Размещено на http://www.allbest.ru/

ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА ПОРАЖЕНИЯ ПОЧЕК У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1-ГО ТИПА

14.00.05 -- внутренние болезни 14.00.03 -- эндокринология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

КЛИМОНТОВ ВАДИМ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Новосибирск 2008

Работа выполнена в Новосибирском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Бондарь Ирина Аркадьевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Барбараш Ольга Леонидовна

доктор медицинских наук, профессор Галенок Валерий Александрович

доктор медицинских наук, профессор Нелаева Алсу Асатовна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Эндокринологический научный центр Росмедтехнологий (г. Москва)

Защита диссертации состоится «___» _______________ 2008 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.062.02 при Новосибирском государственном медицинском университете Росздрава по адресу: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета Росздрава

Автореферат разослан «____»_____________ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Дробышева В. П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сахарный диабет (СД) является одной из наиболее важных проблем современной клинической медицины. Рост распространенности СД в конце XX - начале XXI века приобрел характер эпидемии (Zimmet P. et al., 2001). По экспертным оценкам, численность больных СД в мире к 2030 году превысит 360 миллионов человек (Wild S. et al., 2004). В Российской Федерации число зарегистрированных больных СД за последние 15 лет удвоилось и в настоящее время составляет более двух миллионов (Дедов И. И., Балаболкин М. И., 2005). Медико-социальное значение СД как заболевания с ранней инвалидизацией и высокой смертностью определяется его хроническими осложнениями.

Диабетическая нефропатия (ДН) - одно из наиболее частых, тяжелых и прогностически неблагоприятных осложнений СД. В последние годы ДН заняла лидирующие позиции среди причин терминальной почечной недостаточности в индустриально развитых странах (Harvey J. N., 2003; Rossing P., 2005). Наиболее тяжелое течение ДН отмечается при СД 1-го типа, при котором клинически выраженное поражение почек развивается у 30 - 50 % больных. Уремия является наиболее частой, после сердечно-сосудистых катастроф, причиной смерти больных СД 1-го типа (Шестакова М. В. и соавт., 2001; Morrish N. J. et al., 2001). Неудовлетворительные результаты лечения ДН связаны со сложностью патогенеза, длительным бессимптомным течением, поздней диагностикой.

По современным представлениям, ведущую роль в формировании ДН играет гипергликемия и связанные с ней нарушения метаболизма: неферментативное гликирование, дислипидемия, оксидативный стресс и другие, а также артериальная и внутриклубочковая гипертензия (Дедов И. И., Шестакова М. В., 2000, 2006; Нелаева А. А. и соавт., 1998, 2003; Cooper M. E. et al., 1998, 2001; Schrijvers B. F. et al., 2004; Wolf G., 2004; Fioretto P. et al., 2006; Forbes J. M. et al., 2007). В последнее десятилетие обсуждается участие иммуновоспалительных реакций в развитии диабетического поражения почек (Бондарь И. А., 1997; Галенок В. А., Жук Е. А., 1998; Mezzano S. et al., 2004; Сhow F. Y. et al., 2005, 2006).

Несмотря на интенсивные исследования, многие аспекты формирования ДН, особенно ее допротеинурических стадий, недостаточно ясны. В частности, требуют изучения взаимосвязи между особенностями клинического течения СД, поражениями различных внутренних органов, нарушениями метаболизма, гемодинамики и начальными структурно-функциональными изменениями в почках. Необходимо определить значимость изменений обмена внеклеточного матрикса, роль различных факторов роста и цитокинов в развитии начальных стадий ДН. Требует доказательств значение воспалительных реакций в формировании нефросклероза у пациентов с СД. В числе актуальных задач - определение факторов, определяющих темпы развития ДН, и выявление новых диагностических маркеров данного осложнения. Разработка этих вопросов имеет принципиальное значение для оптимизации подходов к ранней диагностике и профилактике ДН и может рассматриваться как решение важной научной проблемы. Указанные положения определили цель и задачи исследования.

Цель исследования: определить особенности формирования и диагностические маркеры начальных этапов поражения почек у больных сахарным диабетом 1-го типа.

Задачи исследования:

1. Дать характеристику поражений внутренних органов, нарушений метаболизма и гемодинамики у больных сахарным диабетом 1-го типа с начальными стадиями нефропатии.

2. Изучить начальные структурно-функциональные изменения в почках при сахарном диабете 1-го типа и определить их соотношения с клиническими особенностями заболевания.

3. Оценить диагностическую значимость изменений обмена компонентов внеклеточного матрикса и мочевой экскреции фиброгенных факторов роста у больных с диабетической нефропатией.

4. Определить роль изменений почечной гемодинамики в формировании разных стадий диабетической нефропатии.

5. Установить механизмы развития и определить маркеры хронического воспаления в почках у пациентов с диабетической нефропатией.

6. Выявить факторы риска раннего развития нефропатии у больных сахарным диабетом 1-го типа.

Научная новизна. В комплексном исследовании с применением клинических, морфологических, лабораторных методов выявлены особенности формирования начальных стадий ДН и определены возможности ранней диагностики ДН у больных СД 1-го типа.

Доказано, что формирование начальных этапов нефропатии у больных СД 1-го типа с нормальной экскрецией альбумина с мочой и микро-альбуминурией определяется индуцируемыми гипергликемией изменениями дифференцировки и синтетической функции клеток почечных клубочков и канальцев, которые приводят к нарушению обмена компонентов внеклеточного матрикса и развитию хронического низкоинтенсивного воспаления в почках. сахарный диабет нефропатия почечный

Выявлены новые закономерности морфофункциональных изменений почек на начальных стадиях ДН: установлены прямые взаимосвязи между повышением альбуминурии и развитием перигломерулярного склероза, уменьшением относительного числа подоцитов в клубочках, утолщением и ретракцией малых отростков подоцитов, уменьшением числа фенестр эндотелия капилляров клубочков, ультраструктурными изменениями эпителиоцитов канальцев, атрофией канальцевого эпителия, склерозом интерстиция и артериол.

