Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.00.15. - «Патологическая анатомия»/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПАТОЛОГИИ ЛЕГКИХ, РАЗВИВШЕЙСЯ В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОЙ РАДИАЦИИ

Сагиндикова Г.Е.

Москва - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия имени И.М. Сеченова Росздрава

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Евгения Алтаровна Коган

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН

доктор медицинских наук, профессор, директор ГУ НИИ морфологии человека РАМН Лев Владимирович Кактурский

доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории экспериментальной патоморфологии ММА им. И.М.Сеченова Анатолий Борисович Шехтер

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии РГМУ Олег Вадимович Зайратьянц

Ведущая организация:

Научный Исследовательский Институт Пульмонологии МЗ РФ

Защита диссертации состоится «___»___________ 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.01 при ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия имени И.М. Сеченова Росздрава (119991 Москва, Трубецкая ул., д. 8, стр. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия имени И.М. Сеченова Росздрава (117998, Москва, Нахимовский пр., д. 49).

Автореферат диссертации разослан «____»______2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор Владимир Анатольевич Варшавский

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Широкое распространение ядерных технологий ведет за собой и повышение риска загрязнения окружающей среды, а также неизбежное расширение круга лиц, подвергавшихся воздействию радиационных факторов [Ференц В.Б., 1992, Цыб А.Ф., 1990, Чайжунусова Н.Ж., 1993, Василенко И.Я., 1991].

Изучение отдаленных последствий воздействия малых доз ионизирующего излучения на здоровье человека представляет собой наиболее быстро развивающийся раздел радиобиологии и радиационной медицины [Москалев Ю.И., 1999, Черникова СБ., 1993]. Исследования в данном направлении особенно актуальны для Республики Казахстан, так как в связи с многолетним функционированием Семипалатинского и других испытательных ядерных полигонов, значительная часть ее территории контаминирована радиоактивными изотопами, а проживающее население в прошлом подвергалось воздействию внешнего и внутреннего облучения в дозах, значительно превышающих естественный фон радиоактивности [Бозтаев К.Б., 1992; Ибраев С.С., 1992; Гусев Б.И., 1993, Атчабаров Б.А., 1999, Bersimbaev R.I., 2000, Rosenson R., 1996].

Проведенные исследования показывают, что, несмотря на прекращение в 1989 году ядерных испытаний, радиоактивное облучение населения региона продолжается до настоящего времени, и, по-видимому, связано с наличием радиоактивных веществ в воде и продуктах питания [Чайжунусова Н.Ж., 1993]. Кроме того, в современном обществе интенсивно используются в мирных целях радиоактивные изотопы в промышленности, энергетике и в медицинской практике [Голутвина М.М., 1989, Журавлев В.Ф., 1989; Пинаев А.К., 1991, Cragle D.L., 1988,Сиваченко Т.С., 1991; Peters A.M., 1991].

Проблема патологии легких, развившейся в условиях повышенной радиации в настоящее время интенсивно изучается. Однако, остаются пока спорными и недостаточно изученными многие вопросы, касающиеся роста заболеваемости и смертности отдельными заболеваниями легких в Семипалатинском регионе Казахстана с повышенным радиоактивным фоном, а также характеристика их морфологических и патогенетических особенностей (хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), бронхоэктатической болезни (БЭБ), фиброзирующего альвеолита (ФА) и радиационного фиброза легких, туберкулеза, предраковых и дисрегенераторных процессов в эпителии и рака легкого (РЛ)).

Изучению молекулярных механизмов патогенеза перечисленных заболеваний, возникших на радиоактивно-загрязненных территориях, посвящены единичные исследования [Коган Е.А., 1999, Yamamoto T., 1986], в которых отмечается роль «радиационного» фиброза и дисрегенераторных изменений эпителия. Особая роль в развитии данных процессов отводится матриксным металлопротеиназам (MMPs), их активаторам и тканевым ингибиторам (TIMP) [Zhou Y., 2005]. Роль системы ММР в развития предрака и РЛ практически не изучена, поскольку в большинстве работ исследовался РЛ [Coussens L.M., 2002, Gonzales-Avila G., 1998, Kawano N., 1997, Zhou Y., 2005]. В то же время известно, что в легком эти процессы нередко развиваются на фоне фиброза, в том числе радиационного, на чем основана концепция «рака легкого в рубце».

Целью настоящей работы явилось изучение эпидемиологических, морфологических и молекулярно-биологических особенностей патологии легких, развившейся у населения Семипалатинского региона Казахстана, длительное время проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить нозологический спектр легочной патологии, развившейся у лиц в условиях повышенной радиации Семипалатинского региона;

2)охарактеризовать особенности морфологических проявлений легочной патологии, развившейся у лиц в условиях повышенной радиации Семипалатинского региона;

3) изучить роль MMPs и их ингибиторов в пато- и морфогенезе хронических диффузных заболеваний легких (ХДЗЛ), туберкулеза, предрака и РЛ, развившихся у лиц в условиях повышенной радиации Семипалатинского региона;

4) изучить процессы ангиогенеза и фиброза при ХДЗЛ, туберкулезе, предраке и РЛ, развившихся у лиц в условиях повышенной радиации Семипалатинского региона;

5) изучить дисрегенераторные процессы в эпителии при ХДЗЛ, туберкулезе, предраке и РЛ, развившихся у лиц в условиях повышенной радиации Семипалатинского региона.

Научная новизна

Новизна диссертационной работы связана с тем, что охарактеризованы эпидемиологические, морфологические и морфогенетические особенности легочной патологии, развившейся у лиц, длительное время проживавших в условиях повышенной радиации Семипалатинского региона.

