Молекулярно-генетические маркеры риска генерализованного пародонтита и их применение в диагностике
Разработка теста-системы для идентификации основных пародонтопатогенов. Оценка информативности использования молекулярно-генетических маркеров для диагностики и контроля лечения воспалительных заболеваний пародонта, вызванных анаэробными микробами.
Рубрика | Медицина |
Вид | автореферат |
Язык | русский |
Дата добавления | 23.01.2018 |
Размер файла | 203,4 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
На правах рукописи
УДК 616. 314. 17 - 008.1: 579
03.00.07. - микробиология
14.00.36. - аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Молекулярно-генетические маркеры риска генерализованного пародонтита и их применение в диагностике
Николаева Елена Николаевна
Москва - 2007
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»
Научный консультант:
Доктор медицинских наук, профессор ЦАРЕВ Виктор Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор ПАШКОВ Евгений Петрович - ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава, г. Москва
доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович - ГНЦ РФ Институт иммунологии ФУ “Медбиоэкстрем” при МЗ РФ, г. Москва
доктор медицинских наук, профессор Романов Виталий Александрович - ГОУ ВПО ЯрГМА Росздрава, г. Ярославль
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава.
Защита состоится 2007 года на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.08 при ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова» по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.
Автореферат разослан 2007 года
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Миронов Андрей Юрьевич
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Среди важнейших проблем современной стоматологии воспалительные заболевания пародонта занимают одно из ведущих мест. Главной причиной потери зубов в средней и старшей возрастных группах населения нашей страны является пародонтит (Барер Г.М., Лемецкая Т.И., 2001; Баррер Г.М. и др., 2006; Безрукова И.В., Грудянов А.И., 2002).
Проявление и прогрессирование признаков пародонтита зависит от многих факторов и детерминант, включая индивидуальные особенности субъекта, социальные, поведенческие, системные, генетические факторы, изменения на уровне зубов, микробный состав зубного налета, и другие индикаторы и факторы риска (Hughes F.J. et al., 2006; Kinane D.F. et al., 2006). В связи с большим количеством признаков, влияющих на развитие и прогрессирование пародонтита, трудно понять, в результате каких процессов происходит инициирование и прогрессирование заболевания. Не всегда понятно, какие из этих терминов применяют в стоматологической литературе, каким образом клиницисты используют такую информацию. Однако, в зависимости от результатов оценки факторов, связанных с началом и прогрессированием заболеваний пародонта, выбирают дизайн исследования и уровень значимости результатов измерения, определяющих силу ассоциаций каждого индикатора риска и их использование для принятия клинического решения (Pihkstrom B.L., 2001; Ronderos M., Ryder M.I., 2004; Velden van der U., 2006). В настоящее время не существует специфических и чувствительных диагностических тестов определения возможного прогрессирования заболевания на уровне индивидуума (Heitz-Mayfield L.J.A., 2005; Kornman K.S., 2005).
Ведущая роль в формировании воспалительного процесса в полости рта принадлежит резидентной облигатной анаэробной и микроаэрофильной микрофлоре. К агентам, индуцирующим длительное воспаление и разрушение тканей десны и альвеолярного отростка, обычно относят экзо- и эндотоксины пародонтопатогенных бактерий Haemophilus actinomycetemcomitans (Actinobacillus actinomycetemcomitans), Tannerella forsythensis (Bacteroides forsythus), Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и др. (Дунязина Т.М., Bauermeister C.D., 2001; Царев В.Н. и др. 2005; Ezzo P.J., Christopher W.C.,2003; Feng Z., Weinberg A., 2006; Tanner A.C.R. et al., 2006). В связи с этим основной целью терапии заболеваний пародонта является уничтожение его возбудителей и устранение отрицательных последствий их воздействия на окружающие ткани. Трудности лечения воспалительных процессов в тканях пародонта связаны с наличием, так называемых, торпидных или устойчивых к терапии форм пародонтита, которые в определенной степени связаны с длительной персистенцией пародонтопатогенных видов микробов. Ранее в нашей стране диагностика данных видов бактерий не проводилась из-за отсутствия соответствующих методов их выявления. В настоящее время в достаточной степени не установлена роль вирусной инфекции в этиологии генерализованного пародонтита. Остается также открытым вопрос о характере изменений иммунного статуса больных пародонтитом при персистенции вирусов. Дальнейшей разработки требуют методы диагностики и лечения этого заболевания.
