Микробиологические аспекты инфекций, вызванных Haemophilus influenzae, у детей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Микробиологические аспекты инфекций, вызванных Haemophilus influenzae, у детей

Боронина Любовь Григорьевна

Санкт-Петербург - 2007

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Инфекции, этиологическим фактором которых является Haemophilus influenzae, приобретают все более актуальный характер и относятся к числу наиболее распространенных среди детей во всех странах мира. Ранее считалось, что H.influenzae (палочка Афанасьева-Пфейффера) играет роль в респираторной патологии, однако исследования последних десятилетий показали, что этот микроорганизм является причиной многих гнойно-септических заболеваний. По данным ВОЗ, во всех странах мира регистрируются заболевания, вызываемые H.influenzae, как у детей, так и у взрослых (Vaccines and Biology, 2002). Рост числа инфекций, вызванных H.influenzae, сопровождается изменением спектра заболеваемости, утяжелением течения ранее известных и появлением новых клинических форм с летальным исходом.

Наибольшее значение в патологии человека имеют капсульные серологические варианты (серовары) типа «b» (Hib), вызывающие разнообразные клинические проявления, нередко приводящие к инвалидизации заболевших. Инфекции, обусловленные H.influenzae, разделяют на острые, при которых этот микроорганизм является первичным возбудителем, и хронические, при которых он, по-видимому, играет вторичную роль. Острые инфекции включают менингит, сепсис и гнойно-септические заболевания с локальными воспалительными проявлениями местного характера.

В нашей стране истинная распространенность инфекций, вызванных H.influenzae, остается невыясненной. По мнению многих авторов, именно несовершенство лабораторной диагностики H.influenzae-инфекции, приводит к снижению истинных показателей заболеваемости. В отечественной литературе описаны, в основном, гнойные менингиты и эпиглотиты. Противоречивые выводы содержат результаты исследования этиологии пневмоний, вызванных H.influenzae, у детей (Девяткина Н.П. с соавт., 1989; Таточенко В.К., 1998; Демина А.А., 1998; Королева И.С., 2003; 2004; Сорокина М.Н. с соавт., 2003; Катосова Л.К. с соавт., 2005; Покровский В.И.,2005). Настороженность вызывает отсутствие сведений о заболеваемости и распространении других нозологических форм гнойно-септических инфекций, вызванных разными серологическими вариантами H.influenzae, у детей.

Практически отсутствуют доступные тест-системы для изучения гуморального иммунитета, сероидентификации культур; не решена проблема производства питательных сред. Для диагностики инфекций, вызванных разными фенотипами H.influenzae, требуются достоверные методы микробиологических исследований, разработка и внедрение которых необходимы для полноценного мониторинга этих инфекций, лечения и профилактики.

Цель исследования -- разработать новые, провести сравнительную оценку существующих методов для повышения информативности микробиологических исследований и на этой основе определить частоту инвазивных, первично-локализованных инфекций, вызываемых H.influenzae, у детей.

Задачи исследования

1. Усовершенствовать способ получения типоспецифических сывороток к капсульным сероварам «а», «b», «с», «d», «e» и «f» для конструирования диагностических тест-систем.

2. Разработать и практически внедрить питательные среды для выделения H.influenzae, определить методические особенности контроля качества питательных сред для выделения H.influenzae, установить перечень свойств для подготовки тест-штамма.

3. Разработать и оценить диагностическую значимость тест-систем иммунофементного анализа (ИФА) для определения антигенов серовара «b» в ликворе (спинномозговой жидкости) и других биосубстратах.

4. Оценить возможности использования и диагностическую значимость различны методов микробиологического исследования инфекций, вызванных инвазивными H.influenzae.

5. Выявить частоту инвазивных, первично-локализованных инфекций и назофарингиального носительства, вызванных различными фенотипическими вариантами H.influenzae, у детей Среднего Урала.

6. Изучить распространеннность капсульных сероваров «а», «b», «с», «d»,«е», «f», нетипируемых штаммов, различных биоваров, их значение при первично-локализованных и инвазивных инфекциях.

7. Определить резистентность штаммов, выделенных при инвазивных и первично-локализованных инфекциях, вызванных H.influenzae к антибиотикам различных классов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложенные модификации приготовления питательных сред, методов их контроля, разработанная тест-система ИФА для выявления антигенов, в том числе капсульного полисахарида «b», обеспечивают ускоренную диагностику инвазивных и верификацию этиологического диагноза первично- локализованных инфекций, вызванных H.influenzae.

2. Фенотипы капсульных и бескапсульных штаммов, выделенных при первично-локализованных, инвазивных инфекциях и со слизистой носоглотки детей существенно отличаются.

3. Целесообразно дифференцированное использование серологической диагностики для верификации инфекций, вызванных сероваром «b» и нетипируемыми вариантами H.influenzae.

4. Выявленные изменения фенотипов резистентности к антибиотикам за исследуемый период не существенны, в то время как у нетипируемых штаммов и штаммов серовара «b», существуют различия в резистентности к различным классам антимикробных препаратов.

Научная новизна

Впервые разработаны способ и питательная среда для выделения H.influenzae со слизистой носоглотки (патент № 2186389 от 27 июля 2002 г., патент №21936000 от 27 ноября 2002 г.), двухфазная среда ЭрДС - для выделения из стерильных полостей, ЭрДС-агар - для выделения из нестерильных локусов (заявка № 2006139958 от 18.10.2006г.)

Определены методические критерии оценки тест-штамма для бактериологического контроля качества питательных сред, предназначенных для выделения H.influenzae из клинического материала.

Сконструированы отечественные тест-системы ИФА для выявления антигенов H.influenzae серовара «b».

Определена частота инфекций и назофарингеальной колонизации, вызываемых сероварами «a», «b», «c», «d», «e», «f» и биоварами I-VIII H.influenzae.