Автором установлены тенденции к снижению показателей заболеваемости ХДЗЛ в период 1992-2003 г.г. после прекращения ядерных испытаний, что может подтверждать значение радиации как этиопатогенетического фактора. При этом структура заболеваемости и смертности от ХДЗЛ с преобладанием хронической обструктивной эмфиземы легких (ХОЭЛ) и фиброзирующего альвеолита у населения Семипалатинского региона подтверждает патогенетическую роль радиации в повреждении сосудов, интерстиция и эпителия легких.

Впервые обнаружены морфологические отличия ХДЗЛ у лиц, проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана по сравнению с контрольной группой, заключающиеся в более выраженном фиброзе, неоангиогенезе и дисрегенераторных изменениях эпителия, что сочеталось с высокой экспрессией MMP-1, -2, -9, TIMP-1, TGFв, VEGF.

Впервые выявлены особенности дисрегенераторных изменений эпителия, которые чаще встречались при ХДЗЛ у лиц, проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана, и отличались более высокой экспрессией эпителием MMP-1, -2, -9, TIMP-1, TGFв, VEGF, а также хромогранина по сравнению с контрольной группой.

Найдены особенности морфологических проявлений фиброзно-кавернозного туберкулеза (ФКТ) у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинской области, заключающимися в большей выраженности деструктивных и фибротических изменений, снижении частоты выявляемости гранулематозного воспаления и наличии слабой местной лимфоидной инфильтрации, что косвенно может свидетельствовать о низком уровне развития клеточного иммунитета на фоне воздействия ионизирующего излучения. Выраженность деструктивных процессов и фиброзирования при ФКТ зависит от активности MMPs, их ингибиторов, факторов ангиогенеза, множества факторов роста и других цитокинов, содержание которых значительно выше у больных ФКТ, проживавших в условиях повышенной радиации. Клетки гранулем и СD68+ макрофаги воспалительного инфильтрата являются основным тканевым источником ММР-1, -2, -9 и TIMP-1 в очагах ФКТ.

Научная новизна работы также связана с установлением молекулярно-биологических особенностей предрака и рака легкого, развившихся в условиях повышенной радиации. Предрак легкого, возникший в условиях повышенной радиации, отличается наличием высокого потенциала к инвазивному росту за счет дисбаланса между экспрессией металлопротеиназ и их ингибиторов, а также активацией механизмов антибластомной защиты; усиленным ангиогенезом в строме подлежащих тканей, что также создает благоприятные условия для инвазивного роста трансформированного эпителия; повышением уровня пролиферации эпителия за счет возможной активации факторов роста под действием ММРs и их усиленной продукции.

Рак легкого, возникший в условиях повышенной радиации развивается в более молодом возрасте по сравнению с контрольной группой и обладает высоким потенциалом к инвазивному росту за счет дисбаланса между экспрессией металлопротеиназ и их ингибиторов, подавления механизмов антибластомной защиты, усиления ангиогенеза в строме и в подлежащих тканях. Кроме того, предрак и РЛ, развившиеся в условиях повышенной радиации характеризуются частым развитием нейроэндокринной дифференцировки (НЭД) раковых клеток.

Практическая и теоретическая значимость работы

Полученные данные могут быть использованы в системе здравоохранения для проведения профилактики и дифференциальной диагностики ХДЗЛ, туберкулеза, а также предрака и РЛ, развившихся у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно загрязненных территориях, прогнозировании течения патологического процесса и разработке новых методов таргетной терапии. Исследование вокруг Семипалатинского полигона может быть полигоном для других подобных территорий в России, странах СНГ и во всем мире.

Материалы диссертации используются в практической работе при анализе биопсийного и аутопсийного материала, а также в преподавании - при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами по теме «Заболевания легких», «Патология, вызванная факторами окружающей среды», «Опухолевый рост» на кафедре патологической анатомии ММА имени И.М. Сеченова, на кафедре патологической анатомии Казахской Государственной медицинской Академии, Актюбинского медицинского университета в Казахстане, а также в работе биопсийной лаборатории.

Теоретическая значимость полученных данных связана с тем, что показана роль радиации в развитии не только предрака и рака легкого, но также ХДЗЛ и туберкулеза легких. Радиационное воздействие вносит вклад в патогенетические и морфологические особенности ХДЗЛ за счет фиброгенного, ангиогенного и канцерогенного воздействия на легочный эпителий, что сопровождается высокой экспрессией легочным эпителием и СD68+ макрофагами ММР-1, -2, -9 и TIMP-1. При этом легочная патология, развившаяся в условиях повышенной радиации отличается дисбалансом между ММРs и TIMPs, выраженным в разной степени при различных заболеваниях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Радиационное воздействие может считаться одним из этиопатогенетических факторов хронической легочной патологии, что подтверждается, во-первых, высокими показателями заболеваемости и смертности хронической обструктивной болезнью легких, бронхоэктатической болезнью, фиброзирующим альвеолитом в Семипалатинском регионе, во-вторых, выявленной тенденцией к снижению показателей заболеваемости и смертности после прекращения ядерных испытаний на Семипалатинском полигоне, начиная с 1992 г.

2. Радиационное воздействие вносит вклад в патогенетические и морфологические особенности ХДЗЛ за счет фиброгенного, ангиогенного и канцерогенного воздействия на легочный эпителий, что сопровождается высокой экспрессией легочным эпителием и СD68+ макрофагами ММР-1, -2, -9 и TIMP-1.

3. Фиброзно-кавернозный туберкулез у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинской области отличался большей выраженностью деструктивных и фибротических изменений, снижением частоты выявляемости гранулематозного воспаления и наличием слабой местной лимфоидной инфильтрации, а также высокой экспрессией клетками специфических гранулем, СD68+ макрофагами, легочным эпителием ММРs и TIMP-1.

