому крайне перспективным на сегодняшний день представляется внедрение ИФН-л в схему терапию вирус-индуцированных обострений бронхиальной астмы.
Изучение генома РСВ. Дизайн siRNA против мРНК белка Р РСВ. В качестве мишени в геноме РСВ был выбран фосфопротеин Р, являющийся меньшей субъединицей РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP) и эссенциальным транскрипционным фактором для белка L (Bitko V., 2001), поэтому ингибирование синтеза субъединицы P вирусной RdRP должно приводить к угнетению основного объема вирусной транскрипции и репликации и, следовательно, трансляции вирусных белков.
Структура мРНК белка Р РСВ была изучена на основании анализа 21 нуклеотидных последовательностей, доступных в банке данных NCBI (Национальный центр биотехнологической информации, США). Выбранные молекулы siRNA были нацелены на консервативные участки мРНК белка Р в пределах открытой рамки считывания и соответствовали формулам AAN19TT, NAN19NN, NARN17YNN, NANN17YNN (где N - любое нуклеиновое основание, R - пуриновое нуклеиновое основание, Y - пиримидиновое нуклеиновое основание). В соответствии с критериями, рекомендованными Elbashir с соавторами (Elbashir S.M., 2001) были синтезированы шесть уникальных потенциально наиболее эффективных последовательностей siRNA к мРНК белка Р.
1) si01. мРНК мишеньCGAUAAUAUAACUGCAAGAUU (401-419)
siRNA CGAUAAUAUAACUGCAAGAdTdT dTdTGCUAUUAUAUUGACGUUCU
2) si03. мРНК мишеньUGAUCUAUCACUUGAAGAUUU (719-737)
siRNA UGAUCUAUCACUUGAAGAUdTdT 3' dTdTACUAGAUAGUGAACUUCUA
3) si05.мРНК мишеньGUAGUAGCAAGUGCAGGACCU (474-492)
siRNA GUAGUAGCAAGUGCAGGACdCdT 3' dTdCCAUCAUCGUUCACGUCCUG
4) si07.мРНК мишеньGCAAGUGCAGGACCUACAUCU (480-498)
siRNA GCAAGUGCAGGACCUACAUdCdT
3' dTdCCGUUCACGUCCUGGAUGUA
5) si09.мРНК мишеньUACUAGGAAUGCUUCACACAUU (451-470)
siRNA UACUAGGAAUGCUUCACACAdTdT
3' dAdCCACAGAGAGUUAGGUUGUAG
6) si11.мРНК мишеньUUGAUAACAAUGAAGAAGAAU (343-361)
siRNA UUGAUAACAAUGAAGAAGAdAdT
3' dTdAAACUAUUGUUACUUCUUCU
На 3'-концах всех siRNA были помещены дезоксирибонуклеиновые остатки, что увеличивает их устойчивость к РНКазам (Elbashir S.M., 2001).
7) siMix. В качестве седьмой опытной siRNA использовали смесь этих шести специфических siRNA, смешанных в равных пропорциях.
Специфичность действия siRNA контролировали использованием siRNA к мРНК белка VP4 риновируса 16 серотипа, показавшей высокую противориновирусную активность в культуре клеток (Krista M.Ph., 2004).
siHRV мРНК мишень GAUGCAGCUUCCAGUGGUGUU (728-746)
siRNA GAUGCAGCUUCCAGUGGUGdTdT
3' dTdTCUACGUCGAAGGUCACCAC
Оценка антивирусной активности siRNA против мРНК белка Р РСВ в культуре клеток.
Микроскопическая оценка состояния зараженных вирусом клеток. Изменение структуры монослоя клеток МА104 под действием вируса наблюдали в динамике при помощи микроскопа. В клетках обработанных неспецифическими siRNA (siHRV и siGLO) и необработанных siRNA через 24 часа после заражения при микроскопическом исследовании монослоя наблюдали единичные синцитии. Через 48 часов после заражения наблюдали выраженное ЦПД, которое проявлялось в формировании характерных крупных синцитиев в монослое. Через 72-96 часов после инфицирования в этих лунках оставалось около 50% прикрепленных клеток, из них примерно половина в составе обширных синцитиев, остальные клетки находились в составе всплывших синцитиев. Через 120 часов после заражения под действием вируса монослой полностью разрушается.
