Размещено на http://www.allbest.ru/

Разработка лабораторных экспресс-методов и технологии производства иммунодиагностических препаратов для выявления возбудителей листериоза и кампилобактериоза

03.00.07 - Микробиология

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Алиева Елена Васильевна

Москва - 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора

Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор Тюменцева Ирина Степановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Ильин Вячеслав Константинович

доктор медицинских наук,

профессор Митрохин Сергей Дмитриевич

доктор биологических наук,

профессор Владимцева Ирина Владимировна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Росздрава

Защита состоится "____"________________2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского"

Автореферат разослан "____"___________2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук С.Ю. Комбарова

Общая характеристика работы

1. Разработать транспортную, селективные и накопительные питательные среды для возбудителей кампилобактериоза и листериоза.

2. Подобрать эффективный метод извлечения специфических антигенов белковой природы из микробных масс возбудителей кампилобактериоза и листериоза для использования их при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов.

3. Разработать производственные схемы получения иммунных сывороток с высокими титрами агглютининов и преципитинов и провести сравнительную оценку методов выделения из них иммуноглобулинов для дальнейшего их применения в качестве биологического сырья при производстве иммунобиологических препаратов.

4. Определить оптимальные параметры биотехнологии производства иммуноферментных и иммунофлуоресцентных кампилобактериозных и листериозных иммуноглобулиновых конъюгатов.

5. Разработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами и на их основе создать тест-системы магноиммуносорбентные, а также методики их применения в экспресс-методах лабораторного анализа.

6. Определить параметры единого режима сублимации биополимеров (биологического сырья и МИБП) с целью сохранения их исходных свойств.

7. Оценить эффективность применения разработанных диагностикумов на экспериментальном, клиническом и полевом материале.

Научная новизна работы. Унифицирована питательная основа для транспортной, селективных, накопительных питательных сред, которые позволяют успешно выделять Campylobacter jejuni и Listeria monocytogenes от людей, животных, из пищевых продуктов, объектов внешней среды.

Подобраны эффективные методы, дающие возможность получения нативных специфических водорастворимых антигенных комплексов белковой природы из биомассы кампилобактерий и листерий.

Разработаны новые, высокоэффективные схемы иммунизации кроликов для получения специфических агглютинирующих и гипериммунных сывороток с высокими титрами.

Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства кампилобактериозных и листериозных микрогранулированных органокремнеземных иммуносорбентов с магнитными свойствами, обладающих высокой сорбционной емкостью, стабильностью, чувствительностью, специфичностью.

Впервые сконструированы кампилобактериозные и листериозные магноиммуносорбентные тест-системы для иммуноферментного (ИФА) и количественного иммунофлуоресцентного (КИФА) анализов, позволяющие исследовать пробы из внешней среды с высокой степенью загрязнения неограниченного объема, низкой концентрацией патогена, с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей традиционные.

Материалы выполненных исследований легли в основу двух патентов РФ на изобретение № 2135210 от 27.08.1999 г. "Способ получения диагностической сыворотки"; № 2290641 от 27.12.2006 г. "Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)".

Практическая значимость работы.

Разработаны накопительные питательные среды с соответствующими добавками для наращивания биомасс кампилобактерий и листерий.

Подобраны эффективные методы и приемы по извлечению антигенного материала, получению иммунных сывороток и выделению иммуноглобулинов.

Оптимизация параметров конъюгации лигандов и маркеров позволили унифицировать биотехнологию производства ряда МИБП для экспресс-диагностики кампилобактериоза и листериоза, индикации их возбудителей (эритроцитарные, иммуноферментные, иммунофлуоресцентные), стабильно отвечающие общим медико-биологическим требованиям (ОМБТ), предъявляемым к индикационным препаратам.

Разработан единый ускоренный экономичный режим стабилизации биологического сырья и МИБП методом сублимации, позволяющий сохранять их исходные свойства длительное время.

Таким образом, создан алгоритм технологического процесса получения диагностических препаратов для индикации и идентификации возбудителей кампилобактериоза и листериоза, включающий в себя все этапы производства: от накопления биомассы на питательной среде до стабилизации полученных диагностических препаратов методом сублимационной сушки.

Внедрение результатов в практику.

Методики применения разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП изложены в "Методических рекомендациях по лабораторной диагностике листериоза у людей"; "Методических рекомендациях по лабораторной диагностике кампилобактериоза у людей"; "Методических рекомендациях "Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях".