Показано, что формирование начальных этапов гломерулосклероза сопровождается аккумуляцией минорных (IV и VI тип) и появлением интерстициальных (I и III тип) коллагенов в клубочках, а развитие тубулоинтерстициального склероза характеризуется преимущественным накоплением коллагенов III и IV типа в базальных мембранах (БМ) канальцев и в интерстиции почек. Возрастание интенсивности синтеза коллагена при СД не компенсируется повышением активности коллагенолитических ферментов, что создает условия для аккумуляции коллагенов в почках.

Показано возникновение нарушений обмена сульфатированных гликозаминогликанов (ГАГ) на начальных стадиях ДН, установлена определяющая роль гипергликемии в развитии этих нарушений. Определена информативность исследования фракционного состава ГАГ мочи в ранней диагностике ДН. Показано, что появление микро- и макроальбуминурии связано с увеличением доли гепарансульфата и дерматансульфата в составе экскретируемых фракций ГАГ.

Определена диагностическая значимость исследования мочевой экскреции фиброгенных факторов роста: трансформирующего фактора роста (ТФР-), инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1), фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) на начальных стадиях нефропатии у больных СД 1-го типа. Установлено, что увеличение мочевой экскреции данных факторов отражает процесс развития диабетического нефросклероза.

Показано значение клубочковой гиперфильтрации для раннего (в первые 5 лет после клинической манифестации СД 1-го типа) развития микроальбуминурии. Установлено значение артериальной гипертензии (АГ), анемии, снижения массы тела, увеличения резистивных свойств почечных артерий как факторов, способствующих снижению фильтрационной функции почек при СД 1-го типа.

Впервые определена роль воспаления в развитии начальных стадий нефропатии у больных СД. Обнаружено усиление экспрессии молекул межклеточной адгезии (ICAM-1) в клетках почечных канальцев и клубочков, а также появление СD-68-позитивных моноцитов/макрофагов в интерстиции почек у больных СД 1-го типа с нормо- и микроальбуминурией. Установлена значимость исследования уровня sICAM-1 в сыворотке крови, а также мочевой экскреции провоспалительных цитокинов: интерлейкина-1 (IL-1), моноцитарного хемоаттрактатного протеина-1 (МСР-1), хемокина, экспрессируемого и секретируемого Т-клетками при активации (RANTES), в качестве диагностических маркеров хронического низкоинтенсивного воспаления в почках при СД. Показана роль гипергликемии, активации синтеза ростовых факторов, анемии в развитии воспалительных реакций в почках при СД. Сформулирована новая концепция развития ДН, рассматривающая хроническое воспаление как важное звено в развитии нефросклероза.

Практическая значимость работы заключается в выявлении клинических и морфофункциональных особенностей, новых диагностических маркеров начальных стадий ДН.

Показано, что формирование ДН у больных СД 1-го типа характеризуется ранним развитием диастолической или систолодиастолической АГ, анемии, гипергомоцистеинемии, тесной ассоциацией с кардиоваскулярной автономной нейропатией, отсутствием ночного снижения артериального давления (АД), сниженной вариабельностью ритма сердца (ВРС), изменением геометрии и нарушением диастолической функции левого желудочка сердца. Выявленные особенности необходимо учитывать при диспансерном наблюдении и клиническом ведении больных СД 1-го типа.

Оптимизированы подходы к ранней диагностике ДН. Предложены новые неинвазивные методы выявления нефропатии, основанные на определении мочевой экскреции метаболитов компонентов внеклеточного матрикса (пептидно-связанный, свободный гидроксипролин, сульфатированные ГАГ) и фиброгенных факторов роста (ТФР-, ИФР-1, ФРЭС). Разработаны критерии диагностики хронического низкоинтенсивного воспаления в почках при СД. В качестве маркеров данного процесса предложено определение sICAM-1 в сыворотке крови, а также исследование IL-1 и хемокинов (МСР-1 и RANTES) в моче.

Определены наиболее ранние морфологические критерии ДН. Показано значение иммуногистохимического исследования коллагенов I, III, IV и VI типа в биоптатах почек для диагностики начальных этапов диабетического нефросклероза. Установлены возможности типирования CD68-позитивных моноцитов/макрофагов и ICAM-1 для выявления воспаления в почках при СД.

Выделены факторы риска раннего развития микроальбуминурии (в первые 5 лет болезни) и протеинурии (в первые 10 лет) у больных СД 1-го типа. Показано, что быстрому развитию ДН способствует не только гипергликемия, но и клубочковая гиперфильтрация, раннее формирование АГ, дислипидемия, окислительный стресс, повышенная продукция фиброгенных факторов роста и цитокинов. Обоснован комплексный подход к профилактике ДН, основанный на контроле гликемии, дислипидемии, системной и внутриклубочковой гипертензии, оксидативного стресса, метаболизма внеклеточного матрикса и хронического воспаления в почках.

Внедрение результатов исследования. Результаты работы внедрены в практику работы Новосибирского областного диабетологического центра, отделения эндокринологии Государственной Новосибирской областной клинической больницы. Основные фрагменты работы используются в учебном процессе (лекции и практические занятия по эндокринологии и внутренним болезням) в Новосибирском государственном медицинском университете (НГМУ). По материалам диссертации написана монография «Почки при сахарном диабете: патоморфология, патогенез, ранняя диагностика, лечение» (Новосибирск, 2008), учебное пособие для врачей и студентов «Диабетическая нефропатия» (Новосибирск, 2008), информационное письмо для врачей (Новосибирск, 2004).