4. Дисрегенераторные и предраковые изменения эпителия чаще встречались при хронической обструктивной болезни легких, бронхоэктатической болезни, фиброзирующем альвеолите у лиц, проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана, и отличались более высокой экспрессией эпителием ММР-1, -2, -9, TIMP-1, TGFв, VEGF, а также хромогранина по сравнению с контрольной группой. Предрак легкого, возникший в условиях повышенной радиации, отличается рядом молекулярных особенностей: наличием высокого потенциала к инвазивному росту за счет дисбаланса между экспрессией металлопротеиназ и их ингибиторов, усиленным ангиогенезом в подлежащих тканях, повышением уровня пролиферации и нейроэндокринной дифференцировкой эпителия.

5. Рак легкого, возникший в условиях повышенной радиации, характеризовался рядом особенностей по сравнению с контрольной группой: развитием рака легкого в более молодом возрасте; наличием высокого потенциала опухолевых клеток к инвазивному росту за счет дисбаланса между экспрессией металлопротеиназ и их ингибиторов, усилением ангиогенеза в строме подлежащих тканей, развитием нейроэндокринной дифференцировки в раковых клетках.

Апробация работы

Апробация работы проведена на кафедре патологической анатомии ММА им. И.М.Сеченова 25 апреля 2007 г. Результаты исследования докладывались и обсуждались на научных конференциях кафедры патологической анатомии ММА имени И.М. Сеченова, на обществе патологоанатомов г. Москвы (ноябрь 2006), на XIII, XIV и XVI Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2003, Москва, 2004, Санкт-Петербург, 2006), на ХХ и ХХI Европейских Конгрессах по патологии (Париж, Франция, 2005, Стамбул, Турция, 2007), на XII, XIV, XV и XVII Конгрессах Европейского респираторного общества (Стокгольм, Швеция, 2002, 2007, Глазго, Шотландия, 2004 г., Копенгаген, Дания, 2005), на XII Интернациональном конгрессе гисто- и цитохимии (Сан-Диего, Калифорния, 2004), на XXIV Интернациональном конгрессе интернациональной Академии патологов (Амстердам, Нидерланды, 2002, на Всемирной конференции по раку (Дублин, Ирландия, 2004), на Интернациональном конгрессе патологов (Игуассу, Бразилия, 2004), на V Интернациональном симпозиуме по терапии рака (Амстердам, Нидерланды, 2007), на II и III конгрессах Евроазиатского Респираторного общества (Санкт-Петербург, 2006, Астана, Казахстан, 2007).

Публикации.

По результатам исследования опубликовано 31 работа, из них 2 монографии, 12 публикаций в центральной печати РФ по медицине, 17 публикаций в международных медицинских журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы о результатах собственного исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка использованной литературы. Текст диссертации изложен на 261 страницах машинописного текста, иллюстрирован 27 таблицами и 26 рисунками, включая монтажи из микрофотографий. Библиографический указатель включает 383 литературных источника, в том числе 228 отечественных.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

Ретроспективно проанализированы данные отчетов органов здравоохранения по распространенности, смертности и заболеваемости органов дыхания у жителей Семипалатинского региона за период 1969-2003 г.г. Также было проведено скрининг-анкетирование 7274 жителей Семипалатинского региона. Скрининг-анкета была составлена с учетом климато-экологических особенностей обследуемого региона и состоит из двух частей: паспортные и клинические данные. Изучен 631 протокол вскрытий патологоанатомического бюро г. Семипалатинска с 1969 по 2003 г.г. с диагнозами ХДЗЛ.

Кроме того, проведено морфологическое (гистологическое) исследование архивного аутопсийного, операционного (удаленные легкие и их части) и биопсийного материала от 300 больных с ХДЗЛ, с детских лет до 2003 г. проживавших вблизи полигона и в течение длительного времени подвергавшихся воздействию радиации. В качестве контрольной группы использовался операционный и аутопсийный материал от 56 больных ХДЗЛ, из которых 22 человека проживали на территориях Казахстана с неизмененным радиационным фоном, а 34 - в Москве.

В иммуногистохимической части работы использовался архивный операционный (удаленные легкие и их части) и биопсийный материал от больных с хроническими диффузными заболеваниями легких (231 пациент), фиброзно-кавернозным туберкулезом (75), предраковыми процессами в легких (118), раком легкого (87). В качестве основной группы использовался материал от пациентов с детских лет до 2003 г. проживавших вблизи полигона и в течение длительного времени подвергавшихся воздействию радиации (годовая доза облучения превысила 0,1 бэр) (I группа). В качестве контрольной группы (II группа) использовался материал от пациентов, которые проживали на территориях Казахстана с неизмененным радиационным фоном и оперированных в клиниках Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова в 1993 - 2006 гг.

Таблица 1. МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Изучен операционный (удаленные легкие и их части) и биопсийный материал от 393 пациентов с хроническими заболеваниями легких и раком легкого, с детских лет до 2003 г. проживавших вблизи полигона (Табл. 1). У 118 пациентов данной группы были обнаружены предраковые изменения.

Использовались гистологические, гистохимические, иммуногистохимические методы. Проводилась статистическая обработка результатов исследования.

Гистологические и гистохимические методы исследования. Использованы залитые в парафин, предварительно фиксированные в 10% забуференном формалине кусочки опухолевой ткани. С каждого блока делались серийные срезы толщиной 3 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, альциановым синим, пикрофуксином по Ван Гизону, по Вейгерту на эластику, ставилась PAS-реакция и реакция Перлса на железо по общепринятым методикам. Диагноз заболеваний помимо автора, определялся 2 независимыми экспертами - патологоанатомами (Казахстана и ММА им. И.М.Сеченова).