Напротив, через 48, 72 и 96 часов после заражения в лунках, обработанных специфическими siRNA визуально синцитии не определялись, монослой выглядел интактным. Более того, состояние клеток к 3-4 суткам даже улучшилось, что было отмечено по интенсивной клеточной пролиферации. В клетках, обработанных специфическими siRNA, признаков ЦПД не наблюдали до 7-10 суток, в зависимости от использованной siRNA.
В отдельном эксперименте было показано, что даже однократная обработка клеток специфическими siRNA через 4 часа после инфицирования обеспечивает длительное угнетение образования синцитиев по сравнению с неспецифическими siRNA. В этих лунках через 48-72 часа после заражения синцитии также визуально не определялись. Через 96 часов в лунках с одной трансфекцией визуально определялись единичные маленькие синцитии с 2-3 ядрами. Активное образование синцитиев наблюдали на 5-7 сутки после заражения в зависимости от использованной siRNA.
Оценка противовирусной активности siRNA методом титрования. Титр вируса в клетках, обработанных различными специфическими siRNA против РСВ, при оценке титра по ЦПД через 48, 72 и 96 часов после заражения был значительно ниже, чем в обработанных контрольной неспецифической siRNA. Наиболее эффективные варианты siRNA снижали титр вируса в 200-300 раз по сравнению с контрольными siRNA. Ниже в виде гистограмм (рисунок 5) представлены результаты определения титра вируса через 48, 72 и 96 часов после инфицирования. По оси абсцисс расположены варианты siRNA - опытные и контрольная (siHRV). По оси ординат титр вируса в log10ТЦД50 в мл культуральной жидкости. *** - P<0,001.
Рисунок 5. Титрование вируса через 48, 72 и 96 часов после инфицирования и обработки siRNA.
Оценка противовирусной активности siRNA путем определения в культуральной жидкости количества вирусной РНК методом ПЦР в реальном времени. При проведении ПЦР в реальном времени зафиксировано значительное снижение количества копий вирусной РНК - до 40 раз по сравнению с контрольными siRNA. На гистограммах (рисунки 6) представлены результаты определения количества вирусной РНК методом ПЦР в реальном времени через 48, 72 и 96 часов. По оси абсцисс расположены варианты siRNA - опытные и контрольная (siHRV). По оси ординат log10 количества вирусной РНК в мл культуральной жидкости соответственно. ** - Р<0,01, *** - P<0,001
Рисунок 6. Результаты определения количества вирусной РНК в вируссодержащей культуральной жидкости, 48, 72 и 96 часов после заражения и обработки siRNA.
В диссертационной работе показано, что siRNA посредством сайленсинга вирусных генов эффективно угнетает вирусную репликацию. Применение наномолярных концентраций siRNA приводит к достоверному снижению титра вируса, до 200-300 раз в культуре клеток. Известно, что вещество обычно считается потенциально успешным в качестве фармакологического терапевтического средства, если оно эффективно в культуре клеток в субмикромолярных концентрациях.
При определении количества вирусной РНК при помощи ОТ-ПЦР степень уменьшения количества вирусной РНК в культуральной жидкости при обработке siRNA достигла 30-40 раз. Более эффективное снижение титра вируса (в 200-300 раз) при оценке действия siRNA по ЦПД по сравнению с количественным определением вирусной РНК объясняется нарушениями в сборке вирионов под воздействием siRNA. siRNA к мРНК белка Р РСВ вызывает сайленсинг гена ключевого белка, что, возможно, ведет к сборке дефектных вирионов, содержащих недостаточное количество белка Р, но содержащих РНК. Образуется меньшее количество инфекционных полноценных вирионов, что проявляется снижением вирусных титров в культуральной жидкости.
Комплексный анализ данных, полученный в экспериментах на культуре клеток при микроскопическом исследовании, титровании вируса и ПЦР позволяет сделать заключение о том, что мРНК белка Р является удачной мРНК-мишенью для создания антивирусного средства против РСВ на основе siRNA.