Положения, выносимые на защиту:

1. Темпы развития начальных этапов нефропатии у больных СД 1-го типа определяются индуцируемыми гипергликемией нарушениями дифференцировки и синтетической функции клеток почечных клубочков и канальцев, нарушениями обмена компонентов внеклеточного матрикса, наличием артериальной гипертензии, клубочковой гиперфильтрации, дислипидемии, хроническим воспалением в почках.

2. Нефрокардиальный континуум у больных СД 1-го типа начинает формироваться на допротеинурических стадиях нефропатии, его компонентами являются: артериальная гипертензия, дислипидемия, анемия, кардиоваскулярная автономная нейропатия со снижением вариабельности ритма сердца, гипертрофия и диастолическая дисфункция левого желудочка сердца.

3. Развитие диабетического нефросклероза характеризуется качественными и количественными изменениями состава коллагена в клубочках и в интерстиции почек, нарушением равновесия между синтезом и распадом коллагена, сложными нарушениями обмена сульфатированных гликозаминогликанов, усилением синтеза фиброгенных факторов роста (ТФР-, ИФР-1, ФРЭС), окислительной модификацией белков.

4. Формирование диабетической нефропатии сопровождается развитием хронического низкоинтенсивного воспаления в почках, которое характеризуется провоспалительной активацией клеток клубочков и канальцев, миграцией в почки моноцитов/макрофагов, ростом содержания sICAM-1 в крови, увеличением мочевой экскреции провоспалительных цитокинов (IL-1, MCP-1, RANTES).

Исследование выполнено на кафедре эндокринологии (зав. - д. м. н., профессор И. А. Бондарь) НГМУ на базе Государственной Новосибирской областной клинической больницы. Отдельные фрагменты работы выполнялись на кафедре патологической анатомии (зав. - академик РАМН, д. м. н., профессор В. А. Шкурупий) НГМУ и в группе биохимии (зав. - ст. н. с. А. Б. Пупышев) ЦНИЛ НГМУ, в лаборатории клинической биофизики (зав. - д. м. н. Л. Б. Ким) Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, в лаборатории ультраструктурных исследований (зав. - д. б. н., профессор Н. П. Бгатова) НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, в Новосибирском областном клиническом диагностическом центре, в ООО «Лабораторная диагностика». Автор выражает искреннюю благодарность за поддержку и квалифицированную помощь научному консультанту д. м. н., профессору И. А. Бондарь, сотрудникам кафедр и учреждений, принимавшим участие в совместных исследованиях, врачам клиники.

Протокол исследования одобрен Комитетом по этике НГМУ (протокол заседания № 1/11 от 14. 11. 2002).

Апробация работы. Материалы диссертации представлены в виде докладов на 37-м, 38-м, 40-м, 41-м и 43-м конгрессах Европейской ассоциации по изучению сахарного диабета (EASD: Глазго, 2001; Будапешт, 2002; Мюнхен, 2004; Афины, 2005; Амстердам, 2007), на 18-м конгрессе Международной диабетической федерации (IDF: Париж, 2003), на первых международных курсах последипломного образования EASD (Санкт-Петербург, 2007), на IV и V Всероссийских конгрессах эндокринологов (Санкт-Петербург, 2001; Москва, 2006), на 3-м и 4-м Всероссийских диабетологических конгрессах (Москва, 2004, 2008), на Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая эндокринология -- достижения и перспективы» (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), на Второй Сибирской конференции эндокринологов (Красноярск, 2003), на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной эндокринологии» (Новосибирск, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 70 научных работ, в том числе одна монография, 23 работы - в ведущих научных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики больных, дизайна и методов исследования, шести глав собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 352-х страницах, содержит 67 таблиц, 56 рисунков. Список литературы включает 728 источников (69 отечественных и 659 иностранных).

ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ, ДИЗАЙН И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных. Обследовано 345 больных СД 1-го типа, в том числе 152 мужчины и 193 женщины, от 15 до 60 лет (средний возраст - 30,1 ± 10,4 года). Длительность заболевания до пяти лет включительно имели 140 больных, у 43-х из них длительность диабета не превышала одного года. У 92-х пациентов длительность СД составила от 6-ти до 10-ти лет, у 85 -- от 11-ти до 20-ти лет, у 28-ми - свыше 20-ти лет. Кетоацидотические комы в анамнезе имели 77 пациентов, гипогликемические комы - 43. 9 больных поступили в клинику в состоянии кетоацидоза. Cредний уровень НbА_1с составил 10,0 ± 2,7 %. Уровень НbА_1с менее 7 % имели 11,9 % обследованных, у остальных пациентов значения были повышены. Средняя доза инсулина составила 0,67 ± 0,18 ЕД/кг/сут.

Диабетическая ретинопатия выявлена у 185-ти человек (53,6 %), периферическая полинейропатия - у 243-х (70,4 %), кардиоваскулярная автономная нейропатия - у 195-ти (56,5 %), стеатоз печени - у 53-х (15,4 %), катаракта -- у 32-х (9,3 %), макроангиопатия нижних конечностей - у 30-ти (8,7 %), миокардиодистрофия - у 26-ти (7,5 %), синдром диабетической стопы с трофическими язвами - у 19-ти пациентов (5,5 %).