Иммуногистохимические методы. Проводились на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм. Демаскировка антигена осуществлялась путем инкубации срезов в течение 20 минут в микроволновой печи при мощности 600 Вт в растворе 10 mM цитратного буфера с pH 6.0. В качестве первичных антител использовались моно- и поликлональные антитела мыши и кролика к хромогранину А (DAKO), ММР-1; ММР-2; ММР-9, TIMP-1 (Lab Vision, США), TGF-в (Biosource international, Калифорния, США), VEGF (DAKO), CD34 (DAKO), CD68 (DAKO), Ki-67 (DAKO). В качестве вторичных антител использовались биотинилированные антимышиные и антикроличьи иммуноглобулины (DAKO, LSAB+KIT, PEROXIDASE). В качестве фонового докрашивания использовался гематоксилин. Ставились контрольные реакции: позитивный контроль - тканевые срезы плаценты - NM-784A (Lab Vision), негативный контроль - без первичных антител.

По данным скрининг-анкетирования выявлено, что показатели заболеваемости ХОБЛ, БЭБ, ФА в Семипалатинском регионе значительно (в десятки раз) превышают среднестатистические данные по России (Рис. 1, 2).

Из анкетированных людей 5910 человек являлись практически здоровыми людьми, что составляет 81,25% опрошенных. Среди них 3520 человек имели факторы повышенного риска развития болезни, т.е. 59,56% анкетированных лиц были в стадии предболезненного состояния. ХДЗЛ наблюдались у 1364 человек, что составило 18,75% опрошенных. Таким образом, общее количество больных ХДЗЛ и лиц предболезненного состояния с повышенным риском составило 4884 человек или 78,31% анкетированных людей.

Рис. 1. Заболеваемость ХДЗЛ на 100 тыс. Рис. 2. Заболеваемость ХДЗЛ на 100 тыс.

*Здоровье населения России и деятельность учреждений здравоохранения в 1999 г. // Статистические материалы / Министерство Здравоохранения Российской Федерации. - Москва, 2000 г.

Анализ отчетов показал, что в период с 1992 по 2003 г.г. прослеживается тенденция к снижению заболеваемости ХДЗЛ, что может быть связано с прекращением взрывов с 1989 г. (Рис. 3).

На I этапе исследования изучали морфологическую и иммуногистохимическую характеристику ХОБЛ, БЭБ, ФА у лиц, проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинского региона и у лиц, проживавших на территориях Казахстана с неизмененным радиационным фоном и Москвы. Кроме того, в качестве контроля исследовалась легочная ткань без патологических изменений от пациентов, оперированных по поводу рака легкого.

Морфологическими особенностями основной группы пациентов можно считать более выраженные проявления неоангиогенеза, фиброза, накопление пылевых частиц, а также наличие разнообразных дисрегенераторных изменений эпителия, включая очаги нейроэндокринной гиперплазии (НЭГ).

ХОБЛ характеризовался развитием хронического катарального или гнойного бронхита с гиперплазией слизистых желез и бокаловидных клеток, выраженной лимфоплазмацитарной инфильтрацией с примесью палочкоядерных лейкоцитов (ПЯЛ), разрастанием грануляционной ткани с неоангиогенезом в собственной пластинке слизистой. Отмечались склероз и атрофия мышечного слоя в стенке бронха, явления хронической обструктивной центроацинарной эмфиземы легких. Основная группа пациентов отличалась от контрольной более выраженными явлениями неоангиогенеза, перибронхиального и интерстициального фиброза, отложениями пыли. Кроме того, было отмечено более частое обнаружение дисрегенераторных и предраковых изменений эпителия, включающих фокусы НЭГ. При окраске хромогранином НЭГ была выявлена в 5 случаях ХОБЛ I группы.

При БЭБ наблюдались цилиндрические и мешотчатые бронхоэктазы, часто напоминавшие крупные бронхогенные кисты, выраженный перибронхиальный и периваскулярный склероз с отложениями пыли. Микроскопически в полости бронхоэктаза обнаруживался экссудат и слущенный эпителий. В прилежащей легочной паренхиме - очаги обструктивной эмфиземы легких, выраженный перибронхиальный, периваскулярный и интерстициальный фиброз, неоангиогенез, отложения пыли. Однако в I группе пациентов преобладали перибронхиальный и периваскулярный фиброз с отложениями пыли, а также разнообразные дисрегенераторные, а в ряде случаев и предраковые изменения бронхиального эпителия, атрофические изменения желез с кистозной трансформацией бронхов. При окраске хромогранином - НЭГ в 2 случая БЭБ основной группы.

При ФА наблюдались экссудативно-продуктивное воспаление и интерстициальный фиброз на уровне респираторных отделов легких. В альвеолярных перегородках - явления отека, воспалительная инфильтрация, неоангиогенез и проявления склероза в разной степени выраженного, вплоть до формирования сотового легкого. В контрольной группе в просветах альвеол обнаруживались десквамированный эпителий, CD68+ альвеолярные макрофаги (МФ), лимфоидные элементы, а в очагах выраженного фиброзирования - миофибробластические фокусы, а также очаги аденоматозной гиперплазии эпителия, что позволило поставить диагноз обычной интерстициальной пневмонии. В основной группе пациентов выраженный интерстициальный фиброз сочетался со слабовыраженной лимфоплазмоцитарной инфильтрацией альвеолярных перегородок и отложениями пыли. В большинстве случаев легочный интерстиций был расширен, представлен фиброзной гиалинизированной тканью, содержащей сосуды со склерозированными стенками, очагами гемосидероза и антракоза, а также небольшими скоплениями лимфоцитов, плазматических клеток и МФ. При окраске по Ван Гизону обнаруживались грубые коллагеновые волокна красного цвета. Миофибробластические фокусы отсутствовали. К описанной картине можно добавить наличие многоядерных клеток как в эпителиальной выстилке альвеол и бронхиол, так и среди альвеолярных МФ. Нередко обнаруживались очаги с выраженными признаками атипической аденоматозной гиперплазии (ААГ). Описанные изменения не укладывались в картину известных идиопатических интерстициальных пневмоний. Анамнез заболевания, проживания на радиационно-загрязненных территориях, а также морфологические особенности в виде наличия многоядерных клеток позволили предположить диагноз радиационного фиброза легких.