Исход и течение инфекционного процесса в пародонте могут быть предопределены не только вирулентностью микробов, но и генетическим полиморфизмом организма человека (Hodge P., Michalowicz B., 2001; Kornman K.S., 2006; Takashiba S., Naruishi K., 2006). Исследование полиморфизма генов HLA и IL - 1 (Kornman K.S. et al., 1997,1998; Николаева Е.Н. и др., 2003; DґAuito F. et al., 2004; Kornman K.S., 2006) может играть важную роль для выявления предрасположенности и прогнозирования течения воспалительных заболеваний пародонта. Однако полученные к настоящему времени результаты во многом противоречивы и неоднозначны, что требует дальнейшего более детального изучения данной проблемы. В нашей стране подобные исследования ранее не проводили. Современное развитие науки позволило разработать и внедрить в диагностическую практику более совершенные, информативные и достоверные методы исследований, позволяющие по-новому оценить этиологию и патогенез воспаления, уточнить некоторые неясные до недавнего времени этиопатогенетические механизмы. Поэтому представляется необходимым разработать и внедрить в практику отечественные наборы реактивов для выявления генетических маркеров пародонтопатогенов с помощью полимеразной цепной реакции. Актуальным является более пристальное и всестороннее изучение микробиологических и иммуногенетических маркеров риска пародонтита и их использование в многофакторном анализе.
Цель исследования
Целью диссертационной работы являлось повышение эффективности диагностики генерализованного пародонтита на основании разработки микробиологических и иммуногенетических критериев.
Задачи исследования
Разработать тест - систему (набор реактивов) для идентификации основных пародонтопатогенов (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Treponema denticola) с помощью молекулярно-генетических методов.
Оценить информативность использования молекулярно-генетических маркеров для диагностики и контроля лечения воспалительных заболеваний пародонта, вызванных анаэробными микробами.
Изучить видовой состав основных пародонтопатогенов (P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus, A. actinomycetemcomitans и T. denticola) с помощью новой отечественной тест-системы “Мультидент - 5” и их ассоциаций с клиническими параметрами у больных хроническим генерализованным пародонтитом и лиц со здоровым пародонтом.
Исследовать роль вирусов семейства Herpesviridae (HSV 1 и HSV 2 типа, EBV и CMV) в этиопатогенезе генерализованного пародонтита.
Определить с помощью высокоразрешающего метода ДНК - типирования особенности аллельного полиморфизма генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1), характерные для представителей смешанной популяции г. Москвы, чувствительных и резистентных к пародонтиту.
Оценить полиморфизм генов IL - 1б и IL - 1в у больных генерализованным пародонтитом тяжелой степени в различных возрастных группах и людей со здоровым пародонтом с помощью молекулярно-генетических методов исследований (полимеразной цепной реакции и обратной гибридизации).
Обосновать критерии определения микробиологических и иммуногенетических индикаторов риска генерализованного пародонтита для оптимизации диагностики и прогнозирования характера течения воспалительных заболеваний пародонта с помощью однофакторных и многофакторных методов статистического анализа.
Разработать алгоритм прогнозирования глубины пародонтального кармана у пациентов на основе линейной регрессионной модели, включающей данные выявления основных пародонтопатогенных бактерий, вирусов и параметров иммуногенетического статуса пациента.
Разработать алгоритм диагностики степени тяжести хронического генерализованного пародонтита, основанный на построении полиномиальной логистической регрессии с упорядоченным откликом, включающей в качестве предикторов микробиологические и иммуногенетические показатели пациента.
Разработать алгоритм диагностики поражений тканей пародонта, ассоциированных с герпесвирусной инфекцией, на основе комплексной оценки данных иммуноферментного определения антител к вирусам и обнаружения ДНК пародонтопатогенов и вирусов молекулярно-биологическим методом.