Распределение больных на группы проводили в зависимости от выраженности ДН на основании классификации И. И. Дедова и М. В. Шестаковой (2000). Основные группы составили больные с нормальной альбуминурией (1-я группа, 138 человек) и с микроальбуминурией (2-я группа, 135 человек), у остальных диагностирована ДН на стадии протеинурии или додиализная ХПН (3-я группа, 72 человека). Клиническим проявлением нефропатии у больных последней группы являлись отеки (51 пациент), в том числе в рамках нефротического синдрома (13 больных). Уровень креатинина крови у больных с ХПН (n = 29) составил 226,0 ± 147,7 мкмоль/л, расчетная СКФ - 43,4 ± 23,4 мл/мин/1,73 м². У большинства этих пациентов (19 человек) имела место 3-я стадия хронической болезни почек по классификации «K/DOQI» (2002), у семи -- 4-я стадия, у трех пациентов - 5-я стадия.

Дизайн исследования представлен на рисунке 1. Основная часть данных получена в одномоментном (поперечном) исследовании. Изучение маркеров обмена коллагена, протеогликанов, мочевой экскреции факторов роста и цитокинов (ТФР-, ИФР-1, МСР-1) проведено в динамике лечения фозиноприлом (шестимесячное открытое проспективное исследование). Для определения факторов риска микроальбуминурии и протеинурии ретроспективно сформированы группы с быстрым и медленным развитием ДН (дизайн «случай - контроль»).

Методы исследования. Нефрологическое обследование больных включало УЗИ почек, исследование мочевого осадка, повторное исследование суточной протеинурии или альбуминурии (при протеинурии < 0,5 г/сут), исследование азотвыделительной функции почек и СКФ (расчетным методом по формуле Cockcroft-Gault). У части больных (n = 27) исследован функциональный почечный резерв (ФПР) по приросту СКФ после пероральной нагрузки мясным белком (0,7 г/кг массы тела).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 1 Дизайн исследования

Специальные лабораторные исследования. Содержание свободного и пептидно-связанного гидроксипролина в моче, коллагенолитическую активность (КЛА) сыворотки крови определяли по П. Н. Шараеву и соавт. (1987, 1990). Определение содержания суммарных сульфатированных ГАГ в моче осуществляли по методу E. W. Gold (1981) в модификации Г. А. Пауль, Т. В. Русовой (1990), исследование фракций ГАГ проводили с помощью электрофоретического разделения по C. A. Pennock (1976). Определение концентрации фибронектина в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческих наборов «ИФА-Фн» ЗАО «НВО Иммунотех» (Россия).

Определение концентрации ТБК-активных продуктов (ТБК-АП) в сыворотке крови проводили по М. С. Гончаренко, А. М. Латиновой (1985). Степень окислительной модификации белков сыворотки крови оценивали по содержанию карбонильных групп, количество которых определяли согласно C. D. Smith et al. (1991). Исследование активности лизосомальных ферментов проводили в сыво-ротке крови спектрофотометрическим методом: N-ацетил--D-глюкозаминидазы и -галактозидазы по A. L. Barret (1972), кислой РНК-азы - по C. De Duve (1971).

Исследование концентрации ТФР-, ФРЭС, IL-1, MCP-1 и RANTES в моче, sICAM-1 в сыворотке крови проводили методом ИФА. Для определения ТФР-, ФРЭС и sICAM-1 использовали наборы фирмы «Bender MedSystems» (Австрия), IL-1 - «Вектор Бест» (Россия), MCP-1 и RANTES - «Biosource» (Бельгия). Определение концентрации ИФР-1 осуществляли методом усиленной ферментной хемилюминисценции на анализаторе «Immulite One» (фирма DPC, США), с использованием наборов фирмы-производителя прибора.

В качестве контроля для лабораторных исследований использованы образцы крови 55 здоровых доноров (26 мужчин и 29 женщины, от 20 до 49 лет), а также образцы мочи 48 здоровых лиц (22 мужчины и 26 женщин, от 18 до 55 лет).

Инструментальные исследования. Суточное мониторирование артериального давления (СМАД) осуществляли осциллометрическим методом на аппарате «Tonoport IVa» фирмы «Marquette HELLIGE» (США). Эхокардиографию проводили в М-режиме на аппарате «MEGAS» фирмы «Esaote S.p.A.» (Италия). Оценку диастолической функции левого желудочка проводили с помощью допплерэхокардиографии. Кардиоинтервалографию (КИГ) осуществляли по методике Р. М. Баевского и соавт. (1984) с оценкой показателей сердечного ритма в покое и при переходе в ортостаз. Холтеровское мониторирование ЭКГ с оценкой ВРС проводили на аппарате «Markett Hellige» (CША) с последующей компьютерной обработкой данных с помощью системы «MARS 8000». Количественная оценка почечного кровотока на уровне магистральной, сегментарной, междолевой, дуговой артерий проводилась с помощью УЗДГ на аппарате «Аloca-600» (США).

Морфологические исследования. Пункционная нефробиопсия выполнялась под ультразвуковым контролем на аппарате «Philips» (США). Для количественной оценки выраженности изменений в почках определяли соотношение: объем мезангия/объем клубочка, а также объемную плотность интерстиция в корковом веществе с помощью окулярной сетки (Г. Г. Автандилов, 1990). Процентное соотношение эндотелиоцитов, мезангиоцитов и подоцитов в клубочках определяли на полутонких срезах. Электронно-микроскопическую морфометрию структур нефронов проводили при увеличении в 38000.

Срезы для иммуногистохимических исследований окрашивали стрептовидин-биотиновым методом с помощью моноклональных антител с докраской ядер гематоксилином. Типирование коллагена I типа осуществляли с помощью наборов фирмы «ИМТЕК» (Москва), коллагена III, IV и VI типов - «Novocastra Laboratories Ltd» (Великобритания). ICAM-1 выявляли с помощью антител к антигену CD54, макрофаги - с помощью антител к антигену CD68 фирмы «Novocastra Laboratories Ltd» (Великобритания).