Осуществлено серологическое и биологическое типирование выделенных со слизистой носоглотки штаммов H.influenzae, вызывающих инвазивные и первично-локализованные инфекции.

Определена частота инвазивных и первично-локализованных форм инфекций, вызванных различными фенотипами H.influenzae, у детей Среднего Урала.

Проведено многоцентровое проспективное исследование назофарингеального носительства H.influenzae у больных и здоровых детей в детских коллективах.

Определена резистентность штаммов H.influenzae, выделенных в Свердловской области, к разным классам антимикробных препаратов.

Практическая значимость работы заключается в получении данных, расширяющих представление о роли H.influenzae, не только серовара «b», но и других сероваров и биоваров при гнойно-септических инфекциях у детей. Полученные диагностические препараты позволяют выявить среди капсульных изолятов серовары, которые могут вызывать различные формы инфекций. Разработанные способы приготовления и контроля качества питательных сред с использованием доступных ингредиентов позволяют выделять H.influenzae из клинического материала в лабораториях любого уровня. Разработанные латексные препараты для сероидентификации H.influenzae позволяют определить серовариант у капсульных штаммов. Предложенная схема исследования материала из стерильных полостей позволяет быстро и качественно выявить возбудитель. Определение биовара позволяет выявить потенциально патогенные биовары среди штаммов H.influenzae.

Полученные данные о резистентности H.influenzae к антибактерильным препаратам позволяют назначать рациональную этиотропную антибактериальную терапию. Практическая значимость работы подтверждена использованием её материалов в образовательных программах на теоретических, практических занятиях и семинарах профессиональной переподготовки при последипломном обучении врачей. Результаты определения резистентности штаммов H.influenzae включены в российский реестр резистентности возбудителей инфекций к антимикробным препаратам.

Внедрение результатов работы. По теме работы получено 2 патента на изобретения - «Транспортная среда для выделения Haemophilus influenzae из носоглоточной слизи» (патент № 21936000 от 27.11.2002 г.) и «Способ культивирования Haemophilus influenzae из носоглоточной слизи» (патент № 2186389 от 27.06.2002 г.). Подана заявка на изобретение «Питательная среда для выделения H.influenzae и способ её приготовления» - №2006139958 от 18.10.2006 г. Подготовлены методические рекомендации - «Лабораторные методы выделения, идентификации Haemophilus influenzae» (Екатеринбург, 1999), «Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae» (Смоленск, 2003). «Внебольничная пневмония у детей, пособие для врачей-педиатров» (Екатеринбург, 2004), «Лабораторные методы выделения, идентификации, определения чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae» (Екатеринбург, 2006).

Результаты исследований внедрены в лабораториях клинической микробиологии лечебно-профилактических учреждений Министерства здравоохранения Свердловской области, используются в учебном процессе курсов профессиональной переподготовки и тематического усовершенствования для врачей- бактериологов факультета повышения квалификации и последипломной подготовки Уральской государственной медицинской академии, в исследовательской работе лабораторного отдела Уральского НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии, Уральского НИИ фтизиопульмонологии (Екатеринбург).

Полученные диагностические препараты применены в лаборатории менингококковой инфекции и гнойных менингитов Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ, выделенные штаммы представлены для исследования по программе «Пегас I и II» для составления реестра резистентности штаммов Н.influenzae к антибиотикам в России.

Апробация работы

Материалы работы доложены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики и профилактики инфекции, вызываемой Н.influenzae типа «b» (Москва, 1998), на научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины» (Москва, 1999), на Всероссийской научно-практической конференции «Перинатальная анестезиология и интенсивная терапия матери, плода и новорожденного» (Екатеринбург, 1999), на 9 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Берлин, Германия,1999), на научно-практической конференции Западно-Уральского региона «Вакцинопрофилактика в ХХI веке» (Пермь, 2000), на Юбилейной научно-практической конференции «Роль лабораторной диагностики в современных медицинских технологиях» (Екатеринбург, 2000), на II международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века» (Москва, 2000), на международной научно-практической конференции «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем», посвященной 50-летию НПО «Питательные среды» (Махачкала, 2003), на V международной конференции по антимикробной химиотерапии (Москва, 2003), на IV межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы обеспечения санитарно- эпидемиологического благополучия населения» (Омск, 2003г), на III Уральской конференции «Болезни органов дыхания» (Екатеринбург, 2003г), на Юбилейной конференции, посвященной 80-летию кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Современная микробиология - клинической медицине и эпидемиологии» (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология -ХХI век» (Саратов, 2004), на первой Российской конференции «Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (Москва, 2004), на заседаниях Свердловского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова (Екатеринбург, 2006) , на VIII международной конференции по антибактериальной химиотерапии (Москва, 2006), на межкафедральном совещании в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации по результатам исследований опубликовано 96 печатных работ, из них 16 - в журналах, одобренных ВАК.

2. Содержание работы

Материалы и методы исследования

Использовали следующие штаммы микроорганизмов: типовой штамм H.influenzae NCTC № 8143, штаммы H.influenzae: серовара «а» № 1511375/63 IHE, серовара «b» № 151138 11/64 IHE, «b» № 151149 ГИСК, 2«b» 94505/81 HNCВ, серовара «с» № 151140 7/63 IHE, серовара «d» № 151161 27/68, серовара «е» № 151146 9/64 IHE; серовара «f» 10/63 IHE № 151134; АТСС № 49247, АТСС № 49766, H.parainfluenzae № 151135 NCTC 7857, H.haemolyticus NCTC10659 № 151134, H.parahaemolyticus АТСС 10014, Е.coli АТСС 11775, S.pneumoniae АТСС 49619, N.meningitidis АТСС 13077, полученные из музея патогенных бактерий ГИСК им. Л.А.Тарасевича, S.aureus АТСС 12598. авторские H.influenzae серовара «b» - № 98 и № 99.