На диагностикумы листериозные эритроцитарные, флуоресцирующие, магноиммуносорбентные кампилобактериозные и листериозные для ИФА и КИФА составлена первичная нормативная документация (регламенты производства, фармакопейные статьи предприятия, инструкции по применению), прошедшая экспертизу в ОБТК СтавНИПЧИ, одобренная Ученым советом (протоколы №2 от 28.02.2002 г.; №6 от 26.06.2003 г.; № 2 от 28.02.2007 г.) и утвержденная директором института.

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по повышению первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ, семинарах для практических врачей и научных работников МЗ РФ по экспресс-диагностике инфекционных заболеваний и применению магноиммуносорбентных препаратов в мониторинге инфекционных агентов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложены научно-методические подходы к получению биологического сырья (антигенов и антител) для производства кампилобактериозных и листериозных МИБП, которые дают возможность повысить их качество.

2. Разработаны методические приемы конструирования эритроцитарных, иммуноферментных, иммунофлуоресцентных диагностикумов, обеспечивающие высокую эффективность обнаружения антигенов кампилобактерий и листерий и антител к ним.

3. Создана биотехнология изготовления кампилобактериозных и листериозных твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных органоминеральных магноиммуносорбентов; тест-системы магноиммуносорбентные для экспрессных методов иммуноанализа (ИФА, КИФА) позволяют максимально концентрировать патоген в исследуемом материале, что дает возможность повысить разрешающуюся способность экспересс-методов.

4. Результаты практического применения разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП, демонстрирующие повышение эффективности лабораторных исследований клинического и полевого материала.

Апробация работы. Диссертация обсуждена и одобрена на заседании Ученого совета ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора, протокол № 3 от 15 мая 2007 года. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научной конференции "Проблемы биологии и химии на Северном Кавказе", посвященной 70-летию биолого-химического факультета СГУ (Ставрополь, 2001); научной конференции Ставропольской медицинской академии (Ставрополь, 2002); международной научно-практической конференции "Биоресурсы, биотехнологии, инновации Юга России", 21-24 октября 2003 г. (Ставрополь-Пятигорск); научно-практической конференции "Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагополучия и защите прав потребителей (Ставрополь, 2005);

II съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации на базе Военно-медицинской академии им.С.М. Кирова 15-17 ноября 2006 г. (Санкт-Петербург).

Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 3 НИР, отражено в 37 научных публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, приложений.

Она изложена на 245 страницах, содержит 24 таблицы и 28 рисунков. Список литературы включает 295 отечественных и 196 зарубежных литературных источников.

Содержание работы

Материалы и методы. В работе использованы 33 штамма микроорганизмов II, III, IV групп патогенности родов: Campylobacter, Listeria, Yersinia, Salmonella, Vibrio, Staphylococcus, Escherichia.

Использованы 35 кроликов породы "Шиншилла". При выполнении работы обследовано 800 человек (от них 920 проб), исследованы 931 проба от животных и птиц, 1005 проб из объектов внешней среды, в том числе 275 - пищевых продуктов, 280 - воды, 200 - почвы,20 - сточных вод птицефабрик, 50 смывов с технологического оборудования и 20 проб промывных вод сырного производства.

Антигены микроорганизмов изолировали водно-солевой экстракцией с последующей ультразвуковой дезинтеграцией микробных клеток. Дезинтегрирование осуществляли на аппарате УЗДН - 2Т (Россия).

лабораторная диагностика возбудитель листериоз

Иммунизацию животных проводили с применением иммунокорректоров тималина, циклофосфана и тимогена. Контроль титра специфических антител в сыворотках определяли в непрямой реакции иммунофлуоресценции по T. H. Weller, A. H. Coons (1954). Для осаждения белков использовали сульфатный метод (Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1980); метод фракционирования белковых смесей с использованием высокомолекулярного, незаряженного, линейного полимера - полиэтиленгликоля - 6000 (ПЭГ) по A. Polson и др. (1964). Иммуноглобулины также преципитировали каприловой (октановой) кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969).

Количественное определение белка проводили по методу O. Warburg и W. Christian (1941) сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).

Специфическую активность антигенов микроорганизмов и полученных иммунных сывороток определяли в реакции иммунодиффузии в 1 % агаровом геле (Difco, USA) по O. Ouchterlony (1949).

Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных каприловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1974), с флуоресцеином изотиоцианатом (ФИТЦ) фирмы "Sigma" проводили по X. Шторц (Stortz, 1987). Прямой метод окраски препаратов осуществляли по A. H. Coons, M. H. Kaplan (1950). Очистку конъюгатов от непрореагировавшего флуорохрома осуществляли методом восходящей хроматографии на бумаге (Носков Ф.С., 1985).

Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.К. Nakane, А. Kawaоi (1974) в модификации Е.А. Ткаченко с соавт. (1982). Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике M. Clark и A. Adams (1977) в “сэндвич” - варианте ИФА. Очистку конъюгатов от несвязавшихся иммуноглобулинов и фермента проводили на хроматографической колонке фирмы LKB, используя сефадекс G-100.

Микроструктуру поверхности магносорбентов (МС) определяли на сканирующем электронном микроскопе (1М2-Т3000, Япония) по методу, описанному в работе Д. Фрайфелдера (1980), удельную поверхность МС - по методу А.А. Клячко-Гурвича (1961), основанному на низкотемпературной адсорбции азота. Суммарный объем и радиус пор определяли по методу Н.В. Кельцева (1984). Количественный иммунофлуоресцентный анализ проводили по методу К.Г. Стоева, В.А. Чибисовой, К.Л. Шаханиной (1981).

Сублимацию проводили в камерах TG-5 (Германия) и LZ-9c (Чехия).

Математическую обработку результатов экспериментов осуществляли на компьютере (программа EXCEL). Для подтверждения достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы (Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П., 1969; Скуч Д., Уэст Д., 1979).

Результаты исследований

Конструирование питательных сред для кампилобактерий и листерий

Взяв за питательную основу мелассу свекловичную, мы сконструировали транспортную, селективные и накопительные питательные среды, в которых учтены биологические особенности кампилобактерий и листерий. Транспортная среда для кампилобактерий и листерий представляет собой основу, содержащую 0, 05% тиогликолята натрия и 0,025 % цистеина. Селективная среда для листерий, кроме основы, содержит агар - агар микробиологический (15 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), глюкозу (1 г/л), глицерин безводный (10,0 г/л), лецитин соевый (1,0 г/л) и антимикробную добавку: полимексин М (3 мг/л), амфоглюкамин В (5 м/г), цефазолин (30 мг/л), колимицин (30 мг/л). Селективная среда для кампилобактерий дополнительно содержит эритрит, гемолизированную кровь барана или лошади (7 %) и аэротолерантную добавку (железо сернокислое, железо закисное, натрий пировинограднокислый по 0,025 %).

Для изготовления накопительных сред (для наращивания биомасс микроорганизмов) взята рецептура селективных сред без антимикробной добавки, в которую введен стимулятор роста - "ЭСРМ" (7±1) мг/л. Этот универсальный стимулятор роста был разработан и с успехом применен при наращивании биомассы L. monocytogenes штамма АУФ при производстве листериозной вакцины (Панова Н.В., 2006). В препарате использовано сочетание биологических потенций куриного яйца и эмбриональной ткани, которые имеют наличие широкого набора составных частей, обладающих положительным катализирующим действием на метаболизм бактерий.

В сериях опытов при засеве 100 м. к. C. jejuni 1/NCTC 11168, C. coli 602, L. monocytogenes сероваров 1/2а и 4а на контрольных (глюкозо-глицериновый агар - для листерий, железоэритритный кровяной агар (ЖЭКА) - для кампилобактерий) при инкубации листерий при 37 ⁰С через 24-48 часов, а кампилобактерий - при 42 ⁰С в микроаэрофильных условиях через 48-72 часа наблюдался рост, типичный для каждого вида микроорганизмов. Количество выросших колоний на селективных средах при вычислении среднего показателя равнялось (85,3±1,4), а на накопительных - (93,8±1,83), в то время как в контролях среднее количество выросших колоний не превышало (73,2±2,1). На накопительных питательных средах показатель прироста бактериальной массы, вычесленный по формуле Э.М. Олиферовой (1998), в среднем составил (1,55±0,27) г/л, в то же время на контрольных средах он был ниже: на глюкозо-глицериновом агаре - (0,68±0,06), на ЖЭКА - (0,82±0,11) (таблица 1).

Консервирующую способность транспортной среды изучали в условиях комнатной температуры (22±2) ⁰С и холодильной камеры (4⁰С). При 4 ⁰С культуры кампилобактерий и листерий сохраняли жизнеспособность в течение 4 - 6 суток, а при (22±2) ⁰С - 3-4 суток. Достоинством этой среды является её пригодность для сохранения как кампилобактеров, так и листерий, что позволяет вести поиск этих микроорганизмов в одной и той же пробе.