Научная новизна
В представленной работе впервые в Российской Федерации:
1) разработан и всесторонне апробирован набор реактивов для молекулярно-генетического выявления ДНК пяти основных пародонтопатогенных бактерий - A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, B. forsythus и T. denticola;
2) уточнена этиологическая роль перечисленных выше и некоторых других видов микроорганизмов и установлена степень их участия в развитии острого и хронического воспаления тканей пародонта; выявлены маркеры ДНК вирусов герпеса 1 и 2 типов типов, вируса Эпштейна - Барр и цитомегаловирусов в содержимом пародонтальных карманов у больных хроническим генерализованным пародонтитом с помощью полимеразной цепной реакции и изучена относительная частота их выявления;
3) с помощью молекулярно - генетических методов исследований изучена взаимосвязь аллельного полиморфизма генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) и генов IL - 1б и IL - 1в у представителей смешанной популяции г. Москвы, чувствительных и резистентных к пародонтиту, с особенностями течения воспалительного процесса и предрасположенностью к развитию генерализованного пародонтита;
4) определена диагностическая ценность факторов и индикаторов риска для оптимизации диагностики и прогнозирования характера течения воспалительных заболеваний пародонта;
5) определены наиболее значимые диагностические и прогностические критерии осложненного характера течения воспалительного процесса на основании анализа микробиологических и иммуногенетических показателей;
6) разработаны алгоритмы комплексной клинико - лабораторной, иммуногенетической и микробиологической диагностики генерализованного пародонтита, позволяющие обосновать и уточнить этиопатогенетический диагноз заболевания, назначать адекватную антимикробную терапию, направленную на элиминацию патогенов, создать оптимальные условия для последующего хирургического или ортопедического лечения, контролировать стабильность наступившей ремиссии и своевременно прогнозировать возможные рецидивы заболевания.
Практическая значимость
Улучшение квалифицированной помощи пациентам с хроническими воспалительными заболеваниями пародонта за счет более совершенной диагностики и более глубоких теоретических знаний особенностей развития и течения воспалительных процессов в пародонте.
Предложен новый отечественный набор реактивов для диагностики и контроля эффективности лечения воспалительных заболеваний пародонта с использованием молекулярно-генетических методов исследований.
Определен исходный микробиологический статус населения в различных возрастных группах и выявлены группы людей с риском развития воспалительных заболеваний пародонта, что позволяет провести профилактику повторного заражения членов семьи больного. Полученный массив данных может быть использован в качестве контроля для дальнейших исследований данной проблемы.
Установлена взаимосвязь аллельного полиморфизма генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1), IL - 1б и IL - 1в у представителей смешанной популяции г. Москвы, чувствительных и резистентных к пародонтиту, с особенностями течения воспалительного процесса и предрасположенностью к развитию пародонтита и может быть использована в исследованиях по проблеме “HLA и болезни”.
Разработаны новые критерии на основании микробиологических и иммуногенетических показателей для постановки правильного диагноза и выбора соответствующего способа лечения, получения объективных данных об эффективности проводимого лечения.
Обосновано применение молекулярно - биологических и иммуноферментных методов для диагностики и контроля эффективности лечения герпесвирусной инфекции у больных хроническим генерализованным пародонтитом. Предложен соответствующий диагностический алгоритм.
Положения, выносимые на защиту
Новая отечественная тест - система “Мультидент - 5” позволяет определять ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции и предназначена для использования в диагностике и контроле лечения воспалительных заболеваний пародонта, вызванных анаэробными микробами.
Факторами риска хронического генерализованного пародонтита являются P. gingivalis или комбинации B. forsythus и T. denticola; P. intermedia, B. forsythus и P. gingivalis; P. intermedia, B. forsythus, T. denticola и P. gingivalis; P. intermedia, B. forsythus, T. denticola, P. gingivalis и A. аctinomycetemcomitans.
Индикаторами риска развития и прогрессирования хронического генерализованного пародонтита являются пародонтопатогенные виды бактерий P. intermedia, B. forsythus, T. denticola и A. actinomycetemcomitans; вирусы семейства Herpesviridae: HSV 1 и HSV 2 типа, EBV и CMV, cпецифичность DRB1 *04 и аллель DQA1 *0301 генов HLA класса II.
Аллели генов HLA - DRB1 *01 и HLA - DQA1 *0101 ассоциированы с устойчивостью к различным формам генерализованного пародонтита.
Cпецифичность HLA - DRB1 *04 и аллель DQA1 *0301 являются маркерами риска хронического генерализованного пародонтита, ассоциированного с вирусами семейства Herpesviridae, “протективными” свойствами обладают специфичность HLA - DRB1 *01, аллель локуса DQA1 *0501 и DQB1 *0501.
Предрасположенность к развитию агрессивной формы хронического генерализованного пародонтита у лиц молодого возраста европеоидного происхождения в смешанной популяции г. Москвы ассоциирована с полиморфизмом гена IL - 1б, локализованного в позиции -899, и гена IL - 1в ? в позиции +3953. пародонтопатоген генетический воспалительный микроб
Алгоритмы лабораторной диагностики пародонтита на основе статистических моделей (линейной и полиномиальной логистической регрессии с упорядоченным откликом) включают микробиологические и иммуногенетические показатели риска генерализованного пародонтита.