Методы исследований

Иммунизацию кроликов с целью получения типоспецифических сывороток к капсульным антигенам проводили формолвакцинами штаммов H.influenzae «a», «b», «c», «d», «e», «f» по модифицированной нами схеме Н.И. Храмовой (Храмова Н.И., 1975). Титр и специфичность капсульных сывороток определяли в агглютинационных и преципитационных тестах до и после истощения, а затем использовали при конструирования тест-системы ИФА и диагностикумов для реакции агглютинации латекса и ко-агглютинации.

Для определения оптимального состава и способа приготовления питательных сред использовали основы разного состава - экстракт пекарских дрожжей, кровь кролика и эритроцитарную массу из крови человека, сыворотку крови крупного рогатого скота. Определение чувствительности плотных и полужидких сред по скорости роста и биологическим свойствам культур проводили в соответствии с методическими указаниями (Андреева З.М. с соавт., 1980; Исаева З.А. с соавт., 1980). Исследование параметров роста культур проводили с измерением оптической плотности на этапах культивирования с использованием ФЭК - 56М. Качество питательных сред оценивали, проводя сравнение показателей роста для жидкой среды - по максимальной удельной скорости, экспоненциальной и лаг-фазам, для плотной - по количеству КОЕ и морфологической полноценности культуры.

Твердофазный иммуноферментный анализ для обнаружения антигена H.influenzae «b» в биосубстратах проводили в непрямом «сэндвич»-варианте. Использовали 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола производства фирмы «Dynatech» (Щвейцария) и фирмы «Медполимер» (Россия), лунки которых покрывали глобулиновой фракцией, выделенной из кроличьих гипериммунных сывороток против H.influenzae «b». О результатах специфичного связывания антигенов антителами, фиксированными на полистироле, судили по добавлению специфического конъюгата (антитела против H.influenzae «b», меченные пероксидазой). При определении оптимальных параметров проведения ИФА изучали влияние температурных, экспозиционных факторов, состава и величины промывочного и разводящего буферов, различных концентраций сорбируемых антител.

Для выявления специфического комплекса антиген-антитело использовались пероксидазные конъюгаты на основе антител к полирибозилфосфату H.influenzae. В качестве субстрат-индикаторной смеси использовали ортофенилендиамин с пероксидом водорода. Учет реакции проводили после добавления 0,1М H₂S0₄, оптическую плотность окрашенного продукта ферментативной реакции определяли на вертикальном фотометре Dynatech-4000 (Швейцария) при длине волны 450 нм. Конъюгаты получали на основе общеглобулиновой фракции, выделенной с помощью полиэтиленгликоля (молекулярная масса 6000, «Serva») из кроличьей сыворотки к H.influenzae «b» при помощи перйодатного окисления в отделе новых технологий НИИ ЭМ им. Пастера по методу M.Wilson, Р.Nakone в модификации В.Н. Вербова (1988).

Реакция ко-агглютинации. Культуру S.aureus (штамм Cowan I), выращенную в стандартных условиях, формалинизировали 0,5% раствором 2 часа, трёхкратно отмывали в фосфатно-буферном растворе pH 7,2. Из осадка готовили 40% взвесь, к 1,0 мл взвеси стафилококкового иммуносорбента добавляли 2,5 мл кроличьей сыворотки одного из сероваров H.influenzae, предварительно проверив в реакции агглютинации на отсутствие гетерологичных антител в разведении 1:25. Затем перемешивали при +4єС; отмывали забуференным физиологическим раствором дважды, центрифугируя при 1000 об/мин 10 мин. Осадок разводили буфером, получая 1-2% взвесь, проверяли отсутствие спонтанной агглютинации.

Реакция сопровождалась контролями: несенсибилизированный стафилококковый реагент и отдельно - испытуемый материал (культура H.influenzae) с физиологическим раствором; испытуемый материал и несенсибилизированный реагент; сенсибилизированный стафилококковый реагент и физиологический раствор. Использование реакции ко-агглютинации показало оптимальным использование забуференного физиологического раствора pH 7,2 для проведения реакции в равных объёмах (0,02 мл), учёт через 1 мин после лёгкого нагрева и определение не столько размеров агглютинатов, сколько степени просветления.

Реакция латекс-агглютинации. Для получения иммуноглобулиновых фракций из гипериммунных кроличьих сывороток к сероварам «a», «b», «c», «d», «f», «e», апробированных в качестве сенситинов, использовали 0,0156 М фосфатный буфер (pH 7,4). К сывороткам добавляли равный объём 20% полиэтиленгликоля, выдерживали при +4єС 10 мин, после центрифугирования при 5000 об/мин в течении 15-20 мин, осадок растворяли до первоначального объёма сыворотки и вновь центрифугировали при указанных параметрах. Надосадочную жидкость растворяли в меньшем количестве забуференного физиологического раствора, проводили диализ в мешке для диализа против забуференного физиологического раствора 24 ч на холоду, затем очищали на колонке с сефадексом G-25, G-200.

Полученный препарат лиофильно высушивали и определяли белок по методу Лоури. Полученные и лиофильно высушенные препараты из сывороток к сероварам «a», «b», «c», «d», «f», «e» содержали в 1 мг от 389-738 г белка (по Лоури). Частицы латекса сенсибилизировали по методике Severin (1972). Предварительно определяли специфичность полученных иммуноглобулинов в реакции агглютинации с капсульными вариантами 2мг/мл, 1мг/мл, 0,5мг/мл, 0,25мг/мл, 0,125мг/мл H.influenzae в концентрации 5х10⁹ КОЕ/мл. Реакцию проводили в термостате при 37є С 2,5 часа во влажной камере.