Разработанные среды позволили успешно выделять патогены из материала от больных людей, животных, птицы, объектов внешней среды, а также для получения антигенов наращивать биомассы кампилобактерий и листерий в количествах, достаточных для этих целей.

Таблица 1. Сравнительное изучение ростовых свойств опытных и контрольных питательных сред

*Примечание: - статистически достоверные результаты (от Р<0,001 до Р<0,1).

Использование доступного, дешевого, непродовольственного сырья в качестве основы позволило значительно снизить себестоимость питательных сред и ускорить процедуру их приготовления, так как отпала необходимость проведения гидролиза продуктов животного происхождения, традиционно используемого при приготовлении сред.

Разработка биотехнологии получения листериозных и кампилобактериозных диагностикумов для реакции агглютинации и реакции непрямой гемагглютинации

Одним из доступных и простых методов индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний является реакция агглютинации. Качество агглютинирующей сыворотки зависит от высокоактивной схемы специфической иммунизации животных. Проведена серия экспериментов по отработке оптимальной схемы иммунизации с варьированием концентрации антигенов, способов, кратности и периодичности их введения. Для иммунизации животных использовали обеззараженные 1 % раствором формалина с последующим кипячением в течение одного часа двухсуточные агаровые культуры L. monocytogenes сероваров 1/2а, 1/2в, 3а, 4а, 4в, 5, 7, доведенные до концентрации 1х10⁹ м. к. /мл по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-59-85, взятые в равных долях. Корпускулярным кампилобактериозым полигрупповым антигеном служили объединенные в равных пропорциях бакмассы из C. jejuni 1/NCTC 1168, 33291, C. coli 602, C. fetus 322, обработанные при 100⁰С в течение одного часа с добавлением 1 % раствора формалина, доведенные до концентрации 1х10⁹ м. к. /мл.

Наиболее результативной оказалась схема иммунизации, предусматривающая три способа введения антигена: внутривенный, в подушечки лап, в лимфатические узлы. Важным достоинством этой схемы является непродолжительность периода иммунизации кроликов-продуцентов, который составляет 17-18 дней, атравматичность для них, получение высоких титров специфических антител - до 1: 3200 - 1: 6400. Кампилобактериозные полигрупповые сыворотки для РА оказались высокоспецифичными, в то же время полученные листериозные агглютинирующие сыворотки давали в низких титрах перекрестные реакции с гетерологичными культурами (сальмонеллами, шигеллами, стафилококками). Специфичные полигрупповые листериозные сыворотки удалось получить после проведения иммуносорбции с помощью твердофазных ПААГ - сорбентов (таблица 2).

Традиционным и эффективным методом диагностики инфекционных заболеваний является реакция агглютинации с применением корпускулярного диагностикума. При окраске микробных клеток анилиновыми или други-

Таблица 2. Результаты сравнительного изучения специфической активности и специфичности полигрупповых агглютинирующих адсорбированных листериозных и кампилобактериозных сывороток

ми красителями реакция становится наиболее наглядной. Нами разработана биотехнология изготовления полигрупповых диагностикумов цветных листериозного и кампилобактериозного для реакции агглютинации. Из 12 испытанных красителей (малахитовый зеленый, бромкрезоловый синий, бромфеноловый синий, метилен виолет, фуксин кислый, фуксин основной, кристалл виолет, феноловый красный, тиомин синий, трепан синий, метилен синий, бриллиантовый зеленый) наиболее пригодным оказался бромфеноловый синий. Диагностикумы, окрашенные этим красителем, выявляли агглютинины в полигрупповых сыворотках для РА в разведении 1: 1600 - 1: 3200, при этом оптимальная концентрация микробной взвеси в нем - 3х10⁹ м. к. /мл (таблица 3).

При изучении специфичности использовали коммерческие агглютинирующие сыворотки: сальмонеллезную поливалентную основных (АВСДЕ) групп, туляремийную агглютинирующую сухую, холерную "О", шигеллезную дизентерийную поливалетную, бруцеллезную поливалентную.

Таблица 3. Результаты объемной реакции агглютинации цветных диагностикумов в зависимости от использованного красителя

Со всеми перечисленными сыворотками реакция агглютинации была отрицательная.