Алгоритм диагностики поражений тканей пародонта, ассоциированных с герпесвирусной инфекцией, основан на комплексной оценке данных иммуноферментного определения антител к вирусам (определение стадии ГВИ) и обнаружения ДНК пародонтопатогенов и вирусов молекулярно-биологическим методом (окончательный диагноз).
Внедрение результатов исследования
Разработана новая медицинская технология № ФС-2006/043 - У “Диагностика и прогнозирование течения заболеваний пародонта с применением молекулярно-биологических и иммуноферментных систем”.
Результаты исследования внедрены в практику работы кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии; кафедры стоматологии общей практики и подготовки зубных техников №2 ФУВС, лаборатории молекулярно - биологических исследований НИМСИ и Клинико - диагностического центра ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава.
Материалы диссертации используются в процессе обучения студентов, интернов, клинических ординаторов и аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и кафедрах стоматологического профиля ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава.
Разработан и внедрен в практику кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ набор реактивов для выявления пяти видов пародонтопатогенов с помощью молекулярно - генетических методов исследований.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции “Профилактика основных стоматологических заболеваний” (г. Москва, 2003); Российско - норвежском симпозиуме “Заболевания пародонта - актуальные проблемы” (г. Москва, 2004); X и XI Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (г. Москва, 2003, 2004 гг); Втором съезде общества биотехнологов России (г. Москва, 2004); Всероссийском симпозиуме “Актуальные проблемы стоматологии”, Всероссийского конгресса “Современные методы профилактики и лечения заболеваний пародонта” (г. Уфа, 2004); Всероссийской научно-практической конференции - Первого Всероссийского стоматологического форума “Дентал Ревю” (г. Москва, 2004); II Всероссийской научно-практической конференции “Образование, наука и практика в стоматологии” (г. Москва, 2005); Второй и третьей научно-практической конференции “Актуальные проблемы медицинской биотехнологии” (г. Анапа, 2005, 2006); III Всероссийской научно-практической конференции “Образование, наука и практика в стоматологии” (г. Москва, 2006); Четвертом съезде общества биотехнологов России. (Москва, 2006); VIII международном конгрессе МАКМАХ/ASM по антимикробной терапии (г. Москва, 2006); IV Всероссийской научно-практической конференции “Образование, наука и практика в стоматологии” (г. Москва, 2007); совместном совещании кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии, лаборатории молекулярно - биологических исследований и лаборатории иммунологии НИМСИ ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава (протокол № 6 от 18 июня 2007 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликована 51 научная работа, в том числе 12 - в научных изданиях, рекомендованных ВАК МО РФ, учебные пособия - 3, руководство для студентов - 1, методические рекомендации МЗ и СР для врачей - 1; получено положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение; зарегистрирована медицинская технология № ФС-2006/043 - У.
Структура и объем диссертации
Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 385 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 94 рисунками и содержит 80 таблиц. Список литературы включает 72 отечественных и 350 иностранных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В период с 2002 по 2007 годы нами проведено комплексное обследование 684 человек, обратившихся в пародонтологические отделения консультативно-диагностических центров при Московском государственном медико-стоматологическом университете. Из них 122 человека со здоровым пародонтом и 562 больных хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) в стадии обострения, в возрасте от 18 до 72 лет (360 женщин и 324 мужчины) и
давностью заболевания от 3 до 10 лет. На основании эпидемиологических, клинико-анамнестических и лабораторных данных были выделены 4 основные группы:
пациенты с легкой степенью ХГП (77 человек),
больные со средней степенью тяжести заболевания (281 человек),
больные с тяжёлой степенью заболевания (204 человека),
контрольная группа - 122 человека со здоровым пародонтом.
По данным анамнеза, анкетирования и заключений общих специалистов у 473 (84 %) из 562 человек с ХГП выявлены сопутствующие заболевания. Сто девяносто (34 %) пациентов указали на наличие в анамнезе инфекций, вызываемых вирусами семейства Herpesviridae. Все обследованные люди не имели системных заболеваний (ревматоидного артрита, миастении gravis, шизофрении), ассоциированных с полиморфизмом генов IL - 1б, IL - 1в и HLA - системы.