Латексные препараты получали путём нагрузки 7% полистирольного латекса модифицированного метакриловой кислотой. Латекс получен из института синтетического каучука (Санкт-Петербург). К 3% взвеси латекса добавляли иммуноглобулины, разведенные по белку: (2мг/мл, 1мг/мл, 0,5мг/мл, 0,25мг/мл, 0,125мг/мл), предварительно растворив из сухого лиофильно высушенного препарата. Для определения параметров, необходимых для получения препарата, использовали фосфатный буфер (pH 7,2), глицериновый буфер (pH 8,2), бычий сывороточный альбумин, азид натрия. Нагрузку латекса осуществляли при +37є С 2 ч при постоянном помешивании, остужали при комнатной температуре без доступа света, затем - в холодильнике при +4єС. Отмывание производили при центрифугировании при 8000 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли холодный глицериновый буфер (pH 8,2) с бычьим сывороточным альбумином, инозит натрия и встряхивали, отмывая затем 3 раза. Полученные латексные препараты для определения антигенов «a», «b», «c», «d», «f», «e» испытывали с живыми и формалинизированными культурами при разных разведениях с латексными препаратами с разной степенью нагрузки (2мг/мл, 1мг/мл, 0,5мг/мл, 0,25мг/мл, 0,125мг/мл).

Контролями служили забуференный физиологический раствор и частицы латекса без белковой нагрузки. Оптимальными концентрациями иммуноглобулинов при сенсибилизации латекса явилась нагрузка для иммуноглобулиновых препаратов H. influenzae: «a» - 2,0 мкг/мл; H. influenzae «b»- 0,5 мкг/мл, H. influenzae «c» -1 мкг/мл, H. influenzae «d» -1 мкг/мл, H. influenzae «f»-1 мкг/мл, H. influenzae «e»-1 мкг/мл. Чувствительность латексных препаратов (ЛП) определяли с гретыми культурами H.influenzae «a», «b», «c», «d», «f», «e» в концентрации: 5х10⁹, 5х10⁸, 5·х10⁷, 5х·10⁶, 5х10⁵, 5х10⁴, 5х10³, 5х10² КОЕ. Чувствительность при выделении H.influenzae «b» ПРФ составила 12,5 нг/мл, при типировании культур в реакции латекс-агглютинации составила 5Ч10⁵ КОЕ/мл. Специфичность определяли в реакции латекс-агглютинации культур разных сероваров и нетипируемых штаммов H. influenzae .

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Для разработки диагностических препаратов для типирования капсульных штаммов типоспецифическими сыворотками к капсульным антигенам использовали инокуляты штаммов H.influenzae всех сероваров в концентрации: 5·10⁹, 5·10⁸, 5·10⁷, 5·10⁶, 5·10⁵, 5·10⁴, 5·10³, 5·10² КОЕ. Из них готовили препараты на тонких стеклах из нефлюоресцирующего стекла (фирма «Ниармедик Плюс», Москва). Для удаления группоспецифических антител из каждой из исследуемых кроличьих сывороток применялся сорбент на основе ультраозвученной взвеси H. influenzae других сероваров. На стекла с антигенами H.influenzae наносили разведённые сыворотки, инкубировали во влажной камере при +20⁰С 10 мин. Для выявления комплексов антиген-антитело использовалась антивидовая люминесцирующая сыворотка производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. При микроскопии в люминесцентном микроскопе «Люмам-8» (ЛОМО) оптимальным считали то разведение сыворотки, при котором наблюдалось достаточно интенсивное свечение антигена при постановке реакции с положительными образцами и не наблюдалось - с отрицательными.

Материалы исследований. Обследованы материалы от 1593 больных с подозрением на менингит и 1446 - с другими гнойно-септическими инфекциями, 207 - новорожденных, 253 - с ХНЗЛ; 105 - с острой пневмонией, 399 - с инфекциями Лор-органов; 1061 человек из детских учреждений и 181-здоровых. Проведено микробиологическое исследование следующих клинических биосубстратов: образцы крови - 1892; СМЖ - 1835; раневое отделяемое, пунктаты из ран - 94; пунктаты из плевральной полости - 132; мокрота при острой пневмонии -104, жидкость бронхоальвеолярного лаважа - 452, мокрота при хронических заболеваниях легких - 676, заднеглоточные мазки - 1230, носоглоточные мазки - 56; с конъюнктивы - 340, из половых органов - 96; пунктаты при Лор - инфекциях - 536; сыворотка крови - 1421.

Для определения этиологии инфекций использовали: посевы на кровяной агар на основе Blood agar base, сывороточный агар, желточно-солевой агар (ЖСА), «шоколадный» агар, в соответствии с действующими приказами МЗ (№ 535 от 22.04.85, № 858 от 01.12.88, № 375 от 23.12.98, МУК 4.2.1887-04), и на разработанные автором среды : H. influenzae ЭрДС, H.influenzae ЭрДС-агар с ристомицином, двухфазную среду H.influenzae-ЭрДС. Идентификацию проводили при использовании следующих тест-систем - Api NH, ID Haemo, ID Strep., ID G-; IDC, IDStaph на «ATB Expression»; индикацию антигенов - в «Slidex meningite Kit 5», «Directigen Meningitis combo Test»; МФА M. pneumoniaе, вирусы гриппа А, В, парагриппа, аденовирусы, РС-вирус (НИИ гриппа, НИИМЭ им. Пастера); антитела к M. pneumoniaе определяли в ИФА: SeroMP IgM, SeroMP IgG, МРА Serodia Myco-2; в МФА определяли антитела к C.pneumoniaе C.psittaci, C.trachomatis (IgM, IgA, IgG) (Vircell S.L); в ИФА: SeroСP IgM, SeroMP IgG (Savyon), IgM, IgG, PCHPN, Рneumo (Vircell S.L.). Антитела к S.pneumoniae определяли в ИФА IgG S.pneumoniae, к белкам наружной мембраны и соматическим антигенам H.influenzae в ИФА IgG HIВ, к полирибозилфосфату в ИФА IgG HIB (НИИВС им. И.И. Мечникова), к вирусу гриппа - в РТГА (НИИ гриппа), к L.pneumophila - в МФА Рneumo (Vircell S.L.).