До сих пор остаются актуальными и широко используются простые, достаточно чувствительные, не требующие применения специальной аппаратуры и потому общедоступные серологические тесты и, в частности, РНГА. При отработке биотехнологии изготовления эритроцитарных антигенных диагностикумов было необходимо решить следующие задачи: подобрать эффективную методику извлечения специфического лиганда из микробных клеток; отработать условия формалинизации эритроцитов барана; подобрать условия сенсибилизации эритроцитов специфическими антигенами. Для извлечения нативных водорастворимых антигенов листерий и кампилобактерий мы сочли целесообразным использовать режим ультразвуковой дезинтеграции микробных клеток в сочетании с водно-солевой экстракцией и последующим осаждением белка (Афанасьев Е.Н., 1984). Экстракция осадка 5% раствором хлористого натрия и выделение второго супернатанта позволяют в максимальной степени извлечь антигены из бактериальной массы, а фракционирование антигенов из супернатантов сульфатом аммония, помимо концентрирования и очистки, приводит к стабилизации белков (рисунок 1).

В связи с тем, что у всех серотипов кампилобактерий имеется общий белковый антиген, содержащийся в жгутиках, а одним из важнейших поверхностных антигенов является кислоторастворимая белковая фракция (Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я., 1999), дополнительно в вышеназванную схему при получении кампилобактериозного полигруппового антигена мы ввели этап экстрагирования раствором соляной кислоты. При этом антигеный комплекс изолировали из биомасс кампилобактерий подвидов jejuni, coli, fetus.

Полигрупповые антигены иммобилизовали на поверхности эритроцитов барана, формализованных по методу М.И. Леви с соавт. (1962), при этом активацию их поверхности проводили 2 % раствором вторичного алкилсульфата натрия. Оптимальная нагрузка лигандов равнялась 1000 мкг/мл по белку при следующих условиях конъюгации: концентрация эритроцитов - 20 %; температура их связывания с сенситином - 45⁰С; pН раствора - 5,0 в течение (18 ±2) часов.

При контроле полученных серий эритроцитарных антигенных листериозного и кампилобактериозного диагностикумов титры специфических антител в РНГА выявлялись в разведениях 1: 5120 - 1: 10240. При изучении специфичности на коммерческих агглютинирующих сыворотках перекрестных реакций не наблюдалось.

Конструирование листериозных и кампилобактериозных полигрупповых иммуноглобулиновых флуоресцирующих и иммунопероксидазных коньюгатов

Для экспресс-индикации возбудителей кампилобактериоза и листериоза нами изготовлены полигрупповые флуоресцирующие и иммунопероксидазные конъюгаты. При их получении было необходимо иметь высококачественное сырье - высокоспецифичную и высокоактивную гипериммунную сыворотку.

С учетом накопленного опыта и теоретических предпосылок ранее мы предложили и экспериментально обосновали схему иммунизации животных-продуцентов гипериммунных сывороток: антигенный материал пятикратно вводили внутривенно, одновременно внутримышечно в качестве иммуномодулятора инъецировали тималин, в третью инъекцию дополнительно вводили внутримышечно циклофосфан (N¹ - бис/в-хлорэтил) - N¹-O-триметиловый эфир диамида фосфорной кислоты) (таблица 4).

Таблица 4. Схема иммунизации кроликов с применением иммуномодуляторов тималина и циклофосфана

Использование в качестве иммуномодулятора тималина способствует значительному повышению титров специфических сывороток антител за счет увеличения числа антителообразующих клеток в результате стимуляции функции макрофагов и хелперных Т-клеток. Циклофосфан, являясь классическим иммуносупрессором, также активизирует макрофаги, стимулируя фагоцитарную, цитотоксическую и супрессивную (в отношении главным образом Т - лимфоцитов) функции (Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985). Такая избирательность в действии иммуностимулятора, с одной стороны, и определенная селективность в действии иммуносупрессора - с другой, служат оптимальной комбинацией препаратов обеих групп и режимов их использования для активации одних механизмов иммунитета и выключения других.

При данном способе продолжительность цикла иммунизации составляла 31-35 дней, расход антигенного материала - 7550 мкг на одного кролика. Титры специфических антител в сыворотках животных-продуцентов при определении в РИД достигали показателей 1: 15,4 ± 1, 25 - 1: 28,8 ± 2,5, а в НРИФ - не ниже 1: 13926,4 ± 1372,16.