В качестве контроля при проведении светооптических исследований использовали почки 15 лиц, погибших от черепно-мозговых травм. При судебно-медицинском исследовании этих лиц не выявлено признаков хронических заболеваний, отравлений, травматических и иных повреждений почек. При проведении электронной микроскопии в качестве контроля использовали неизмененные фрагменты почек пяти больных с нефрокарциномами. Образцы забирали во время нефрэктомий.

Статистическая обработка проведена с использованием пакета STATISTICA 6.0 (Stat-Soft, CША, 2001). Использованы методы описательной статистики, дисперсионный анализ, корреляционный анализ, многофакторный регрессионный пошаговый анализ, многофакторный логистический анализ. Нормальность распределения проверяли по критерию Колмогорова-Смирнова. Для оценки межгрупповых различий количественных данных с нормальным распределением применяли t-критерий Стьюдента или ANOVA, для данных с иным распределением - критерий Манна-Уитни или ANOVA Краскела-Уоллиса. Сравнение частот бинарных признаков проводили с помощью критерия ² или с помощью точного критерия Фишера. Изменения показателей в динамике лечения оценивали с помощью критерия Уилкоксона. Данные для признаков с нормальным распределением представлены как средние и стандартные отклонения (M ± SD), а данные с распределением, отличным от нормального -- как медианы, 25-й и 75-й процентили или (при малом размере выборок) как медианы, наименьшие и наибольшие значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клинические особенности больных СД 1-го типа с начальными стадиями нефропатии

При комплексной оценке результатов СМАД параметры, характерные для изолированной диастолической АГ, выявлены у 9-ти (15 %) пациентов с нормальной экскрецией альбумина с мочой (ЭАМ) и у 23-х (38 %) с микро-альбуминурией. Систолодиастолическая гипертензия обнаружена у пяти (8 %) больных с нормальной ЭАМ и шести (10 %) с микроальбуминурией. Таким образом, общая частота АГ у больных с микроальбуминурией оказалась в 2,1 раза выше, чем у больных с нормальной ЭАМ (47,5 % и 22,6 %, р = 0,007). У большинства больных с выраженной ДН выявлена систолодиастолическая АГ (n = 18; 75 %), реже наблюдалось изолированное повышение диастолического артериального давления (ДАД; n = 4; 17 %); суммарная частота АГ в данной группе составила 92 %.

Уменьшение степени ночного снижения систолического артериального давления (САД) зафиксировано у 56 % больных с нормоальбуминурией, у 62 % с микроальбуминурией и у 64 % с протеинурией (суточный профиль «non-dipper»). У 10 %, 12 % и 23 % больных 1-й, 2-й и 3-й групп соответственно ночные цифры САД оказались выше дневных (профиль «night-peaker»). Уменьшение или отсутствие ночного снижения ДАД обнаружено у 30 % больных с нормоальбуминурией, у 35 % с микроальбуминурией и у 73 % больных с протеинурией. Превышение ночных показателей ДАД над дневными зафиксировано у 7 %, 9 % и 9 % больных каждой группы соответственно.

Найденная взаимосвязь между суточными профилями гемодинамики и стадией ДН может быть опосредована через нарушение вегетативной регуляции работы сердечно-сосудистой системы, вызванной диабетической автономной нейропатией. Последняя, по данным стандартных вегетативных ЭКГ-тестов, диагностирована у 38,1 % больных с нормоальбуминурией, у 60,8 % пациентов с микроальбуминурией и 88,8 % больных с протеинурией. При КИГ у пациентов с нормальной ЭАМ и микроальбуминурией зафиксировано снижение значений медианы, моды и вариационного размаха кардиоинтервалов и повышение показателей амплитуды моды, индекса вегетативного равновесия и индекса напряженности в положении лежа и в ортостазе (различия с контролем статистически значимы: все р < 0,05). Наибольшей выраженности изменения этих показателей достигали у больных с протеинурией.

Спектральный анализ ВРС показал значимое уменьшение мощности спектра вариабельности кардиоинтервалов в диапазоне высоких и низких частот (HF, LF) у больных с нормо- и микроальбуминурией в сравнении с контролем (HF: 206 ± 192, 199 ± 205 и 389 ± 106 ms²; LF: 514 ± 337, 451 ± 317 и 831 ± 202 ms² соответственно). Показатели HF, LF, а также мощность спектра очень низких частот (VLF) у больных c протеинурией были достоверно ниже в сравнении с контролем и другими группами больных (HF: 32 ± 45 ms²; LF: 104 ± 200 ms²; VLF: 314 ± 505 ms²). Указанные изменения свидетельствуют о снижении активности парасимпатического и симпатического отделов вегетативной нервной системы, а также о росте гуморальных механизмов регуляции ритма по мере увеличения тяжести ДН.

Частота различных вариантов геометрии левого желудочка на разных стадиях ДН представлена в таблице 1. Частота ГЛЖ в группе больных с нормоальбуминурией составила 23 %, в группе с микроальбуминурией - 25 %, в группе с протеинурией - 60 % (² = 4,1, р = 0,13). Концентрический тип ГЛЖ оказался наиболее тесно связан со стадией ДН (² = 9,8, р = 0,008).

Таблица 1

Геометрия левого желудочка у больных СД 1-го типа с разной выраженностью ДН

При корреляционном анализе выявлены значимые связи между относительной толщиной стенки (ОТС), индексом массы миокарда левого желудочка (ИММЛЖ) и суточной протеинурией (r = 0,39, p = 0,00005 и r = 0,33, p = 0,0007 соответственно). В многофакторном регрессионном анализе увеличению ИММЛЖ способствовали рост протеинурии и ДАД, а также снижение уровня гемоглобина (R² = 0,39, p = 0,0005). Детерминантами ОТС оказались возраст и ДАД (R² = 0,35, p = 0,00009).