У культур H.influenzae, выделенных из различных локусов, определяли биовар по выделению индола, наличию ферментов орнитиндекарбоксилазы и уреазы; серовар определяли в РА, латекс-агглютинации и РНИФ препаратами, приготовленными нами из полученных кроличьих типоспецифических капсульных сывороток к сероварам «a», «b», «c», «d», «f», «e». Резистентность к антибиотикам АТВNH, АТВHaem на «ATB Expression» (bioMeriuex), дискодиффузионным методом на Haemophilus Test Medium (НТМ)-агаре и методом микроразведений, в-лактамазы определяли в тесте с нитроцефином и в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Контроль качества питательных сред для определения чувствительности к антибиотикам проводили штаммами H.influenzae.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общеупотребительных методов параметрической и непараметрической статистики. КОЕ рассчитывали, исходя из распределения Пуассона. Для оценки частоты различий между показателями, в случаях соответствия вариабельности изучаемых показателей закону нормального распределения, применялся t-критерий Стъюдента. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий) принимали равным 0,05.

3. Результаты исследований и их обсуждение

Основным условием успешного бактериологического исследования является применение высокоэффективных питательных сред для H.influenzae, содержащих «Х» и «V» факторы роста. Сравнительное изучение показателей чувствительности разных сред, приготовленных на основе доступных ингредиентов по принципу «шоколадного» агара с использованием крови человека, свидетельствует о низких показателях выявления H.influenza. Изучение возможных вариантов питательных сред на различной основе с использованием видов крови различных животных и человека, а также термической обработке, позволяет сделать вывод о наиболее высокой эффективности питательных сред с добавлением крови кролика и термической обработки при 75-80єС, что соответствует данным других авторов (Храмова Н.И,1975). Использование этого режима для приготовления сред с кровью человека значительно снижает чувствительность среды за счёт разрушающего действия анти-V-фактора и других возможных ингибиторов крови человека. При термической обработке при 100єС разрушается анти-V-фактор. При этом разрушаетcя и большая часть V-фактора, недостаток которого не позволяет расти H.influenzae без микроорганизмов-саттелитов.

Учитывая трудности практических лабораторий в приобретении крови кролика и дефибринированной крови человека, нами разработан способ приготовления среды оптимального состава. Стандартною эритроцитарную массу, полученную из крови человека, приготовленную в соответствие со стандартными технологиями, принятыми при приготовлении препаратов крови без цитрата натрия, нагревали до 80єС, затем добавляли дрожжевой экстракт и сыворотку крупного рогатого скота. Сравнительная оценка питательных сред по показателю экстинции (Ext), показанная на рисунке 1, свидетельствует о высокой эффективности жидкой среды из крови кролика (среда №2): минимальное значение логарифмической фазы роста (t_лаг=0,45), при времени регенерации (G_min=0,87), максимальное значение удельной скорости роста (M_max=0,7).

Увеличение длительности лог-фазы и минимального времени генерации свидетельствует о меньшей эффективности среды, приготовленной из эритроцитарной массы крови человека (среда № 1 - ЭрДС) по сравнению со средой из крови кролика, но значительно превосходит по эффективности среды из крови человека (на рис. 1 - среда №3). Чувствительность среды «H.influenzae-ЭрДС-агар» (Эр - эритоцитарная масса, Д - дрожжевой экстракт, С - сыворотка крупного рогатого скота) составила 10⁶ - 10⁷ КОЕ /мл.

Рис. 1. Оптическая плотность культуры H.influenzae на различных жидких питательных средах. По оси ординат - значения оптической плотности, выраженные в lg (Ext tЧ100) при 540 нм, по оси абсцисс - время взятия пробы: 1) среда ЭрДС, 2) среда с кроличьей кровью, 3) среда с кровью человека.

По изложенному принципу готовится и «двухфазная» среда, где плотной фазой служит среда ЭрДС, приготовленная на основе питательного агара, а жидкой - жидкая питательная среда ЭрДС, приготовленная на основе питательного бульона, осветлённая при центрифугировании.

Использование «двухфазной» среды для посева материала позволило выделить возбудителей из стерильных локусов при менингите и сепсисе в 2,1 раза чаще, чем при использовании традиционных сред, рекомендованных приказами МЗ № 535 от 22.04.85, № 858 от 01.12.88, № 375 от 23.12.98. Применение «двухфазной» среды ЭрДС имеет следующие преимущества перед использованием первичных посевов на пластинчатые среды:

· в зависимости от количества возбудителя в материале существенно ускоряется первый этап выделения культуры - в течение 3 - 4 - 6 часов;

· прозрачность плотной и жидкой фазы упрощает визуальные исследования;

· микроскопия мазка из жидкой фазы, окрашенного по Граму и Бурри-Гинсу, увеличивает информативность в изучении морфологии бактерий;

· культура, выросшая в жидкой среде, может использоваться для реакции агглютинации при сероидентификации и определения биовара;

· осадок, полученный после центрифугирования из жидкой фазы, может быть использован для ускоренного выявления в-лактамаз в хромогенном тесте, что способствует ранней этиотропной антибиотикотерапии;

· культура может быть использована для определения резистентности к антибиотикам методом диффузии в агар.

Важным является также то, что «двухфазная» среда ЭрДС предлагаемого состава и способа приготовления, является пригодной для выделения других прихотливых возбудителей. Так, с помощью ЭрДС «двухфазной» среды удалось выделить из ликвора как H.influenzae, так и N.meningitidis и S.pneumoniae.

Полученные по оригинальной схеме типоспецифические капсульные сыворотки к полисахаридам H.influenzae «а», «b», «с», «d», «е», «f», в реакции агглютинации имели титр специфических агглютининов от 1:1024 до 1:25600. В развернутой реакции агглютинации все типовые сыворотки агглютинировали с гетерологичными капсульными бактериями не более чем на 1/4 титра специфических антител. С целью устранения гетерологичных антител применяли прогревание и истощение гетерологичными капсульными штаммами H.influenzae.