Такие характеристики соответствовали требованиям оценки сырья для производства иммунобиологических препаратов. Материалы защищены патентом РФ на изобретение № 2135210 "Способ получения диагностической сыворотки" (Бюл. №24 от 27.08.99).

Дальнейшее проведение исследований позволило нам предложить новую схему гипериммунизации кроликов с одним иммунокорректором - тимогеном, при этом удалось значительно снизить антигенную нагрузку при иммунизации.

Применение тимогена сопровождается мобилизацией регуляторных и эффекторных механизмов адаптации организма к воздействию ксенобиотических факторов. Эффекты препарата на клеточном уровне включают в себя специфическое связывание с мембраной лимфоцитов, активацию систем вторичных посредников и регуляцию функционального состояния лимфоидных клеток через цАМР-зависимые протеикиназы. Важно отметить, что доза тимогена, при которой наблюдается усиление процессов дифференцировки лимфоидных клеток и экспрессия рецепторов на лимфоцитах, в 10-1000 раз меньше, чем в природных препаратах вилочковой железы, в том числе и тималина (Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 1982, Демидов С.В., Костромин А.П., Чернушенко Е.Ф. и др., 1990; Морозов В.Г., 1990).

Схема иммунизации состояла из следующих манипуляций: кроликам-продуцентам вводили внутривенно каждые пять дней водорастворимые полигрупповые антигенные комплексы листерий и кампилобактерий в увеличивающихся дозах. В эти же сроки внутримышечно инъецировали по 10 мкг тимогена. На 7-10 день после последнего введения иммуногена животных кровопускали (таблица 5).

Активность гипериммунных сывороток, полученных по этой схеме, в РИД составляла 1: 28,8 ± 2,5 - 1: 53,3 ± 5,01, в НРИФ - 1: 13926,4 ± 1372,16 - 1: 24576 ± 2744,32.

Таблица 5. Схема иммунизации кроликов с применением тимогена

Благодаря применению иммунокорректора тимогена, обладающему полифункциональным действием, значительно сокращены дозировки вводимого антигенного материала (с 7550 мкг до 450 мкг), иммунокорректора - в 500 раз, длительность процесса иммунизации с 35 дней до 22 дней, при этом повышен выход целевого продукта за счет увеличения антителообразования у животных-продуцентов с одновременным уменьшением трудозатрат.

При сравнительном анализе методов выделения специфических иммуноглобулинов класса G (сульфатом аммония, каприловой кислотой, полиэтиленгликолем - 6000) и дальнейшей их метке флуорохромом и ферментом оказалось, что наиболее активные флуоресцирующие конъюгаты были получены при использовании IgG, выделенные каприловой кислотой, а энзиммеченные - IgG - полиэтиленгликолем. При этом для повышения специфичности листериозных полигрупповых иммуноглобулиновых конъюгатов были использованы F (ав) ₂ - фрагменты, выделенные из соответствующих IgG ферментативным гидролизом в кислой среде. Разработанные биотехнологии позволили получать высокоактивные, чувствительные и специфичные диагностические препараты, отвечающие ОМБТ, предъявляемым к подобным диагностикумам.

Разработка тест-систем магноиммуносорбентных для экспресс-диагностики кампилобактериоза и листериоза в иммуноферментном анализе и количественной реакции иммунофлуоресценции

Эффективность ряда методов индикации и выделения возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов может быть значительно увеличена после предварительного концентрирования микробов и антигенов с отделением их от контаминирующей микрофлоры и примесей. Эта цель может быть достигнута путем применения методов иммуносорбции, особое место среди которых занимают методы с использованием сорбентов с магнитными свойствами. Магноиммуносорбенты служат в качестве твердой фазы для селективного концентрирования на их поверхности патогенов (Брыкалов А.В., Жарникова И.В., 1995; Тюменцева И.С., 1996; Ефременко В.И., 1996; Афанасьев Е.Н., 2000; Yu H., 1998; Jaykus Lee, 2000).