Изучение трансмитрального потока крови выявило диастолическую дисфункцию левого желудочка у 14-ти из 42-х обследованных больных (33 %). В большинстве случаев диастолическая дисфункция формировалась по типу нарушенной релаксации на фоне нормальной систолической функции сердца. В многофакторном логистическом регрессионном анализе установлено, что развитию диастолической дисфункции левого желудочка способствуют увеличение длительности СД, а также снижение уровня гемоглобина и СКФ (параметры модели: ² = 15,4, р = 0,009).

Анемия. Частота анемии составила 9,4 % у больных с нормальной ЭАМ, 17 % - при наличии микроальбуминурии, 35,7 % - у пациентов с протеинурией и нормальной азотвыделительной функцией почек, 75 % - у больных с ХПН.

Метаболические нарушения. Показатели гликемии и HbA_1c были статистически не значимо ниже у больных с нормоальбуминурией по сравнению с другими группами больных. Уровень холестерина > 4,5 ммоль/л зафиксирован у 42,6 % пациентов с нормоальбуминурией, у 43,5 % обследованных с микроальбуминурией и у 65,1 % больных с протеинурией. Показатели триглицеридов выше целевого уровня (> 1,7 ммоль/л) имели 22,1 %, 28,7 % и 45 % пациентов 1-й, 2-й и 3-й группы соответственно.

Медиана концентрации гомоцистеина в сыворотке крови у пациентов с СД составила 14,8 мкмоль/л (25-й и 75-й процентиль: 13,8 и 16,1 мкмоль/л), в контроле - 9,2 мкмоль/л (9,0 и 9,9 мкмоль/л, р = 0,008). Содержание гомоцистеина, превышающее верхнюю границу нормы (15 мкмоль/л), обнаружено у 13-ти из 30-ти больных (43,3 %). У больных с микро- и макроальбуминурией зафиксирован более высокий уровень гомоцистеина в сравнении с пациентами с нормальной ЭАМ (р = 0,03).

У больных СД в сравнении с контролем обнаружено значимое повышение содержания карбонильных групп в сывороточных белках (922 ± 127 и 757 ± 126 нмоль/г белка, р < 0,0001), что свидетельствует о их свободнорадикальном повреждении. Увеличение степени карбонильной модификации белков зарегистрировано у пациентов с нормальной ЭАМ, наиболее высокие показатели выявлены при наличии микро- и макроальбуминурии. Содержание карбонильных групп прямо коррелировало с суточной протеинурией (r = 0,31, p = 0,01), пост-прандиальной гликемией (r = 0,34, p = 0,007), HbA1c (r = 0,28, p = 0,04). Карбонильной модификации белков сопутствовала активация перекисного окисления липидов (ПОЛ), о чем свидетельствовало избыточное cодержание вторичных продуктов липопероксидации (ТБК-АП) в сыворотке крови. Средняя концентрация ТБК-АП превышала контроль в 1,6 раза (1,49 ± 0,81 и 0,92 ± 0,18 мкмоль/мл, p = 0,001). Наиболее выраженная активация ПОЛ выявлена у больных с микро- и макроальбуминурией. В регрессионном анализе с количеством карбонильных групп в белках были ассоциированы: суточная протеинурия, постпрандиальная гликемия и ТБК-АП (R² = 0,34, p = 0,0007).

Таким образом, формирование нефропатии у больных СД 1-го типа ассоциировано с высокой частотой диастолической или систоло-диастолической АГ, уменьшением степени ночного снижения АД, кардиоваскулярной автономной нейропатией, снижением ВРС, гипертрофией и диастолической дисфункцией левого желудочка сердца, анемией, дислипидемией, гипергомоцистеинемией, активацией свободно-радикального окисления белков. Выявленные особенности необходимо учитывать при диспансерном наблюдении и клиническом ведении пациентов c СД.

Начальные структурные изменения в почках у больных СД 1-го типа (клинико-морфологический анализ)

Пункционная нефробиопсия проведена 35-ти больным, из которых 17 имели нормальную ЭАМ (3,4-22 мг/сут, медиана 7,9 мг/сут), 16 - микроальбуминурию (31,2-181 мг/сут, медиана 54,9 мг/сут), 2 пациента - протеинурию (0,68 и 0,8 г/сут).

Светооптические изменения. Наиболее ранними и постоянными признаками патологии клубочков у больных СД являлись: избыточная пролиферация мезангиальных клеток, увеличение объема клубочков, утолщение стенок капиллярных петель, экспансия мезангия (таблица 2). Склероз капсулы чаще всего выявлялся при повышенной ЭАМ и был зафиксирован у двух пациентов с протеинурией и у большинства больных (10 из 16) с микро-альбуминурией. Полное фиброзирование отдельных клубочков выявлено у одной больной с протеинурией и у одной больной с микроальбуминурией и отечным синдромом.

Таблица 2

Морфологические признаки патологии клубочков у больных СД 1-го типа с начальными стадиями ДН

Важнейшим морфологическим признаком, свидетельствующим о выраженности ДН, является объем мезангия (Osterby R., 1992; White K. E. et al., 2007). Среди обследованных больных соотношение объема мезангия к объему клубочка оказалось в среднем в 1,3 раза выше, чем в контроле (22,6 ± 5,1 % и 17,2 ± 2,9 %, р = 0,0001). Отношение мезангий/клубочек было значимо выше у больных с микроальбуминурией, чем у пациентов с нормальной ЭАМ (25,5 ± 3,8 и 18,9 ± 4,2 %, р = 0,0001). В модели многофакторного регрессионного анализа предикторами объема мезангия оказались: альбуминурия, НbA_1c и САД (R² = 0,51, p = 0,05). Это согласуется с представлениями о ведущей роли гипергликемии и АГ в формировании диабетического гломерулосклероза (Дедов И. И., Шестакова М. В., 2000).