Чувствительность и специфичность полученных диагностических капсульных сывороток определяли в реакции агглютинации и в реакции преципитации с штаммами H.influenzae. Чувствительность латексного препарата H.influenzae «b» определяли в агглютинации с полирибозилфосфатом (ПРФ). Чувствительность при индикации ПРФ, полученного из H.influenzae «b» составила 12,5 нг/мл, при определении сероварианта культур в реакции агглютинации латекса составила 5х10⁵ КОЕ/мл. Чувствительность РНИФ при определении сероваров штаммов - 5х10² КОЕ/мл.

При использовании диагностических препаратов в реакции агглютинации, латекс-агглютинации, РНИФ сероварировали 348 штаммов H.influenzae, выделенных из различных мест локализации, 21,8% штаммов которых имели капсулу, из них 78,8% штаммов отнесены к серовару «b», 1,3% - к серовару «а», 1,1% - к серовару «с», 11,0% - к серовару «d», 9,7% - к серовару «f».

Из крови при гнойном менингите, септицемии выделены H.influenzae «b» - 12 штаммов, из ликвора H.influenzae «b» - 31, при остеомиелите из крови - 1 штамм серовара «b»; при деструктивной пневмонии из крови - 1 штамм H.influenzae «d», при септической пневмонии из крови штамм серовара «b» -1; при фульминантном сепсисе из материала аутопсии - 4 штамма H.influenzae «b».

При первично-локализованных инфекциях выделены: при гнойном синусите из материала пункции пазух - 22 нетипируемых штамма H.influenzae; из отделяемого при конъюнктивите 19 штаммов нетипируемых H.influenzae; из раны при воспаление орбиты глаза - 1 штамм, из мокроты при острой пневмонии - 27 нетипируемых и 1 штамм H.influenzae «b».

Из мокроты детей с хроническими заболеваниями лёгких выделено 52 штамма, из них 5 штаммов капсульных («b»-2, «d»-1, «f»-2); из материала бронхоальвеолярноного лаважа выделено 48 штаммов, из них 6 капсульных («b» - 2, «d» - 2, «f» - 2); при хроническом пиелонефрите из мочи 4 нетипируемых штамма, при вульвите из отделяемого со слизистой вульвы-3 нетипируемых штаммов H.influenzae

Результаты ИФА по определению H.influenzae серовара «b», выраженные в величинах оптической плотности (ОП), во всех случаях находились в прямо пропорциональной зависимости от концентрации изучаемых антигенов, представлены результаты определения разрешающей способности тест-системы по выявлению Н.influenzaе «b». Минимальная концентрация Н.influenzaе (нижний уровень детекции), выявляемая с помощью «сэндвич»- метода ИФА составила 7х10⁴-10⁵ КОЕ/мл. Для определения воспроизводимости метода и стабильности реакции использовали контрольные штаммы Н.influenzae «b»: штамм «b» 11/64, 94505/80 и штаммы 98 «b» и 99 «b», выделенные из ликвора и крови больного. Небольшие вариации оптической плотности были получены при исследовании одинаковых количеств Н.influenzae «b» разных штаммов. Проведенные на основании полученных данных расчеты показали, что ошибка количественного определения клеток указанных штаммов при использовании Н. influenzae II/64 «b» в качестве стандарта не превышает 15%, т.е. находится во вполне допустимых пределах. Различия коэффициентов вариации и дисперсий оптической плотности результатов реакции по определению разных штаммов свидетельствуют о недостоверности различий (р<0,05), поэтому результаты обнаружения Н.influenzae «b» при помощи диагностической тест-системы можно считать воспроизводимыми и стабильными. Диагностическая тест-система «сэндвич» варианта ИФА позволяет обнаружить 10-15 нг/мл растворимого липополисахаридного антигена Н. influenzae.

Контроль специфичности разработанной тест - системы осуществляли двумя способами: реакцией торможения и при постановке реакции с гетерологичными антигенами. Реакцию торможения проводили на стадии взаимодействия антигенов с иммобилизованными антителами, добавляя в реакционную смесь те же антитела в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Наибольшую специфичность предложенного варианта «сэндвич-ИФА» по индикации Н.influenzae определяли при исследовании бактерий различных групп, которые имеют общие антигены с Н.infiuenzae или могут встречаться в тех биологических субстратах, которые предстоит исследовать для обнаружения антигенов Н.influenzaе.

Для определения чувствительности и специфичности разработанной системы ИФА по выявлению антигенов H.influenzae сероварианта «b» провели серию опытов со штаммами микроорганизмов разных видов и родов. Результаты исследований по определению специфичности тест-системы, показанные на рис. 2, свидетельствуют, что другие бактерии не выявляются в максимальной концентрации 5х10⁷ КОЕ/мл.

Несмотря на определенное антигенное сходство Н. influenzae с пневмококками 6-го типа, другими бактериями рода Haemophilus, конъюгат не выявлял их антигены в концентрации в 100 раз превышающий уровень Н.influenzae-антигенов. При концентрации бактерий менее 2х10⁶ КОЕ/мл разница оптической плотности в пробах, содержащих антигены «b» и других серовариантов (в большей степени сероварианта «с») незначительна, поэтому в концентрациях 10⁴-10⁵ КОЕ/мл, отличие серовара «b» от серовара «с» затруднено.

Рис. 2. Определение специфичности тест-системы «сэндвич»-варианта ИФА в чистых и смешанных бактериальных культурах. По оси абсцисс - концентрация бактериальных клеток КОЕ/мл (х10⁴), по оси ординат - оптическая плотность при 450 нм. 1-H. influenzae «b» II/64; 2-E. cоli + H. influenzae «b» II/64; 3-S. pneumoniae 6A; 4-P. aeruginosa I; 5-K. pneumoniae; 6-Y. enterocolitica; 7-N. meningitidis «C».