Важным моментом в подборе участка мРНК мишени является проблема «ускользающих мутаций» вирусов и необходимость подбора siRNA к консервативным участкам генома. В настоящей работе показано, что эффективность смеси siRNA (siMix) в культуре клеток не уступает самым удачным siRNA, входящим в её состав. Таким образом, смесь нескольких siRNA может быть использована как универсальный препарат против РСВ, обладающий противовирусной активностью в отношении большого разнообразия генетических вариантов вируса. В принципе препарат siMix может содержать siRNA не только к одной, а сразу к нескольким разным мРНК-мишеням, кодирующим ключевые вирусные белки. Таким образом, можно одновременно воздействовать на различные звенья патогенной активности вируса и добиваться более эффективного снижения активности вирусной репликации.
Оценка антивирусной активности siRNA против мРНК белка Р РСВ в экспериментальной модели инфекции на мышах. Для оценки активности siRNA в мышиной модели РСВ-инфекции использовали образцы siRNA, показавшие наибольшую эффективность в модели in vitro. Этими образцами стали опытные si01, si03, si07 и контрольная siHRV.
По данным большинства исследователей экспериментальную модель РСВ получают при использовании мышей линии BALB/c и РСВ штамм А2, к которому мыши более восприимчивы (Taylor G., 1984; Van Schaik S.M., 1998; Sudo K., 1999; Kong X., 2005; Bitko V., 2007). Но в литературе также встречаются данные об удачном проведении экспериментов in vivo с применением РСВ штамм Long (Bitko V., 2005; Cianci C., 2004).
РСВ вводили мышам в смеси с siRNA без применения специальных средств доставки siRNA. В перспективе применение siRNA без носителей является экономически более эффективным, а также снижает риск побочных эффектов. С другой стороны, с помощью средств для доставки siRNA с клетку можно добиться более эффективного сайленсинга вирусных генов.
В данной работе препарат siRNA вводился эндотрахеально, что позволяло доставлять siRNA непосредственно на эпителий респираторного тракта - основной, первичный очаг репликации респираторных вирусов. Для использования siRNA против вирусов, поражающих другие органы и ткани потребуются специальные средства доставки, которые обеспечат транспортную функцию через различные гистологические барьеры, защитную функцию от разрушения и сохранение функциональных свойств siRNA.
Титрование вируса в бронхоальвеолярных смывах их легких мышей и патологоанатомическая оценка состояния легких. При титровании вируса из легочных смывов не удалось получить результаты, которые характеризовали бы разницу в титре между опытными и контрольной группой. Вероятно, это связано с недостаточной чувствительностью применяемого метода титрования вируса по ЦПД. Однако было замечено, что в группах обработанных опытными специфическими siRNA удалось выделить вирус в культуре клеток из легких только у 1 мыши из 18, т.е. у 5% мышей. Тогда как из легких 12 мышей контрольной 4 группы (siHRV) и 5 группы (не обработанной siRNA) удалось выделить вирус у 42% мышей. Это указывает на снижение репродукции вируса в легких мышей, обработанных специфическими siRNA.
Снижение репродукции вируса в легких мышей, обработанных специфическими siRNA, подтверждаются видимыми поражениями в легких, которые мы наблюдали при вскрытии грудной клетки мышей. Легкие мышей из группы зараженных респираторным синцитиальным вирусом без введения siRNA и мышей из контрольной группы (siHRV) выглядели отечными, цианотичными, неравномерной окраски с участками уплотнений и очагами кровоизлиянияний, по консистенции они были неэластичными, рыхлыми, что соответствовало патологоанатомической картине массивной двухсторонней полисегментарной очагово-сливной геморрагической пневмонии. Напротив, в легких мышей из групп зараженных мышей, которые получили опытные специфические siRNA, видимых патологических изменений ткани легких не определялось - они были равномерной «здоровой» светлорозовой окраски, эластичной, упругой консистенции.