Методическую основу работы составляло выявление в исследуемом материале из пародонтальных карманов больных ХГП и зубодесневой борозды людей со здоровым пародонтом некоторых представителей пародонтопатогенных видов бактерий и вирусов семейства Herpesviridae молекулярно-генетическими и бактериологическими методами, а также изучение полиморфизма генов IL - 1 и HLA - системы у обследованных людей. В качестве исследуемого материала при иммуногенетических исследованиях использовали эпителиальные клетки со слизистой щеки. ДНК выделяли из соскобов по методу Higuchi R. H. и Erlich H. (1989) c некоторыми модификациями. Реакции амплификации проводили на амплификаторе “Терцик MC2” («НПФ ДНК - технология», Россия) по программам, рекомендованным производителем набора. Маркерные пародонтопатогенные виды бактерий выявляли с помощью набора реактивов “Мультидент - 5”, разработанного нами совместно с сотрудниками фирмы ООО «НПФ “Генлаб”», для идентификации ДНК пяти видов пародонтопатогенов с помощью ПЦР и электрофореза в 1,6 % агарозном геле; тест-системы Micro DentR (“Hain Diagnostica”, Германия), позволяющей проводить мультиплексную ПЦР, с последующей регистрацией синтезированных ампликонов методом обратной гибридизации; и классического бактериологического исследования в анаэробных условиях (анаэростат «Himedia», Великобритания, газовая смесь - 80 % азота, 10 % углекислого газа, 10 % водорода). Идентификацию выделенных штаммов проводили на основании комплекса морфологических, культуральных и биохимических признаков. В частности, использовали тест-систему API An 20 (Франция).
Идентификацию ДНК Herpes simplex virus 1 и 2 типов (HSV 1,2), Human cytomegalovirus (CMV) и Epstein - Barr virus (EBV) проводили с помощью ПЦР, используя мультипраймерный набор реагентов “МультиГер - 3”, и набор реагентов для определения ДНК вируса простого герпеса 2 типа (ООО «НПФ “Генлаб”», Москва). Предварительно проводили иммуноферментное определение видоспецифических антител к цитомегаловирусу, вирусу простого герпеса 1, 2 и ядерному белку EBNA-1 p72 в сыворотке периферической крови твёрдофазным методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем Вектор-Бест, (РФ). Исследование полиморфизма генов IL - 1б и IL - 1в проводили с помощью GenoTypeR PRT теста (“Hain Diagnostica”, Германия). Принцип метода основан на DNA-STRIP технологии, позволяющей осуществлять комбинированный анализ основного состава и сочетание аллелей в локусе -889 IL - 1б и +3953 IL - 1-1в генов человека с помощью молекулярно-генетических методов.
Изучение полиморфизма генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) проводили с помощью высокоразрешающего метода ДНК - типирования. Для этого применяли наборы реактивов HLA-ДНК-Тех («НПФ ДНК - технология», Россия), позволяющие выявлять 13 специфичностей гена HLA - DRB1, 8 аллелей гена HLA - DQA1 и 11 аллелей гена HLA - DQB1. Детекцию продуктов амплификации проводили в ультрафиолетовом свете после электрофореза в 3 % - ном арагозном геле. Распределение аллельных частот и генотипов вычисляли из процентного соотношения числа индивидуумов, обладающих определенным аллелем или генотипом, к общему числу индивидуумов в выборке.
Для определения частоты аллелей исследованных генов и их гаплотипов методом максимального правдоподобия использовали компьютерную программу “Арлекин” версия 2.1 (URL:http:/antro.unige.ch/arlequin). Достоверность различий в частоте встречаемости аллелей и гаплотипов рассчитывали с помощью критерия 2 с поправкой Йетса на непрерывность выборки. В необходимых случаях, когда в группе сравнения было менее 5 наблюдений, использовали двусторонний критерий Фишера. Наличие ассоциаций заболевания с генотипом оценивали по величине относительного риска (RR) с расчетом для него 95 % доверительного интервала (ДИ) и проверкой на достоверность (р) отличия RR по точному двустороннему тесту Фишера для четырехпольных таблиц с поправкой на количество выявленных аллелей (pcor) по методу Бонферони (Животовский Л.А., 1991).
Клиническое обследование включало выявление жалоб пациентов на болезненность и отёчность дёсен, неприятный запах изо рта, кровоточивость дёсен, оголение шейки зуба, расшатывание и выпадение зубов. Оценку состояния тканей пародонта проводили, используя упрощенный гигиенический индекс УИГ - OHI-S (Green J.C., Vermilion J.R., 1960); индекс кровоточивости десневой борозды ИК - SBI (Mьhleman H.R., Son S., 1971); пародонтальный индекс ПИ - PI (Russel A.,1956). Глубину пародонтального кармана измеряли с помощью градуированного пуговчатого пародонтального зонда. Для уточнения клинического анализа всем больным назначали рентгенологическое исследование (Григорьян А. С. и др., 2004).