Сравнение результатов индикации Н. influenzae «b» в концентрации 5х10⁵ с сероваром «с» в концентрации 10⁷ КОЕ/мл и сероваром «f» в концентрации 2х10⁶ КОЕ/мл показало (рис. 2), что разница в оптической плотности с учетом коэффициента вариации и различия дисперсий не достоверна (р < 0,05).

Несмотря на определенное антигенное сходство Н. influenzae с пневмококками 6-го типа, другими бактериями рода Haemophilus, конъюгат не выявлял их антигены в концентрации в 100 раз превышающий уровень Н.influenzae-антигенов. При концентрации бактерий менее 2х10⁶ КОЕ/мл разница оптической плотности в пробах, содержащих антигены «b» и других сероваров (в большей степени серовара «с») незначительна, поэтому в концентрациях 10⁴-10⁵ КОЕ/мл, отличие серовара «b» от серовара «с» затруднено. Результаты реакции по определению Н. influenzae, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о затруднении в дифференциации серовара «b» от других сероваров Н. infiuenzae. В то же время результаты реакции с другими видами гемофильных микроорганизмов (Н.parainfluenzae, Н.haemolyticus) не превышают отрицательный контроль. На основании этих исследований можно считать предложенный вариант диагностической тест-системы видоспецифическим, позволяющим определить антигены Н. infiuenzae «а», «b», «c», «d», «e», «f».

Таким образом, показана возможность использования разработанной диагностической тест-системы для обнаружения антигенов в чистых и смешанных культурах, а также в ликворе.

Рис.3. Специфичность «сэндвич» варианта ИФА для определения капсульного полисахарида «b»в сравнении с другими серовариантами. По оси абсцисс - концентрация бактерий в КОЕ/мл (Ч10⁴), по оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.1 - Н.influenzae «b»; 2 - Н. influenzae «c»; 3 - Н. influenzae «f»; 4 - Н.influenzae «e»; 5 - Н.influenzae «d»; 6 - Н. parainfluenzae; 7 - Н. haemolyticus; 8 - Н. рarahaemolyticus.

Разработанный вариант тест-системы по индикации антигенов в ИФА следует считать видоспецифическим, позволяющим обнаружить антигены сероваров Н.influenzae. При этом чувствительность составила 10-45 нг/мл по обнаружению антигена и свыше 7х10⁴-10⁵ КОЕ/мл при хорошей специфичности, воспроизводимости и достоверности исследований.

Предложенные тест-система ИФА, диагностические агглютинирующие капсульные сыворотки, питательные среды (ЭрДС) и способы их приготовления для культурального исследования ликвора и крови, позволили установить этиологический диагноз, определить серовар и биовар при первично-локализованных и инвазивных инфекциях, вызванных Н.influenzae, в том числе у детей с гнойным менингитом, при септической пневмонии, фульминантном сепсисе, остеомиелите. В таб.1 представлены результаты микробиологического исследования крови и ликвора при первичных гнойных менингитах, вызванных Н.influenzae, проведенных различными методами в 1986-2005г.г. Диагноз гнойного менингита, вызванного Н.influenzae, удалось установить с помощью разработанных методов (ИФА, среда ЭрДС) у 32 больных и только у 9 - с помощью и других методов. Как показано в таб.1, у 5 больных микробиологический диагноз был подтверждён при использовании рекомендуемых культуральных методов и у 4 - при индикации антигена методом латекс-агглютинации с использованием коммерческих диагностикумов.

Бактериальные менингиты, вызванные Н.influenzae, диагностированы в течение периода наблюдений неравномерно, как показано на рисунке 4, в Свердловске- Екатеринбурге H.influenzae были выявлены у 2-9% больных детей в возрасте от 1 месяца до 14 лет, поступивших в стационар с признаками первичного (внебольничного) гнойного менингита. Во всех случаях выявлялись Н.influenzae серовара «b», но разных биовариантов: I, II, III.

Таблица 1 Микробиологическая диагностика H. influenzae- менингита различными методами

Примечание:«-» - не исследовались;«0» - отрицательный результат;«[ ]» - выявлены и другими методами;« 1 » - выявлено только указанными методом; **шоколадный агар из человечеcкой крови

Менингиты, вызванные H.influenzae, встречались у детей в возрасте от 3 месяцев до 5 лет, что соответствует результатам исследований гнойных менингитов в Москве (Королёва И.С., 2005). На рисунке 5 показаны случаи менингита в зависимости от возраста: у детей до 3 месяцев и не достигших 6 лет H.influenzae не обнаружены. Необходимо отметить, что H.influenzae-менингиты у детей 5 лет, но не достигших 6 лет, обнаружены не во все годы наблюдения Наибольшее количество заболевших детей было выявлено в возрасте от 1 до 3 лет. С достоверностью 99% доказано, что чаще H.influenzae-менингит встречается у детей до 3 лет, чем у детей старше этого возраста (р < 0,001).

Рис. 4. Выявление случаев первичных гнойных менингитов с установленной этиологией в Свердловске-Екатеринбурге в периоды 1986-1988, 1995-2001г.г. По оси абсцисс абсолютное количество случаев разной этиологии, по оси ординат - периоды времени (год).

Наибольшее количество заболевших детей было выявлено в возрасте от 1 до 3 лет. Для сравнения частоты выделения всех возбудителей, обнаруженных в крови и ликворе, на рисунке 6 приведены результаты исследования 639 случаев гнойных менингитов, этиология которых в 173 (25,2%) случаях установлена у детей в возрасте менее и равном 5 лет.

Рис. 5. Количество случаев H.influenzae-менингита у детей в зависимости от возраста. По оси абсцисс - группы детей разных возрастов: до 3 месяцев; от 3 месяца до 1 года; старше 1 года до 3 лет; от 3 до 5 лет включительно, от 6 до 14 лет включительно. По оси ординат - абсолютное число случаев.