Нами впервые разработаны кампилобактериозные и листериозные магноиммуносорбенты на основе органокремнезема - алюмосиликата, модифицирование поверхности которого осуществляли в присутствии полимера - декстрана и поверхностно-активного вещества - вторичного алкилсульфата натрия. Для придания сорбенту магнитных свойств в его состав вводили оксид железа. Для оптимизации структурных характеристик МС проведены исследования по варьированию состава компонентов синтеза (алюмосиликат, полиглюкин, F₂O₃), а также изучено влияние времени гелеобразования и pH среды на величину удельной поверхности сорбента, объем и размер пор (таблица 6). На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оптимальные условия получения алюмосиликатных МС: соотношение компонентов синтеза 1: 1: 2, соответственно алюмосиликат, декстран, F₂O₃; время гелеобразования - 2 часа, рН гелеобразования - 7,0. Исследование удельной поверхности показало, что сорбент, не содержащий в своем составе F₂O₃, имеет удельную поверхность - 58 м²/г, объем пор - 1,70 см³/г, радиус - 42,5 нм. Введение оксида железа в структуру кремнеземного сорбента изменяет его структурные характеристики: удельная поверхность имеет значение 18 м²/г, объем пор - 1,19 см³/г, радиус пор - 132,2 нм.

Таблица 6. Структурные характеристики МС в зависимости от количества Fe₂O₃ и времени гелеобразования

Аффинность сорбенту придавали белковые специфические лиганды, которыми при конструировании кампилобактериозных МИС служили иммуноглобулины из гипериммунных полигрупповых сывороток, выделенные полиэтиленгликолем, а для листериозных МИС - F (ab) ₂ - фрагменты иммуноглобулинов листериозных.

Исследования показали, что концентрация белка лигандов 2,5-3 мг/мл является оптимальной для полного насыщения сорбента в объеме 0,4 мл 10 % взвеси МИС. При использовании белка с концентрацией больше 2,5

мг/мл адсорбционная емкость МИС снижалась. При изучении кинетики процесса иммобилизации и оценке связывания белковых лигандов с сорбентом установлено, что для полного насыщения МС белком достаточно 2 часов при значении рН раствора белка 6-7 и температуре от 22 до 37⁰С. Полученные магноиммуносорбенты характеризуются стандартностью структурных характеристик, механической, химической, микробиологической устойчивостью, не подвержены набуханию. Принципиальная схема получения МИС представлена на рисунке 2.

На основе МИС нами впервые сконструированы диагностические тест-системы для проведения сочетанного метода индикации возбудителей кампилобактериоза и листериоза МИС+ИФА, подобраны условия постановки ИФА с МИС. При использовании МИС в ИФА для проведения реакции не требовались полистероловые планшеты, сокращалось время сенсибилизации твердой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твердой фазы, время проведения анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА. Нами также впервые сконструированы магноиммуносорбентные диагностические тест-системы для проведения сочетанного метода детекции возбудителей кампилобактериоза и листериоза в количественном иммунофлуоресцентном анализе, оптимизированы варианты постановки КИФА. МИС+КИФА обладает селективным концентрированием, высокой чувствительностью (1х10² м. к. /пробе), значительно превышающей чувствительность традиционного иммунофлуоресцентного анализа, специфичностью, быстротой постановки реакции (50-60 мин), возможностью учитывать реакцию не только визуально, но и инструментально (в условных единицах по показаниям вольтметра), при этом отпадает необходимость приготовления мазков и их фиксации.

Способность магноиммуносорбентов прочно (на уровне реакций антиген-антитело) фиксировать не своей поверхности искомый патоген дает возможность исследовать широкий диапазон проб, в том числе и сильно загрязненных, и их объемов (от нескольких микролитров до многих кубических метров жидкости), осуществлять тщательную промывку проб от загрязнений, мешающих проведению индикационных реакций, тем самым повышая достоверность как положительных, так и отрицательных результатов.

Все разработанные нами МИБП, а также биологическое сырье для их производства нуждались в стабилизации исходных свойств. В настоящее время наилучшим методом для сохранения свойств биополимеров является лиофильное высушивание препаратов. В связи с тем, что названные выше диагностические препараты и сырье для них имеют свой порог биодеградации, необходимо было отработать единый, оптимальный, экономичный режим их высушивания.

Рисунок 2. Принципиальная схема получения МИС

При сублимации мы использовали различные криозащитные среды, подобранные нами для каждого биообъекта. Сублимацию проводили на установке для сублимационной сушки (LZ-9С или TG - 5) с использованием двух режимов: "умеренного" (длительность удаления свободной воды - (12,5±1) час, связанной влаги - (10,5±1) час, конечная температура подогрева - (25±1) ⁰С) и "жесткого" (длительность периода сублимации и изотермического отторжения влаги в течение 6 часов с подогревом материала до (45 ±2,5) ⁰С, общая длительность процесса сушки - 16 часов). После лиофилизации "умеренным" и "жестким" режимами, а также через 5 лет хранения (срок наблюдения) показатели контроля специфической активности и чувствительности всех медицинских иммунобиологических препаратов, разработанных нами, а также биологического сырья для их производства оставались на уровне исходных. Результаты этих экспериментов позволяют рекомендовать довольно жесткий экономичный режим сублимации при производстве диагностических препаратов.