Определение количества вирусной РНК в гомогенатах легких методом ПЦР в реальном времени. В гомогенатах легких мышей на 6 сутки после эндотрахеального введения респираторного синцитиального вируса и si01 при проведении ПЦР-РВ обнаружено статистически достоверное снижение количества копий специфической вирусной РНК в 14 раз по сравнению с контролем (siHRV). В гомогенатах легких мышей получивших эндотрахеально респираторный синцитиальный вирус и si03 зафиксировано снижение количества копий специфической вирусной РНК в 7 раз. При проведении ПЦР-РВ в гомогенатах легких мышей, которым вводились РСВ и si07, зарегистрировано статистически недостоверное снижение количества копий специфической вирусной РНК по сравнению с контролем. Результаты определения количества вирусной РНК методом ПЦР-РВ представлены в виде гистограммы (рисунок 7).
Рисунок 7. Результаты определения количества вирусной РНК в гомогенатах легких методом ПЦР-РВ, копий/1 грамм легочной ткани. По оси абсцисс расположены варианты siRNA - опытных (si01, si03, si07) и контрольных групп (siHRV, RSV); по оси ординат - количество копий вирусной РНК в 1 грамме легочной ткани. * - Р?0,05.
Выявление наиболее эффективных siRNA против РСВ. Экспериментальные образцы si01 и si03 наиболее эффективно подавляли репликацию вируса в культуре клеток по сравнению с другими экспериментальными образцами. Эти же образцы показали лучшие результаты по снижению вирусной репликации в модели инфекции на мышах. Указанные siRNA соответствуют формуле AAN19TT и обладают высокой устойчивостью к эндонуклеазам (Barik S., 2004). А также, возможно, более эффективным взаимодействием с комплексом RISC.
Специфичность siRNA очень убедительна: несовпадение на одну пару оснований между siRNA и мРНК-мишенью делает невозможным сайленсинг (Elbashir S.M., 2001). Трансфекция клетки siRNA против одной вирусной мРНК не влияет на транскрипцию других мРНК. Так использование siRNA к мРНК белка VP4 риновируса 16 серотипа не влияло на титр РСВ. Кроме того, применение реагента для контроля трансфекции siGLO (siRNA к мРНК белка ядерной мембраны клетки ламина) также не виляло на титр РСВ. Напротив, использование siRNA к мРНК белка Р РСВ продемонстрировало четкое вирусспецифическое действие - исследуемые siRNA эффективно снижали титр РСВ. Применение siRNA приводит к сайленсингу ключевого вирусного белка, никак не влияя на нормально протекающие процессы в клетке.
Возможно применение лекарственного средства на основе siRNA против РСВ и с профилактической, и с лечебной целью. Использование siRNA до инфицирования или на начальных этапах инфекции позволяет наиболее эффективно подавлять вирусную репликацию. Тем не менее, применение siRNA на более поздних стадиях инфекции также оправдано - использование специфических siRNA должно ограничивать активность инфекции, уменьшать выраженность симптомов и сокращать длительность течения заболевания.
Респираторные вирусы, и особенно РСВ, обладают высокой тропностью к эпителию респираторного тракта. Поэтому ингаляционное введение препарата обеспечивает прицельную доставку siRNA к очагу инфекции, что является идеальным условием для решения проблемы способа введения лекарственного средства в фармакологии. Ингаляционное введение siRNA является сравнительно неинвазивным и безболезненным. В настоящей работе эндотрахеальное введение мышам «голой» siRNA без средств доставки эффективно оказывало противовирусных эффект, что согласуется с данными других исследователей с ингаляционным или интраназальным введением мышам «голой» siRNA (Bitko V., 2005; Tompkins S.M., 2004). Ингаляционное введение «голой» siRNA исключает потенциальный риск возможного побочного действия средства доставки. Высокую эффективность «голой» siRNA без носителей ещё предстоит объяснить. Возможно, это связано с тем, что ткани респираторного тракта, в частности легкие, более восприимчивы к диффузии малых молекул или становятся таковыми во время инфекции.
Безусловно, очень привлекательной является сравнительная дешевизна методики на основе siRNA. Синтез олигонуклеотидов в настоящее время относительно доступен и прост. Кроме того, в России недавно появились компании, которые синтезируют siRNA. Этот факт дает siRNA большое преимущество, например, по сравнению со средствами на основе моноклональных антител.