Исследование соотношений основных типов клеток клубочков показало статистически значимое снижение процента подоцитов у больных СД с микро-альбуминурией в сравнении с контролем и больными с нормальной ЭАМ (26,5 ± 3,0, 29,8 ± 0,9 и 29,7 ± 2,0 % соответственно, р < 0,005). Это соответствует результатам работ, показавшим уменьшение абсолютного числа подоцитов в клубочках на начальных стадиях ДН (Steffes M. W. et al., 2001; White K. E. et al., 2004). В многофакторном регрессионном анализе значимыми предикторами процента подоцитов оказались длительность СД и суточная потеря белка с мочой (R² = 0,4, p = 0,01). Поскольку подоциты играют важнейшую роль в обеспечении селективной проницаемости почечного фильтра, связь между снижением числа подоцитов и увеличением альбуминурии может носить причинно-следственный характер.

Основным вариантом патологии канальцев являлась мелко- и средневакуольная дистрофия (таблица 3). В части случаев дистрофия сочеталась с атрофическими изменениями в виде уплощения тубулярного эпителия и расширения просвета канальцев. Атрофия канальцев наблюдалась у больных с АГ, микро- и макроальбуминурией. Полученные данные согласуются с результатами работ, зафиксировавших большую частоту канальцевых дисфункций у больных с начальными стадиями ДН (Галенок В. А. и соавт., 2002; Валеева Ф. В. и соавт., 2006; Miralles J. M. et al., 1993).

Таблица 3

Морфологические признаки патологии канальцев и интерстиция у больных СД 1-го типа с начальными стадиями ДН

У всех больных с формирующимся интерстициальным склерозом была выявлена микроальбуминурия. Объемная доля интерстиция в корковом веществе у больных СД была снижена (8,6 ± 2,0 %, в контроле - 10,2 ± 1,4 %, p = 0,02), очевидно, за счет увеличения площади, занимаемой клубочками и канальцами. Наиболее низкие показатели зафиксированы у больных с повышенной ЭАМ (8,2 ± 1,8 %).

При исследовании сосудов у большинства пациентов (n = 21; 60 %) выявлено утолщение стенок мелких артерий и артериол. У значительной части этих больных (12 человек) в анамнезе имели место подъемы АД или постоянная АГ, у остальных больных утолщение стенок сосудов развилось при нормальном уровне АД. Все больные с артериолосклерозом и нормальным АД имели микро- или макроальбуминурию.

Ультраструктурные изменения. У пациентов с нормоальбуминурией прослеживалось диффузное утолщение гломерулярной БМ, однако, ее структура в большинстве случаев была сохранена. У больных с микроальбуминурией выявлялись участки неравномерного утолщения, набухания и гомогенизации БМ. Средняя толщина БМ у пациентов с нормоальбуминурией значимо превышала контроль (489 ± 94 и 338 ± 50 нм, р = 0,01). Различия с контролем у больных с микроальбуминурией оказались более выраженными (646 ± 113 нм, р = 0,00009). Толщина клубочковой БМ положительно коррелировала с альбуминурией (r = 0,53, p = 0,005) и с НbА_1с (r = 0,53, p = 0,005). В многофакторном анализе предикторами толщины клубочковой БМ оказались альбуминурия, возраст и гликемия натощак (R² = 0,73).

При исследовании подоцитов у больных СД выявляли вакуолизацию и отек цитоплазмы, набухание органелл, уменьшение количества митохондрий, прикрепленных и свободных рибосом. У больных с микро- и макроальбуминурией наблюдали утолщение и частичное слияние малых отростков подоцитов. Количество малых отростков, рассчитанное на 7 мкм тестовой площади, оказалось значимо пониженным в группе больных с микроальбуминурией по сравнению с контролем (9,2 ± 1,7 и 11,5 ± 1,5 соответственно, р = 0,02) и с пациентами с нормальной ЭАМ (10,6 ± 1,4, р = 0,05). Установлена прямая корреляция между толщиной малых отростков и альбуминурией (r = 0,51, p = 0,02). В многофакторном анализе независимыми предикторами толщины малых отростков оказались альбуминурия и уровень гликемии натощак (R² = 0,51, p = 0,005).

При исследовании эндотелиоцитов капилляров отмечали набухание, фрагментацию и отшнуровку цитоплазмы этих клеток (клазматоз). Количество фенестр эндотелия оказалось сниженным в группе больных с микроальбуминурией по сравнению с пациентами с нормальной ЭАМ и с контролем (6,8 ± 1,8, 8,9 ± 2,2 и 9,9 ± 0,7 на 7 мкм тестовой площади соответственно; р = 0,03 и р = 0,003). Таким образом, уже на доклинических стадиях нефропатии у больных СД наблюдаются структурные изменения всех компонентов почечного фильтра: гломерулярной БМ, отростков подоцитов, клеток эндотелия капилляров клубочков.

Изменения мезангиальных клеток у больных СД включали в себя набухание и вакуолизацию цитоплазмы, появление в ней липидных включений. У больных с повышенной ЭАМ обнаруживали отек и накопление коллагеновых волокон в мезангиальном матриксе клубочков.