В итоге проведенных исследований составлена принципиальная схема производства, которая складывается из последовательных стадий и операций, характерных для каждого конкретного препарата, определены критические контрольные точки на этапах производства (рисунок 3).

Рисунок 3. Алгоритм процесса производства и контроля различных иммунобиологических диагностических препаратов

Обозначения: К-К₅ - критические контрольные точки; К- входной контроль;К₁ - контроль чистоты культуры; К₂ -контроль специфичной стерильности; К₃ - количественный контроль; К₄ - контроль специфичности; К₅ - контроль специфической активности и чувствительности ; В - внутренний контроль; ОБТК - контроль, производимый отделом биологического и технологического контроля предприятия

Диагностическую ценность разработанных нами МИБП подтвердили многочисленные лабораторные и полевые испытания. Так, например, возбудители кампилобактериоза (К) и листериоза (Л) были выделены от 6,7% и 3,8% больных с диагнозом ОКИ соответственно. Наличие этих возбудителей определены в 14,1% (К) и 19,7 % (Л) пищевых продуктов; 56,7 % (К) и 6,7 % (Л) смывов с рук ветеринарных работников; 9 % (К) и 12,5% (Л) проб почвы; 25 % (К) и 24,3 % (Л) проб воды; 23,3 % (К) и 16,7 % (Л) у диких птиц; 1,3 % (К) и 15 % (Л) у грызунов. Результаты бактериологических и серологических исследований материала от людей, животных, домашних и диких птиц, грызунов, пищевых продуктов, воды водоемов, сточных вод, почвы и других объектов показали многообразие резервуаров и источников листериозной и кампилобактериозной инфекций и свидетельствуют о широком распространении Campylobfcter jejuni и L. mjnocytogenes и о совпадающих путях циркуляции и передачи этих возбудителей (рисунок 4).

Таким образом, нами создан алгоритм технологического процесса производства диагностических препаратов для индикации и идентификации возбудителей кампилобактериоза и листериоза, который в дальнейшем позволит унифицировать схему лабораторной диагностики этих инфекций.

Выводы

Рисунок 4. Схема циркуляции возбудителей листериоза и кампилобактериоза во внешней среде и пути заражения человека и животных

7. Лабораторные, клинические и полевые испытания разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП показали их высокую специфичность, чувствительность, экспрессность, информативность, что в совокупности повышает эффективность лабораторной диагностики и свидетельствует о перспективности их использования в лабораториях практического здравоохранения.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тюменцева, И.С. Способ получения диагностической сыворотки / И.С. Тюменцева, А.Е. Афанасьев, В.И. Ефременко, И.А. Базиков, Е.В. Алиева // Патент на изобретение №2135210. Зарегестрировано в Гос. Реестре изобретение РФ 27 августа 1999 г. Бюл. № 24 от 27.08.1999.

2. Алиева, Е.В. Проблемы листериоза на территории Ставропольского края / Е.В. Алиева, Т.И. Егшатян // Сборник научных трудов. Здоровье (проблемы теории и практики) УДК 61: 157.7 (3) ISBN - 5 - 89822 - 029 - 1. Ставрополь, 2001, с.472 - 473.

3. Егшатян, Т.И. Циркуляция возбудителя листериоза в экологической системе /Т.И. Егшатян, Е.Н. Афанасьев, И.С. Тюменцева, Е.В. Алиева // Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. - Ставрополь, 2001. - 7 с. Депонировано в ВИНИТИ 07.01. № 1668 - В2001.

4. Егшатян, Т.И. Биотехнология приготовления эритроцитарного, антигенного, листериозного диагностикума / Т.И. Егшатян, Е.В. Жданова И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, Е.В. Алиева // Проблемы биологии и химии на Северном Кавказе. Материалы научной конференции посвященной 70-летию биолого-химического факультета СГУ. Ставрополь, 2001. - С.39.

5. Алиева, Е.В. Некоторые аспекты современного состояния эпидемиологии и лабораторной диагностики кампилобактериоза / Е.В. Алиева // Материалы научной конференции Ставропольской государственной медицинской академии. Ставрополь, 2002. - С.135-136