В исследовании были использованы следующие статистические методы и критерии: критерий хи-квадрат для проверки независимости признаков на основе таблицы сопряженности; метод главных компонент и факторный анализ для агрегирования исследуемых признаков; модель линейной регрессии для описания зависимости отклика Z от предикторов X, Y, … в виде линейной функции: Z = a + bX + cY + …; модель полиномиальной логистической регрессии с упорядоченным откликом для прогнозирования отклика, который принимает только целые значения, причем эти значения измеряются в порядковой шкале (Лагутин М. Б., 2007). Все расчеты проводили с помощью пакетов SPSS v15 for Windows и STATISTICA 7.0.
Результаты исследования и их обсуждение
Как следствие поставленных задач нами совместно с «НПФ ООО “Генлаб”» был разработан набор реагентов “Мультидент - 5” для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции.1 Предложенный набор включает комплект реагентов для пробоподготовки; комплект для амплификации, содержащий буфер, 5 прямые и 2 обратные праймеры, дезоксинуклеозидтрифосфаты, ДНК - полимеразу, положительный и отрицательный контрольные образцы, и комплект для анализа продуктов ПЦР. Принцип действия набора основан на выделении ДНК пародонтопатогенов с помощью комплекта I, амплификации фрагментов хромосомной ДНК (комплект II) и детекции продуктов ПЦР методом электрофореза в агарозном геле (комплект III). На этапе амплификации используют прямой олигонуклеотидный праймер (затравку), специфичный для фрагмента генома P. intermedia, прямой олигонуклеотидный праймер, специфичный для фрагмента генома B. forsythus, прямой олигонуклеотидный праймер, специфичный для фрагмента генома A. actinomycetemcomitans, прямой олигонуклеотидный праймер, специфичный для фрагмента генома P. gingivalis, общий для ДНК P. gingivalis, P. intermedia, A. actinomycetemcomitans и B. forsythus обратный олигонуклеотидный праймер, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие участок ДНК, специфичный для генома T. denticola. Положительный контрольный образец ДНК состоит из ДНК рекомбинантной плаз-
1 - решение о выдаче патента РФ на изобретение по заявке № 2005136997 от 21.01.2007.
миды с клонированным фрагментом размером 1000 п. н. генома P. intermedia sensu stricto, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 745 п. н. генома B. forsythus, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 512 п. н. генома T. denticola, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 360 п. н. генома A. actinomycetemcomitans, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 197 п. н. генома Porphyromonas gingivalis.
Чувствительность набора составляет не более 104 копий/мл для каждого возбудителя, что обеспечивает возможность выявления бактерий в количествах, характерных для участков с риском развития или прогрессирования пародонтита и снижение расхода реагентов для амплификации. Специфичность набора была доказана экспериментально и проверена на клинических образцах.
В результате последующих исследований было показано, что предложенный набор реактивов позволяет одновременно, быстро, просто и точно идентифицировать в одной пробе 5 видов пародонтопатогенов, в том числе трудно культивируемые, с помощью одноступенчатой мультиплексной ПЦР (рис. 1).
М 1 2 3 4 5 6 7 8 К+
Примечание: К+ - положительный контроль, М - маркеры молекулярного веса ДНК. 1 - 6, 8 - положительные пробы, 7 - отрицательная проба.
Рис. 1 Электрофореграмма продуктов ПЦР в 1,6 % агарозном геле.
При изучении состава пародонтопатогенной микрофлоры у больных ХГП с помощью набора реактивов “Мультидент - 5”, тест - системы Micro DentR (Hain Diagnostica) и классическим культуральным методом было показано, что частота встречаемости разных видов пародонтопатогенных бактерий у больных с генерализованной формой пародонтита существенно различалась. В ассоциациях доминировали представители видов - P. intermedia, P. gingivalis, B. forsythus, Fusobacterium nucleatum, A. actinomycetemcomitans, T. denticola, Actinomyces naeslundii, A. israelii, Streptococcus intermedius, Peptostreptococcus micros. При этом можно было выявить существование нескольких этиологически разнородных вариантов пародонтита, не имеющих различий в клинической картине. Мы также апробировали “Мультидент - 5” при изучении видового состава микробов в исследуемом материале, полученном у пациентов с различными воспалительными заболеваниями ротовой полости и челюстно - лицевой области.