Несмотря на то что, молекулярная биология и эпидемиология РСВ хорошо изучены, средств для эффективного лечения и профилактики РСВ-инфекции до сих пор не разработано. В данном исследовании получены убедительные данные о том, что siRNA против мРНК белка Р РСВ эффективно подавляют репродукцию вируса, поэтому терапевтическое использование siRNA кажется весьма перспективным. Следует рассматривать синтетические молекулы siRNA в качестве средства высоко эффективного и специфического подавления экспрессии генов цитоплазматической вирусной РНК. На сегодняшний день существует потребность в создании эффективной противовирусной терапии для предотвращения и лечения состояний и заболеваний, связанных с респираторными вирусами, в частности вирус-индуцированной бронхиальной астмы. Возможность использования siRNA в качестве эффективного специфического противовирусного средства, безусловно, должна реализоваться в разработке надежной, безопасной и недорогой противовирусной терапевтической методики.
Выводы
1. Получены дрожжевые репликативные плазмиды, предназначенные для экспрессии белка L1 папилломавируса человека серотипов 16 и 18 в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
2. Отработаны протоколы выделения ВПЧ. Препараты ВПЧ из белков L1 HPV cеротипов 16 и 18 наработаны в количестве 1,5 мг. Анализ препаратов методами визуализации в геле, иммуноферментными методом при помощи специфических антител, а также методом электронной микроскопии доказал соответствие полученных в работе частиц искомым вирусоподобным частицам.
3. Препараты ВПЧ из белков L1 HPV cеротипов 16 и 18 являются высокоиммуногенными препаратами.
4. Проанализированы аминокислотные последовательности внутреннего белка Е7 ВПЧ 16 и 31. Выбраны участки, соответствующие Т-клеточным эпитопам ВПЧ. Синтезированные пептиды обладали специфическими иммуногенными свойствами при использовании с иммуностимулирующими препаратами.
5. Комбинированное использование полученных вирусоподобных частиц, состоящих из белка L1, с пептидами, имитирующими Т-клеточные эпитопы белка Е7, перспективно в контексте создания лечебно-профилактической вакцины против вируса папилломы человека.
6. Интерфероны третьего типа являются основными интерферонами, продуцируемыми клетками респираторного эпителия при вирусной инфекции.
7. Белок Р является успешной мишенью для эффективного подавления РСВ при помощи siRNA. siRNA к мРНК белка Р РСВ эффективно снижает репликацию респираторно-синцитиального вируса in vitro в культуре клеток.
8. siRNA к мРНК белка Р респираторно-синцитиального вируса эффективно снижает репликацию РСВ in vivo на мышах. Экспериментальные данные, полученные in vitro, подтверждены in vivo.
9. Выявлены наиболее эффективные siRNA против мРНК белка Р респираторно-синцитиального вируса. siRNA обладает специфическим действием, не оказывает влияния на уровень транскрипции других белков
10. siRNA может использоваться в качестве специфического противовирусного средства, не влияющего на нормально протекающие процессы в клетке.
11. siRNA может применяться в качестве противовирусного средства без специальных средств доставки в чистом виде при эндотрахеальном/ингаляционном введении, что может использовано при создании лечебно-профилактических средств против респираторных вирусов.
12. Использование siRNA в качестве противовирусного средства представляется сравнительно простой и недорогой методикой, требующей лишь выбора белка-мишени вируса, знания методики дизайна siRNA и синтеза олигонуклеотидов, который в настоящее время стал доступен.
13. Теоретически обоснован и экспериментально подтверждён метод создания эффективного лекарственного средства против РСВ, одного из основных этиологических факторов вирус-индуцированной бронхиальной астмы, с использованием механизма интерференции РНК.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Хаитов М.Р., Трофимов Д.Ю., Петрова Т.В., Подчерняева Р.Я., Хижнякова Т.М., Соколова М.В. Молекулярная диагностика вирусных инфекций при бронхиальной астме. Сообщение №1. Подход к разработке ПЦР диагностикумов для идентификации вирусов - этиологических факторов бронхиальной астмы. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2000, №10, с.3-7.
2. Хаитов М.Р. Изучение роли респираторно-синцитиального вируса в этиологии и патогенезе бронхиальной астмы. «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Материалы II Российской конференции молодых учёных России с международным участием (24-28 апреля 2001, Москва). 2001, т.1, с.179.