На II этапе методом иммуногистохимии исследовались матриксные металлопротеиназы (ММРs) и их ингибиторы (TIMP-1), что позволило установить дисбаланс между ними в наибольшей степени выраженный в основной группе пациентов. Основным генератором ММРs и TIMP-1 при ХДЗЛ в обеих группах являлись CD68+ альвеолярные и интерстициальные МФ, а также ПЯЛ, эндотелий сосудов и, в меньшей степени, эпителий. ММРs во всех клетках в основной группе были значительно выше чем ММРs во всех клетках контрольной группы (р? 0,001) (Рис. 6а,б). MMPs и TIMP-1 при иммуногистохимическом исследовании выявлялись в цитоплазме клеток.

ММР-1. При ХДЗЛ обнаружено отличие в экспрессии данного фермента как по уровню, так и по локализации в двух исследуемых группах. В тканях больных I группы отмечалось повышение уровня экспрессии ММР-1 в МФ и ПЯЛ, эпителии, а также в эндотелии сосудов и фибробластических элементах стромы по сравнению со II группой (р? 0,05). Кроме того, в основной группе были найдены особенности экспрессии ММР-1 при различных вариантах ХДЗЛ. При ХОБЛ наибольшие значения экспрессии фермента обнаруживались в CD68+ МФ, ПЯЛ и бронхиальном эпителии (р? 0,001); при БЭБ - в CD68+ МФ и ПЯЛ; при ФА - в CD68+ альвеолярных МФ (р? 0,05) (см. рис. 6а,б).

ММР-2. В тканях больных ХДЗЛ основной группы отмечалось повышение уровня экспрессии ММР-2 по сравнению с контрольной группой практически во всех изученных клетках (р? 0,05). Кроме того, в основной группе были найдены особенности экспрессии ММР-2 при различных вариантах ХДЗЛ. При ХОБЛ наибольшие значения экспрессии фермента обнаруживались в бронхиальном эпителии (р? 0,01); при БЭБ - в CD68+ МФ и ПЯЛ; при ФА - в CD68+ альвеолярных МФ и эндотелии сосудов, в очагах неоангиогенеза (р? 0,05) (см. рис. 6а,б).

ММР-9. В основной группе пациентов с ХДЗЛ все показатели экспрессии фермента были достоверно выше, чем в контрольной группе (р? 0,001). При этом, в основной группе фермент экспрессировался во всех изученных клетках, в то время как в контрольной группе - только в CD68+ МФ и в эндотелии сосудов. При ХОБЛ и БЭБ I группы наибольшие и, практически, одинаковые уровни экспрессии фермента обнаружены в эпителии, МФ и ПЯЛ (р? 0,05); при ФА основным источником являлись альвеолярные МФ и эндотелий сосудов (р? 0,01) (см. рис. 6а,б).

Рис. 6. Гистограмма экспрессия ММРs, TIMP-1, VEGF и TGFв при ХДЗЛ.

*-эпителий бронхиальный

**-эпителий бронхиальный и альвеолярный

Условные обозначения: эпит. - эпителий; ФБ - фибробласты; сос. - сосуды; МФ - макрофаги инфильтрата.

TIMP-1. МФ и ПЯЛ являются основными продуцентами TIMP-1 при ХДЗЛ (р? 0,01). В тканях больных I группы отмечалось повышение уровня экспрессии TIMP-1 в МФ, эпителии, эндотелии сосудов и в фибробластах стромы по сравнению со II группой (р? 0,001). При ХОБЛ и БЭБ I группы наибольшие уровни экспрессии фермента обнаружены в бронхиальном эпителии, МФ и ПЯЛ (р? 0,01); при ФА основным источником являются альвеолярные МФ и эндотелий сосудов (р? 0,01), что ведет к ремоделированию стромы с развитием интерстициального фиброза (см. рис. 6а,б).

На III этапе изучался ангиогенез. Ангиогенез в легочном интерстиции оценивался нами по относительной плотности новообразованных сосудов, эндотелий которых экспрессировал CD34, экспрессии VEGF и MMP-2, участвующих в ангиогенезе.

VEGF выявлялся в цитоплазме клеток. Установлена экспрессия фактора роста как эпителиальными, так и стромальными клетками очагов. Основным источником VEGF являлись CD68+ МФ, эндотелий сосудов и фибробласты стромы. В основной группе VEGF экспрессировался в бронхиальном, бронхиолярном и альвеолярном эпителии, уровень экспрессии был выше, чем в контрольной (р? 0,001).

При ХОБЛ и БЭБ основными источниками VEGF являлись альвеолярные МФ, эндотелий сосудов, а также фибробласты стромы и бронхиальный эпителий; при ФА - альвеолярные МФ и эндотелий сосудов, и в значительно меньшей степени, альвеолярный эпителий и фибробласты стромы (Рис. 6в, г).

CD34 экспрессировался эндотелиальными клетками сосудов капиллярного типа в очагах неоангиогенеза, что позволило рассчитывать нам среднюю плотность новообразованных сосудов. В основной группе средняя плотность сосудов в целом была выше, чем в контрольной группе при всех нозологиях (р? 0,05). Наиболее высокие цифры получены при ФА основной группы.