В цитоплазме эпителиоцитов проксимальных отделов нефронов у всех обследованных больных наблюдалось большое количество вакуолей, набухание митохондрий, расширение цистерн гранулярного и гладкого эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи. У больных СД с микроальбуминурией отмечали возрастание электронной плотности и размеров вторичных лизосом. Следовательно, начиная с самых ранних этапов, ДН развивается как процесс, включающий патологию всего нефрона.

Степень утолщения БМ канальцев была значимо большей у пациентов с микроальбуминурией по сравнению с больными с нормальной ЭАМ (р = 0,0001). Толщина канальцевой БМ коррелировала с альбуминурией (r = 0,43, p = 0,05) и HbA_1c (r = 0,62, p = 0,01).

Таким образом, выраженность ультраструктурных изменений в почках на допротеинурических стадиях ДН связана с альбуминурией и зависит от качества контроля гликемии, длительности СД и возраста больных.

Локализация минорных (тип IV и тип VI) и интерстициальных (тип I и тип III) коллагенов в почках. Типирование коллагенов выполнено у 21-го больного СД, в том числе у 10-ти с нормоальбуминурией (ЭАМ: 4,4-22 мг/сут, медиана 10 мг/сут), у 9-ти с микроальбуминурией (35-124 мг/сут, медиана 47,8 мг/сут) и у двух больных с протеинурией (0,68 и 0,8 г/сут).

Коллаген IV типа был обнаружен в мезангии и капсуле Боумена клубочков, клубочковой и канальцевой БМ у всех обследованных больных и у лиц контрольной группы. Интенсивность реакции в контроле варьировала от слабо положительной до положительной. Среди больных СД слабоположительная реакция выявлена в 4-х случаях, положительная -- в 13-ти, резко положительная -- в 4-х. При этом у 8-ми больных СД отмечена диффузно-очаговая аккумуляция коллагена, чего не наблюдалось в контроле. Больные с аккумуляцией коллагена IV типа имели более высокий уровень гликемии (р = 0,03), более высокое среднесуточное САД и ДАД (р = 0,04 и р = 0,03). В канальцах коллаген IV типа выявлялся в составе БМ, интенсивность реакции была повышена у больных с микроальбуминурией.

Реакция на коллаген VI типа в контрольной группе варьировала от отрицательной (n = 8) до слабоположительной (n = 3). Коллаген данного типа выявлялся в стенках капилляров и в мезангии клубочков, а также в БМ канальцев. Среди больных СД реакция на коллаген VI типа в клубочках оказалась отрицательной в шести случаях, слабоположительной -- в пяти и положительной -- в десяти. Очаговый тип реакции на коллаген VI типа выявлен у четырех пациентов. В большинстве случаев (7 из 11) патологическая реакция на коллаген VI типа сочеталась с накоплением коллагена IV типа. У больных с накоплением коллагена VI типа зафиксирована тенденция к более высоким значениям гликемии натощак (медианы 8,7 и 11,1 ммоль/л cоответственно, р = 0,06) и после еды (медианы 9 и 10,8 ммоль/л, р = 0,12). Реакция на коллаген VI типа в канальцах и интерстиции у больных СД варьировала от отрицательной (у 11-ти человек) до слабоположительной (у 10-ти).

Коллаген I типа у лиц контрольной группы присутствовал лишь в интерстиции (слабоположительная реакция). У большинства пациентов с СД (13 из 21-го) выявлены депозиты коллагена I типа в клубочках. Реакция оценена как слабоположительная у двух человек, как положительная - у девяти и как резко положительная - у одного. Отложения коллагена I типа были наиболее выражены в стенках капилляров клубочков, в ряде случаев они обнаруживались в мезангии и в капсуле клубочков. Клинической особенностью больных с наличием коллагена I типа в клубочках оказалось раннее развитие АГ (n = 9), а также повышенная ЭАМ (n = 9). Избыточная аккумуляция коллагена I типа в интерстиции зафиксирована у одной больной с 12-летней длительностью СД, микроальбуминурией и отечным синдромом.

Коллаген III типа обнаружен в клубочках у 11-ти больных из 21-го. В шести случаях наблюдалась положительная реакция, в пяти - слабоположительная. В контроле коллаген III типа присутствовал только в интерстиции. У больных с коллагеном III типа в клубочках зафиксированы более высокие цифры среднесуточного ДАД (р = 0,02). Среди лиц с депозитами коллагена III типа в клубочках нормоальбуминурию имели 4 пациента, микроальбуминурию - 6, протеинурию - 1 (при отрицательной иммуногистохимической реакции названные уровни ЭАМ зарегистрированы в 6-ти, 4-х и одном случае соответственно). Появление в клубочках интерстициальных типов коллагена, образующих крупные фибриллы, свидетельствует о возникновении не только количественных, но и качественных аномалий синтеза коллагена при СД. В тубулоинтерстиции коллаген Ш типа был зафиксирован у 17-ти больных. В отличие от контрольной группы, у больных СД коллаген Ш типа выявлялся не только в интерстиции, но также в БМ канальцев.

Итак, формирование ДН у больных СД 1-го типа характеризуется аккумуляцией минорных коллагенов (IV и VI типа) и появлением интерстициальных коллагенов (I и III типа) в клубочках, а также накоплением коллагенов обеих групп (III, IV, VI и, реже, I типа) в тубулоинтерстиции. Это свидетельствует о глубокой дисфункции клеток клубочков и канальцев при СД. Накопление коллагеновых белков создает биохимическую основу для формирования гломерулярного и интерстициального склероза. Начальные этапы этого процесса протекают на начальных (допротеинурических) стадиях ДН. Степень накопления коллагенов на этих стадиях связана с альбуминурией и определяется качеством контроля углеводного обмена и уровнем АД.

Изменения обмена внеклеточного матрикса почек в формировании ДН