3. Хаитов М.Р. Изучение роли респираторно-синцитиального вируса в этиопатогенезе бронхиальной астмы. Материалы 4-го Конгресса РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (29-31 мая 2001 г., Москва). М., ВИНИТИ, 2001, т.2, с.232.
4. Khaitov M.R. Investigation of the role of respiratory syncitial virus in etiology and pathogenesis of atopy and asthma. Allergy, 2001, suppl. 68, v. 56, p. 158.
5. Хаитов М.Р. Острые респираторные вирусные инфекции и бронхиальная астма. Клеточные и молекулярные аспекты проблемы. Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол., 2002, №4, с.84-93.
6. Хаитов М.Р., Алексеев Л.П., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Петрова Т.В., Яковлева К.П. Молекулярная диагностика вирусных инфекций при бронхиальной астме. Сообщение №2. Исследование роли респираторных вирусов в возникновении приступов бронхиальной астмы. Аспекты МНС-обусловленной предрасположенности к вирус-индуцированной бронхиальной астме. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2002, №8, с.17-21.
7. Khaitov M.R., Trofimov D.U., Petrova T.V. Investigation of the role of respiratory viruses in the development of asthma. Allergy, 2002, vol.57, suppl.73, р.296.
8. Хаитов М.Р. Роль респираторных вирусов в патогенезе бронхиальной астмы. Иммунология, 2003, т.24, с.58-65.
9. Хаитов М.Р., Алексеев Л.П., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Петрова Т.В., Яковлева К.П. Изучение роли респираторных вирусов в этиологии и патогенезе бронхиальной астмы. Иммунология, 2003, т.24, №2, с.96-99.
10. Khaitov M.R., Trofimov D.U., Petrova T.V., Yakovleva K.P., Ilina N.I., Yartsev M.N., Boldyreva M.N., Alexeev L.P. Investigation of respiratory viruses role in asthma development. Clinical Immunology and Allergy in Medicine. JGC Editions, 2003, p. 403-409.
11. Хаитов М.Р., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Петрова Т.В., Яковлева К.П., Ярцев М.Н., Ильина Н.И., Алексеев Л.П., Зверев В.В., Киселёв О.И., Гервазиева В.Б., Семенов Б.Ф. Разработка ПЦР-диагностикума для детекции респираторно- синцитиального вируса. Физиология и патология иммунной системы, 2004, № 2, с.85-91.
12. Хаитов М.Р., Трофимов Д.Ю., Петрова Т.В., Яковлева К.П., М.Н.Ярцев, Алексеев Л.П., Ильина Н.И. Риновирусная инфекция при атопической бронхиальной астме у детей. Российский аллергологический журнал, 2004, №1, с.30-36.
13. M. R. Khaitov, D. U. Trofimov, T. V. Petrova, K. P. Yakovleva, L. P. Alexeev. Evaluation of the role of rhinoviruses, adenoviruses, RS-viruses, PIV 1, PIV 2, PIV 3 and coronaviruses OC43 and 229E in exacerbations of asthma in children. Abstract Book XXIII EAACI Congress, 2004 Amsterdam, p. 37.
14. M. R. Khaitov, D. U. Trofimov, T. V. Petrova, K. P. Yakovleva, M. N. Boldyreva, M. N. Yartsev, N. I. Ilina, L. M. DuBuske, L. P. Alexeev. Mechanisms of Viral Impact on Asthma Exacerbations. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2004, Volume 113, Supple. 2 , p. 952.
15. Хаитов М.Р., Лаза-Станца В., Эдвардс М.Р., Джонстон С.Л. Оценка -, - и -интерферонового ответа при острых респираторных вирусных инфекциях. Физиология и патология иммунной системы, 2005, №9, с. 3-12.
16. Хаитов М.Р. Интерфероны первого типа при вирус-индуцированных приступах бронхиальной астмы. Аллергология и иммунология в педиатрии. 2005, № 6, с.166.
17. Хаитов М.Р., Акимов В.С. Возможности применения технологий RNAi для подавления репликации респираторно-синцитиального вируса, одного из основных этиологических агентов приступов бронхиальной астмы. Физиология и патология иммунной системы, №5, 2005, с. 3-6.