TGFв в основной группе был больше чем в контрольной (р? 0,01). Основными источниками являлись фибробласты стромы, МФ и эпителий. При ХОБЛ - МФ и ПЯЛ, строма, эпителий; при БЭБ - строма, МФ и ПЯЛ, эпителий; при ФА - МФ, эпителий, фибробласты стромы. Особенности экспрессии TGFв и объясняют морфологическую специфику фиброза при разных ХДЗЛ, а именно при ХОБЛ и БЭБ - перибронхиальный и периваскулярный фиброз, а при ФА - интерстициальный фиброз. Подтверждением сделанных выводов являются данные по ММР-2 (см. рис. 6в, г).

На IV этапе мы изучали варианты дисрегенераторных процессов в эпителии при ХДЗЛ: очаги бокаловидноклеточной трансформации (БКТ), базальноклеточную гиперплазию (БКГ) без атипии и с атипией - АБГ, плоскоклеточную метаплазию (ПМ), дисплазию III бронхиального эпителия (ДIII), атрофию, атипическую аденоматозную гиперплазию (ААГ) без/на фоне фиброза и гиперплазию нейроэндокринных клеток (ГНК), раздельно в клетках эпителия, стромы, сосудах и клетках воспалительного инфильтрата.

Гиперплазия нейроэндокринных клеток обнаружена в основном у больных первой группы и на светооптическом уровне имела сходство с базальноклеточной гиперплазией. Дифференциальная диагностика нейроэндокринной гиперплазии с базальноклеточной гиперплазией на светооптическом уровне была возможна лишь при реакции на выявление хромогранина-А. При этом в клетках иммуногистохимически выявлялся хромогранин-А. Ki-67-положительные клетки, как правило, экспрессировали хромогранин и располагались в базальных и парабазальных зонах.

При атипической аденоматозной гиперплазии, обнаруженной нами только в сотовом легком, отмечается пролиферация разнообразных клеток: цилиндрических (клетки Клара), кубических (альвеолоциты 2-го типа), слизистых, нейроэндокринных клеток, выстилающих альвеолы, чаще в очагах пневмосклероза в сотовом легком в исходе ИФА и вокруг абсцесса с формированием тубулярных, альвеолярных и сосочковых структур, иногда с явлениями плоскоклеточной метаплазии, что также описывается в литературе [Коган Е.А., Парамонова Н.Б., 2003], увеличение размеров клеток, появление признаков клеточного и ядерного полиморфизма, в пролифератах появляются многорядные и сосочковые структуры. Ki-67-положительные клетки выявлялись в значительно большем количестве и соответствовали, преимущественно, слизьпродуцирующим, нейроэндокринным, безреснитчатым цилиндрическим клеткам и альвеолоцитам 2-го типа.

При БКТ, БКГ, атрофии и ПМ экспрессия ММР-1, -2, -9, TIMP-1, а также Ki-67 была низкой и не отличалась достоверно от контроля (неизмененного бронхиального эпителия) (Рис. 7). При этом, наиболее высокий уровень экспрессии ММР-1 в эпителиальных клетках отмечался при АБГ и ДIII (р? 0,001). Наиболее высокий уровень экспрессии ММР-2 в ДIII, а ММР-9 отмечался при АБГ и ПМ (р? 0,001). Наиболее высокий уровень экспрессии TIMP-1 отмечался при ДIII (р? 0,01).

Рис. 7. Гистограмма экспрессия ММРs, TIMP-1, VEGF, TGFв, СD34, СD68, хромогранина и Ki-67 в дисрегенераторных изменениях эпителия при ХДЗЛ.

Процентное содержание CD68 положительных клеток среди клеток инфильтрата при ДIII составляло 9 и 10% в исследованных группах пациентов (р? 0,05). Отмечался относительный рост процентного содержания CD68 положительных клеток до 31% и до 17% среди клеток инфильтрата в основной группе пациентов с АБГ (р? 0,001) и ГНК (р? 0,001) по сравнению с контрольной группой, где он составил по 3%. При ААГ процентное содержание CD68 положительных клеток среди клеток инфильтрата составляло 8 и 15% в I и во II группах пациентов (р? 0,001). Высокий уровень экспрессии VEGF в АБГ и ГНК коррелировал с высокой плотностью новообразованных сосудов (р? 0,001).

Плотность сосудов уменьшалась в очагах от АБГ, ГНК, ДIII, БКТ до ААГ. В образцах ткани контрольной группы больных, проживавших на территориях с неизмененным радиационным фоном, плотность сосудов была ниже в АБГ (р? 0,01) и ГНК (р? 0,001) по сравнению с основной группой (см. рис. 7). По вновь изученным маркерам АБГ, ГНК, ДIII и ААГ были близки по нашим данным к раку легкого [Сагиндикова Г.Е., Коган Е.А., 2007].

Резюмируя полученные данные исследования по морфологическим и молекулярно-биологическим особенностям ХДЗЛ у лиц, проживавших длительное время на радиационно-загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана, следует подчеркнуть наличие у них выраженного фиброза легочного интерстиция, поражения микрососудов, приводящего к неоангиогенезу, выраженной макрофагальной реакции и дисрегенераторных изменений эпителия, включая НЭГ эпителия.