Получив новое диагностическое средство мы изучили видовой состав основных пародонтопатогенов и их ассоциаций с клиническими параметрами у больных ХГП и лиц со здоровым пародонтом. Только в контрольной группе обследованных нами людей был отмечен оптимальный уровень гигиены. При этом у 5 (4 %) из 122 человек со здоровым пародонтом была выявлена ДНК A. actinomycetemcomitans, у 1 (0,8 %) человека - P. intermedia, 4 (3 %) - B. forsythus, 2 (1,6 %) - T. denticola. P. gingivalis в норме не выявляли (рис.2). У 209 (37 %) из 562 больных ХГП выявили A. actinomycetemcomitans (ОШ = 14; ДИ: 23; 70), у 326 (58 %) - P. gingivalis (ОШ = 168; ДИ: 12; 330), у 263 (47 %) - P. intermedia (ОШ = 106; ДИ: 15; 220), у 352 (63 %) - B. forsythus (ОШ = 49; ДИ: 18;76), T. denticola - у 289 (51 %) пациентов (ОШ = 63; ДИ: 16; 260). Частота выявления всех пяти изученных нами видов микробов возрастала в зависимости от степени тяжести пародонтита от 40 раз у пациентов 1-й группы до 70 раз у пациентов 3-й группы по сравнению с контролем, р = 0,0001. Таким образом, шанс появления любого из данных пародонтопатогенов у пациентов с легкой, средней или тяжелой степенями ХГП значительно выше шанса их определения у представителей контрольной группы.
Рис. 2. Относительная частота выявления ДНК пародонтопатогенов в области зубодесневой борозды у больных ХГП и людей со здоровым пародонтом.
Следует отметить, что частота определения каждого из пяти изучаемых нами видов микробов была значительно ниже у пациентов с ХГП легкой степени, чем у больных со средней и тяжелой степенью заболевания. Разница в частоте выявления каждого из них у пациентов со средней и тяжелой степенями ХГП была статистически не достоверна. Тем не менее, отношения шансов для 3-й и 1-й групп варьировали в пределах от 1,9 до 2,6 при р < 0,05.
Всех пациентов можно было разделить на 31 подгруппу по наличию у них пародонтопатогенов (от полного отсутствия до одновременного выявления всех 5 видов микробов), в которые входили от 3 (0,5 %) до 62 (11 %) человек. Только у 54 из 562 (9,6 %) обследованных нами пациентов с ХГП не было выявлено ни одного вида микробов, тогда как в контрольной группе - у 112 (92 %) человек (pcor = 0,00031). Таким образом, вероятность отсутствия у больных ХГП изучаемых нами пародонтопатогенов в 10 раз ниже, чем у здоровых людей. Очень редко у пациентов с ХГП выявляли один вид пародонтопатогенов. Только P. gingivalis определили у 35 (6 %) человек с пародонтитом, при этом разница с контрольной группой была статистически достоверной при р = 0,0047 (ОШ = 8,4; ДИ: 1,2; 25). У 62 (11 %) пациентов с ХГП были одновременно выявлены 4 вида микробов - P. intermedia, B. forsythus, T. denticola и P. gingivalis (pcor = 0,0031), у 61 (10,9 %) - все 5 видов пародонтопатогенов (pcor = 0,00031). У 8 (6,6 %) человек контрольной группы в области зубодесневой борозды был выявлен один вид микробов и только у 2 (1,4 %) человек - два вида пародонтопатогенов.
Разницы в частоте выявления пародонтопатогенов у мужчин и женщин с ХГП не обнаружено. У курящих пациентов все изучаемые нами виды пародонтопатогенов выявляли в 1,4 - 1,7 раза чаще, чем у некурящих, р = 0,001.
В результате изучения связи некоторых ассоциаций пародонтопатогенов с пародонтальными индексами было установлено, что присутствие в области зубодесневой борозды B. forsythus или ассоциаций бактерий T. denticola и B. forsythus; P. intermedia, B. forsythus и P. gingivalis; P. intermedia, B. forsythus, T. denticola и P. gingivalis или всех 5 видов бактерий статистически значимо связано с увеличением индекса ПМА на 3 - 7 %, глубины пародонтального кармана на 0,2 - 0,6 мм, пародонтального индекса - на 0,11 - 0,15 баллов, индекса кровоточивости (ИК) на 6 - 8 %, р = 0,001.