18. Хаитов М.Р., Акимов В.С. Технология RNAi. Возможности применения siRNA для подавления репликации респираторных вирусов, основных этиологических агентов приступов бронхиальной астмы. Иммунология, 2005, № 4, с. 249-255.
19. Khaitov M., Laza-Stanca, V., Edwards, M., Contoli, M., Walton, R., Johnston SL. Type 1 and type 3 interferon expression in response to respiratory viruses. Abstract Book XXV EAACI Congress, 2006 Vienna, Austria, 10-14 June 2006 p. 26.
20. Litvin L.S., Khaitov M.R. , Babakhin A.A. , Stetzenko O.N.*, Voronkova L.N., Ivanova A.S. Asthma modeling using BALB/c and (CBAxC57BL/6)F1 mice. Abstract Book XXV EAACI Congress, 2006 Vienna, Austria, 10-14 June 2006 p.203.
21. Хаитов М.Р., Акимов В.С. Интерференция РНК. Успехи современной биологии. Том 126, №3, 2006, с. 242-249.
22. Хаитов М.Р., Лаза-Станца В. , Эдвардс М.Р. , Джонстон С.Л Продукция альфа-, бета и лямбда-интерферонов эпителиальными клетками и мононуклеарными клетками при ОРВИ. Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол., 2006, т.7, с. 63-69.
23. Khaitov M.R., Akimov V.S., Faizuloev E.B., Nikonova A.A., Alexeev L.P., Zverev V.V. and DuBuske L.M.. Inhibition of Respiratory Syncytial Virus (RSV) Replication in Cell Culture by Small Interfering RNA (siRNA). Journal of Allergy and Clinical Immunology, Volume 119, Issue 1, Supplement 1, January 2007, p. S233-S234.
24. Khaitov M.R., Akimov V.S., Faizuloev E.B., Nikonova A.A., Trofimov D.U., Alekseev L.P., Sominina A.A., Zverev V.V., DuBuske L.M. siRNA mediated inhibition of RSV replication. J Allergy, 2007, v.62 (s.83), p.127.
25. Khaitov M.R., Akimov V.S., Faizuloev E.B., Nikonova A.A., Trofimov D.U., Alekseev L.P., Sominina A.A., Zverev V.V., DuBuske L.M. Inhibition of RSV infection in vitro by small interfering RNAs. 2007 Annual Meeting ACAAI. November 8-14. p. 33.
26. Khaitov MR, Laza-Stanca, V., Edwards M., Walton, R., Contoli, M., Papi A., Johnston SL Alpha-, beta-, lambda-interferon expression during rhinovirus infection. Abstract Book IX International Symposium on Respiratory Viral Infections, 2007, p 15.
27. Акимов В.С., Хаитов М.Р., Файзулоев Е.Б., Никонова А.А., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Соминина А.А., Зверев В.В. Подавление репродукции респираторно-синцитиального вируса методом siRNA. Вопросы вирусологии. №2, 2007, с. 8-12.
28. Хаитов М.Р., Акимов В.С., Файзулоев Е.Б., Никонова А.А., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Соминина А.А., Зверев В.В. Разработка новых подходов к созданию антивирусных препаратов. Сообщение №1: Подавление репродукции респираторно-синцитиального вируса методом siRNA. Физиология и патология иммунной системы, 2007, №9, с. 8-13.
29. Хаитов М.Р., Акимов В.С., Файзулоев Е.Б., Никонова А.А., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Соминина А.А., Зверев В.В. Молекулярно-генетические подходы к подавлению репродукции респираторных вирусов. Российский аллергологический журнал, 2007, №3 приложение 1, с. 80.
30. Петров Р.В., Хаитов М.Р., Андреев С.М., Петрухина А. О., Гарманова А. В., Бабахин А.А., Литвин Л.С., Коробова С.В., Литвина М.М., Беневоленский С.В., Сурина Е.Р. , Козлов Д.Г. , Абянова А.Р., Смирнова О.В. Разработка профилактической и терапевтической вакцины против вируса папилломы человека. Сообщение № 1: Синтез и иммунологическая активность рекомбинантных белков и пептидов из вируса папилломы человека серотипов 16, 18 и 31. Иммунология, 2007, т. 28, № 6, с. 342-352.