Рис. 6. Частота выявления возбудителей среди гнойных менингитов установленной этиологии у детей в возрасте до 5 лет включительно в Екатеринбурге в периоды 1986-1988г, 1995-2001г., в % (173 случаев с установленной этиологией).

У детей в возрасте до 6 лет первичные гнойные менингиты были вызваны преимущественно менингококками - в 40% случаев, H.influenzae - в 20%, в - 14%. Необходимо отметить, что частота выявления пневмококка и H.influenzae в разные годы отличается, но менингиты, вызванные пневмококком, всегда встречаются достоверно реже, чем менингококковые, и в некоторые годы реже, чем H.influenzae.

При исследовании ликвора у детей при внутрибольничных менингитах и инфекциях церебро-спинального шунта на этапах шунтирующего лечения гидроцефалии H. influenzae не обнаружены.

Среди штаммов H. influenzae, выделенных со слизистой носоглотки, капсульные штаммы всех серовариантов, за исключением сероварианта «а», как показано на рисунке 7, составили 14%. Среди всех штаммов H. influenzae, серовар «b» составил 5%, среди обследованных-1,6%

Рис.7. Cерологические варианты капсулы среди штаммов H.influenzae (n=74), выделенных со слизистой задней стенки носоглотки у детей (в %).

Фенотипическая структура штаммов H.influenzae, выделенных от больных, здоровых первой группы здоровья, в коллективах детей разных возрастов отличается и зависит от времени года: у 12% - в летнее и у 39% здоровых детей - в зимнее время, у 20-25% детей с хроническими заболеваниями - вне зависимости от времени года. На слизистой носоглотки здоровых детей встречаются преимущественно нетипируемые штаммы всех биоваров, реже IV, V, IV биоваров. У здоровых первой группы наибольшая (64%) частота выявления нетипируемых штаммов VIII биовара.

Штаммы H.influenzae, выделенные при первично-локализованных и инвазивных инфекциях, имели разные биоварианты. Инвазивные формы , в том числе менингит, сепсис, остеомиелит, были вызваны биоварами I, II, реже III. Превично-локализованные формы инфекции, такие как средний отит и другие Лор-инфекции, конъюнктивит, хронические воспалительные заболевания лёгких, вызваны I, II, III биоварами, а также VII, реже VIII. На рисунке 8 показана частота выявления разных биовариантов, выделенных при различной патологии.

По-видимому, обнаружение на слизистой носоглотки детей капсульных штаммов серовара «b» I, II, III биоваров является потенциально опасным в связи с тем, что эти биоварианты и сероварианты чаще вызывают первично-локализовнные и инвазивные H.influenzae-инфекции.

Рис. 8. Частота выделения биовариантов при различных инфекциях , вызванных H.influenzae. По оси абсцисс - биовары, по оси ординат -частота выявления биоварианта(I,II, III, V, VI, VII, VIII ) в % при:1) первично-локализованных инфекциях; 2)при инвазивных инфекциях.

При тестировании 268 штаммов H.influenzae к антибактериальным препаратам выявлены фенотипы резистентности, отличающиеся у нетипируемых и капсульных штаммов. В табл. 2 показаны фенотипы резистентности к в-лактамным антибиотикам нетипируемых штаммов H.influenzae, выделенных в 200-2005 г.г. Преимущественно распространены штаммы, не продуцирующие в-лактамазу, и чувствительные к ампициллину. Появление небольшого количества штаммов, продуцирующих в-лактамазу и резистентных к ампициллину (5,1%), в-лактамазанегативных, резистентных или умеренно резистентных к ампициллину (3,6%), свидетельствует о возможном распространении штаммов с разными механизмами резистентности.

Таблица 2 Частота выявления фенотипов резистентности к в-лактамам у нетипируемых штаммов H.influenzae

Нетипируемые штаммы, выделенные в течение 2000-2005г.г. были резистентны к цефалоспоринам 1 поколения; к цефуроксиму и цефаклору - 4,4%; чувствительны к ампициллину -79,2). в-лактамазы обнаружены у 5,1%. Не наблюдалось увеличения количества резистентных штаммов за последние пять лет к хлорамфениколу, тетрациклину, рифампицину, к фторхинолонам. Выявлено увеличение резистентных к триметоприм/сульфаметоксазолу нетипируемых штаммов (10,9%). 2,6% исследованных штаммов являются в-лактамазо-негативными, ампициллинорезистентными; 1% - в-лактамазонегативными, умеренно резистентными к ампициллину. Штаммы серовара «b», выделенные при инвазивных формах инфекции, были резистентны к цефалоспоринам I поколения, чувствительны к другим цефалоспоринам, ампициллину, хлорамфениколу. Результаты резистентности к антибактериальным препаратам показаны на рисунке 9.

Рис. 9. Чувствительность штаммов H.influenzae ( n=289), выделенных в 2000-2006 годах, к различным классам антибактериальных препаратов:

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

- умеренно резистентные,

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

- резистентные,

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

- чувствительные.

инфекция антиген серовар иммунофементный

Выводы

1. Усовершенствованные и разработанные микробиологические методы позволяют увеличить выявление гнойно-септических инфекций, вызываемых H.influenzae, и выявить распространение фенотипов H.influenzae у больных и здоровых детей.

2. Доказаны и успешно реализованы диагностические возможности авторских питательных сред - ЭрДС, двухфазной, транспортной, и способа выделения H.influenzae со слизистой носоглотки, что позволило на 28% увеличить выделение возбудителя при первично-локализованных инфекциях и в три раза при инвазивных H.influenzae-инфекциях. Доказана необходимость контроля ростовых свойств питательных сред и определены критерии, предъявляемые к тест-штамму Н.influenzaе. Диагностическая эффективность разработанных культуральных методов позволила определить роль H.influenzae в структуре гнойных менингитов.