Как показало проведенное нами исследование, в процесс фиброзирования и неоангиогенеза вовлекаются разнообразные клетки, прежде всего, альвеолярные и интерстициальные макрофаги, ПЯЛ, эндотелий сосудов, фибробластические элементы стромы, а также бронхиальный, бронхиолярный и альвеолярный эпителий, продуцирующие факторы, способствующие новообразованию сосудов и склерозу: VEGF, TGFв, MMP-2. Нами установлена тенденция к росту экспрессии TIMP-1 параллельно с ростом экспрессии ММР-1, -2, -9. Однако, судя по доминированию процессов фиброзирования над распадом, что обнаруживается при морфологическом исследовании, можно предположить, что, в целом, в основной группе экспрессия TIMP-1 клетками преобладает над продукцией MMPs. Данное предположение подтверждается экспериментальными данными [Kolb M., 2002, Suga M., 2000], показывающими повышение экспрессии TIMP1, 2 при пневмосклерозе у мышей. Таким образом, следует сделать вывод, что развитие фиброза связано не столько с продукцией компонентов экстрацеллюлярного матрикса, сколько с интенсивностью его деградации. Выявленное нами значительное усиление экспрессии TGFв эпителиальными и макрофагальными элементами у пациентов основной группы имеет особое регуляторное значение в развитии фиброза, поскольку не только стимулирует коллагеногенез, но и способствует активации ингибиторов металлопротеиназ [Suga M., 2000]. Особенности экспрессии TGFв разными клетками и объясняют морфологическую специфику фиброза при разных ХДЗЛ, а именно при ХОБЛ и БЭБ - перибронхиальный и периваскулярный фиброз, а при ФА - интерстициальный фиброз. Подтверждением сделанных выводов являются данные по экспрессии ММР-2.

Следует отметить, что MMPs играют важнейшую роль в развитии и прогрессировании ХДЗЛ, таких как ХОБЛ, БЭБ, ФА. При этом, основным источником MMPs являются макрофаги и палочкоядерные клетки - триггерные клетки при ХОБЛ и БЭБ, а также альвеолярные МФ и эндотелий сосудов при ФА, что отчасти определяет различные структурные перестройки в легочной ткани; ХОБЛ, БЭБ, ФА у лиц, проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана, отличались от контрольной группы более выраженным фиброзом, неоангиогенезом и дисрегенераторными изменениями эпителия, что сочеталось с высокой экспрессией MMP-1, -2, -9, TIMP-1, TGFв, VEGF; дисрегенераторные изменения эпителия чаще встречались при ХОБЛ, БЭБ, ФА у лиц, проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинской области Казахстана, и отличались более высокой экспрессией эпителием MMP-1, -2, -9, TIMP-1, TGFв, VEGF, а также хромогранина.

Сочетание выраженного ангиогенеза и фиброза легких не случайно в нашей группе больных. Более того, можно предположить, что неоангиогенез предшествует склеротическим изменениям. Ранее было установлено, что в условиях радиационного поражения фиброз начинается с поражения мелких сосудов (капилляры и артериолы) в различных тканях [Hasleton P.S. 1996, Anderson R.E., 1996]. Наши данные подтверждаются данными других исследований, в которых выявлена сосудистая патология, индуцированная радиацией. Авторы показали, что в регионе Семипалатинского испытательного полигона длительное воздействие ионизирующих излучений существенно изменяет деятельность сосудистой стенки, при этом нейроциркуляторная дистония сохраняется даже через 15-30 лет после прекращения облучения [Гусев Б.И., 1994, Чайжунусова Н.Ж., 1993].

В развитие дисрегенераторных процессов в легких безусловную роль вносит и иммунодепрессия, наведенная радиацией. Иммунная система организма человека - главный механизм противоопухолевой защиты и, в то же время, одна из основных мишеней для воздействия различных патогенных факторов внешней среды. Среди последних в настоящее время ведущую роль играют воздействия лучистой энергии различных диапазонов и интенсивности - от радиоволн до жесткого гамма-излучения, оказывающих угнетающее действие как на механизмы регуляции иммунитета от субклеточного до центрального уровня, так и непосредственное - на иммунокомпетентные клетки и их предшественников [Чайжунусова Н.Ж., 1993, Журова М.В., 1991].

3. Морфологические и молекулярно-биологические особенности фиброзно-кавернозного туберкулеза легких населения Семипалатинского региона Казахстана с повышенным уровнем радиации.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о существовании морфологических и иммуногистохимических особенностей ФКТ у больных Семипалатинского района, длительно проживавших на радиоактивно загрязненных территориях.

К морфологическим особенностям ФКТ больных основной группы следует отнести большую выраженность деструктивных и фибротических изменений, снижение частоты выявляемости гранулематозного воспаления и наличие слабой местной лимфоидной инфильтрации по сравнению с контрольной группой, что косвенно может свидетельствовать о низком уровне развития клеточного иммунитета у лиц, проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях [Пузик В.И., 1984].

При окраске по Цилю-Нильсену микобактерии туберкулеза выявляются в 25% случаев как основной, так и контрольной групп. Процентное содержание CD-68 положительных макрофагов среди клеток мононуклеарного инфильтрата при ФКТ выше в основной группе (74%) по сравнению с контрольной группой (60%). Полученные данные подтверждаются исследованиями иммунного статуса больных туберкулезом Семипалатинского региона, у которых установлено наличие иммунодефицита, обусловленного, как полагают авторы, туберкулезом и воздействием ионизирующего излучения [Igembaeva K.S., 2001]. Выраженный фиброз в очагах ФКТ также можно связать с совместным эффектом туберкулезного и радиационного повреждения. Кроме того, в группе пациентов из Семипалатинского региона хромогранин был значительно выше и составлял в среднем 11% среди эпителиальных клеток. В контрольной группе больных хромогранин выявлялся в отдельных случаях ФКТ в единичных клетках бронхиального эпителия.

Изменения бронхиального эпителия в очагах ФКТ как в основной, так и в контрольной группах, включали в себя разнообразные дисрегенераторные изменения, которые рассмотрены нами в разделе по предраку легкого. При этом среди прочих дисрегенераторных процессов при ФКТ преобладала ПМ.