31. Петров Р. В., Хаитов М. Р., Андреев С. М., Беневоленский С. В., Смирнова О.В. Иммуногенные свойства рекомбинантных и синтетических пептидов вируса папилломы человека. Доклады Академии Наук, 2008, том 421, № 2, с. 267-273.
32. Khaitov MR, Laza-Stanca V, Edwards MR, Walton RP, Rohde G, Contoli M, Papi A, Stanciu LA, Kotenko SV, Johnston S. L. Respiratory Virus Induction of Alpha-, Beta- and Lambda-interferons in Bronchial Epithelial Cells and Peripheral Blood Mononuclear Cells. Allergy, 2008, in press.
33. Царёв С.В., Хаитов М.Р., Лусс Л.В., Трофимов Д.Ю. Факторы, провоцирующие обострение при различных формах бронхиальной астмы. Физиология и патология иммунной системы. 2008, № 2, с. 8-14.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
История изучения вируса герпеса человека 8 типа. Саркома Капоши как онкологическое заболевание: общая характеристика и ее разновидности. Пути передачи вируса, мероприятия по профилактике инфицирования. Способы диагностики и лечения данного заболевания.
презентация [139,0 K], добавлен 20.11.2015Строение вируса иммунодефицита человека. Жизненный цикл возбудителя инфекции. Механизм взаимодействия с клеткой, патогенез. Пути передачи и методы профилактики. Поиск противовирусных препаратов, влияющих на ВИЧ, методы восстановления функций иммунитета.
курсовая работа [541,4 K], добавлен 28.04.2012Строение вируса иммунодефицита человека. Способы заражения и методы профилактики. Вероятность передачи вируса от матери к ребенку. Группы повышенного риска. Пути, которыми ВИЧ не передается. Миф о "СПИД-терроризме". Воздействие ВИЧ на организм человека.
презентация [2,5 M], добавлен 15.03.2011История открытия, морфология, физиология и патогенез вируса Эпштейна-Барра как одного из видов герпеса. Клиническая картина и методы исследования микроба. Характеристика заболеваний, вызванных снижением иммунитета вследствие действия данного вируса.
реферат [945,3 K], добавлен 04.05.2014Вирус иммунодефицита и его структура. ВИЧ-инфекция как причина заболевания. Действие вируса внутри белых клеток. Особенности строения мембраны вируса, его способность к мутациям. Распространение вируса через инфицированную кровь, попадающую в организм.
курсовая работа [58,9 K], добавлен 11.01.2010Врожденный антивирусный иммунитет. Типы интерферонов и механизмы антивирусного действия интерферонов. Способность антител и комплементов ограничить распространение вируса и предотвратить повторную инфекцию. Обход вирусами иммунологического контроля.
реферат [17,4 K], добавлен 27.09.2009Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и история его происхождения. Классификация ВИЧ, пути передачи вируса. Особенности развития ВИЧ-заболевания. Характеристика инфекций, возникающих у ВИЧ-инфицированных пациентов. Методы лечения и профилактика ВИЧ.
курсовая работа [1,6 M], добавлен 16.06.2014Таксономическое положение вируса гриппа, его диагностика. Основные биологические свойства возбудителя. Методы активной иммунизации против гриппа. Особенности микробиологической диагностики. Специфика этиотропной терапии и специфической профилактики.
контрольная работа [34,1 K], добавлен 28.02.2012Инфекционные болезни, вызванные герпевирусами. Герпетические высыпания на губах. Механизмы взаимодействия вируса с иммунной системой хозяина. Использование средств патогенетической и симптоматической терапии при простом вирусе герпеса первого типа.
презентация [930,8 K], добавлен 23.05.2013Изучение особенностей распространения вируса гепатита В, его устойчивости во внешней среде. Исследование механизма развития инфекции, обусловленной вирусом гепатита. Характеристика общих симптомов заболевания, методов профилактики и защиты от вируса.
презентация [1022,5 K], добавлен 22.05.2012