Помимо морфологических были обнаружены иммуногистохимические особенности ФКТ, развившегося у лиц в течение длительного времени проживавших в Семипалатинской области и подвергавшихся воздействию радиации I группы.

Как было установлено нами ранее, основную часть легочного интерстиция в условиях хронического воспаления и фиброза составляют коллагены III и IV типа, которые могут деградироваться матриксными металлопротеиназами определенного типа [Taylor JL, 2006, Rivera-Marrero CA, 2000, Chang JC, 1996], локализующимися в цитоплазме клеток.

Проведенное исследование показало, что основным тканевым источником ММР-1, -2, -9 и TIMP-1 в очагах ФКТ являются клетки гранулем и СD68+ макрофаги воспалительного инфильтрата (Рис. 8).

Обнаруженная высокая активность MMPs в клетках гранулемы и макрофагальном инфильтрате может обеспечивать с одной стороны миграцию клеток в очаг воспаления, что приводит к образованию гранулем [Taylor J.L., 2006], а с другой - деструкцию экстрацеллюлярного матрикса и базальных мембран и развитию казеозного некроза. Судя по тому, что в основной группе преобладали деструктивные изменения и реже развивались гранулемы, по сравнению с контрольной группой, а уровни активности MMPs в их клетках были значительно выше, можно предположить, что при различных уровнях ММРs может смещаться баланс между этими процессами. Так, при меньшей активности MMPs доминируют процессы формирования гранулем, при более высокой - казеоза.

ММР-1 расщепляет интерстициальные коллагены. В основной группе наибольшее количество ММР-1 зарегистрировано нами в цитоплазме эпителиоидных и гигантских многоядерных клеток Пирогова-Лангханса гранулем, CD68+ макрофагах инфильтрата, а, кроме того, в бронхиальном эпителии вблизи гранулем (Рис.8а). В контрольной группе ММР-1 обнаруживается только в клетках гранулемы и на достоверно более низком уровне (р? 0,001).

ММР-2. В тканях больных основной группы отмечалось повышение содержания ММР-2 в цитоплазме клеток. Основным источником ММР-2 при ФКТ является эндотелий сосудов в очагах поражения, и в меньшей степени фибробласты, эпителиоидные и гигантские многоядерные клетки Пирогова-Лангханса гранулем, макрофаги инфильтрата, а, кроме того, бронхиальный эпителий вблизи гранулем (Рис.8б). В контрольной группе обнаруживается только в фибробластах и на более низком уровне (р? 0,01).

ММР-9. Источником ММР-9 основной группы в очагах ФКТ являются эпителий, эпителиоидные и гигантские многоядерные клетки Пирогова-Лангханса гранулем, CD68+ макрофаги инфильтрата (Рис.8в). В контрольной группе ММР-9 выявляются только в цитоплазме клеток гранулемы и клетках инфильтрата на более низком уровне (р? 0,001).

Рис. 8. Матриксные металлопротеиназы (MMP-1,-2,-9), их ингибитор TIMP-1 и маркеры ангиогенеза (VEGF) и фиброза (TGF-в) в клетках различных очагов фиброзно-кавернозного туберкулеза.

Условные обозначения: (см. рис. 6.); эп. Кл, П-Л - эпителиоидные клетки и клетки Пирогова-Лангханса гранулем.

ТIMP-1 при иммуногистохимическом исследовании выявляется также в цитоплазме клеток. В основной группе ТIMP-1 низкий, встречается в эпителии и в следовых количествах в гигантских многоядерных клетках Пирогова-Лангханса гранулем и CD68+ макрофагах инфильтрата (Рис.8г). В контрольной группе ТIMP-1 обнаруживаются только в клетках гранулем и на более низком уровне (р? 0,01).

Проведенное исследование показало, что основным тканевым источником ММР-1, -2, -9 и TIMP-1 в очагах ФКТ являются клетки гранулем и СD68+ макрофаги воспалительного инфильтрата. Обнаруженная высокая активность MMPs в клетках гранулемы и макрофагальном инфильтрате может обеспечивать с одной стороны миграцию клеток в очаг воспаления, что приводит к образованию гранулем, а с другой - деструкцию экстрацеллюлярного матрикса и базальных мембран и развитию казеозного некроза. Судя по тому, что в основной группе преобладали деструктивные изменения и реже развивались гранулемы, по сравнению с контрольной группой, а уровни активности MMPs в их клетках были значительно выше, можно предположить, что при различных уровнях ММРs может смещаться баланс между этими процессами. Так, при меньшей активности MMPs доминируют процессы формирования гранулем, при более высокой - казеоза. Наши данные совпадают с результатами исследований, в которых показано, что образование каверн напрямую связано с активацией экспрессии генов ММР-1 и ММР-7. При этом установлено, что усиление образования MMP-2 и ММР-9 в моноцитах гранулемы стимулируется рядом цитокинов, прежде всего TNF-б. Ингибиторы MMPs, такие как ВВ-94, стимулируют фиброзирование и подавляют миграцию моноцитов в ходе образования гранулем. В макрофагальном инфильтрате основной группы обнаруживается экспрессия MMPs и TIMP-1 в отличие от контрольной группы, где выявлена активность только MMP-1 и -9.

Как показало проведенное исследование, активность MMP- 2 связана не только с деструкцией тканей при ФКТ, но и с процессами неоангиогенеза и фиброза, что подтверждается наиболее высокими показателями ММР-2 в эндотелии сосудов и в фибробластах стромы. При этом в основной группе эти процессы выражены достоверно выше, что может указывать на воздействие, потенциирующее фиброз как туберкулезного, так и радиационного факторов у пациентов Семипалатинского региона.