Одновременное присутствие в содержимом пародонтальных карманов P. intermedia, B. forsythus и P. gingivalis было связано с наибольшим увеличением средних значений пародонтального индекса у пациентов с ХГП с легкой, средней и тяжелой степенями заболевания. Наибольший прирост глубины пародонтальных карманов наблюдали у пациентов со средней степенью тяжести ХГП. Самое большое увеличение индекса ПМА было связано с наличием пяти видов пародонтопатогенов. Прирост средних значений был равен 8,4 %, р = 0,001. Увеличение индекса кровоточивости (ИК) на 6,3 % связано с появлением B. forsythus, р = 0,001.
Одним из наиболее важных признаков наличия у человека вторичного иммунодефицита является присутствие в организме ГВ.
С помощью иммуноферментного анализа было установлено, что у 533 (95 %) обследованных больных, страдающих пародонтитом, в сыворотке крови содержались антитела класса IgG к HSV 1 или 2 типа, в 483 (86 %) случаев - антитела IgG класса к CMV и только у 29 (5 %) пациентов - антитела IgМ класса к CMV. Немногим более, чем у половины больных ХГП были выявлены антитела к ядерному белку EBNA-1 p72, являющегося маркером пастинфекции, в относительно небольших количествах: 2,19 у.е./мл (от 0 до 7,06 у.е./мл), что в 4 раза выше, чем у представителей контрольной группы - 0,51 у.е./мл (от 0 до 2,3 у.е./мл), рm.-u. = 0,0013. Причем у женщин их уровень был почти в 2 раза статистически значимо выше, чем у мужчин, а также у пациентов со средней и тяжелой степенями тяжести заболевания по сравнению с контролем. Полученные результаты указывали на наличие латентной полиинфекции и возможность реактивации инфекционных агентов у иммунокомпроментированных пациентов, с которыми может быть связано прогрессирование пародонтита.
С помощью ПЦР ДНК HSV 1 типа была выявлена у 91 (16 %), HSV 2 типа - 23 (4 %), CMV - 40 (7,1 %), EBV - 101 (18 %) пациента. В тоже время у здоровых людей в области зубодесневой борозды был выявлен генетический материал только HSV 1 типа в 3 (2,6 %) случаев и СMV - у 2 (1,7 %) обследованных индивидуумов. ДНК HSV 2 типа и EBV не выявлена ни у одного человека (рис.3).
При этом значения отношения шансов были выше “4,5” для всех вирусов. Относительная частота выявления вирусов в пародонтальных карманах возрастала в зависимости от тяжести заболевания. Так, генетические маркеры HSV 1 типа были выявлены у 8 % пациентов с легкой, 15 % ? средней и 22 % ? тяжелой стадиями ХГП. Маркеры CMV выявили у 5 (6,5 %) пациентов 1-й группы, 14 (5,2 %) - 2-й и 21 (10,3 %) человека 3-й группы. Чаще всего в пародонтальных карманах выявляли EBV. Его определили у 10 (13 %) пациентов 1-й группы, 40 (14 %) ? 2-й и 51 (25 %) пациента ? 3-й группы. Однако у большинства (от 74 % пациентов 1-й до 52 % в 3-й группе) вирусы не были выявлены. Одновременно два типа вирусов выявили не более, чем у 10 % пациентов. При этом относительная частота одновременного присутствия двух типов вирусов у пациентов 3-й группы статистически достоверно превышала частоту как у пациентов 1-й группы (р = 0,017), так и пациентов 2-й группы (р = 0,009).
Рис. 3. Относительная частота выявления вирусов в пародонтальных карманах больных ХГП и людей со здоровым пародонтом.
Частота выявления EBV была в 1,8 раза выше у пациентов младшей возрастной группы, чем в старшей группе (pcor = 0,044; ОШ=2,9; ДИ: 1,6; 4,2); у мужчин в 1,5 раза чаще, чем у женщин (pcor = 0,02; ОШ=2,6; ДИ: 1,4; 3,8). У курящих пациентов все изучаемые нами типы вирусов были выявлены в 1,2 - 1,8 раза чаще, чем у некурящих пациентов, хотя статистически значимые отличия наблюдались только в частоте обнаружения EBV (р = 0,037). Отмечена тенденция увеличения вероятности нахождения HSV 1 типа в пародонтальных карманах курящих пациентов в 1,5 раза по сравнению с не курящими пациентами на уровне 5,6 %.
Мы также установили, что между частотой обнаружения в содержимом пародонтальных карманов пациентов с ХГП P. gingivalis и вирусов HSV 1 типа и HSV2 типа, а также A. actinomycetemcomitans и HSV 2 типа существует статистически значимая зависимость. У пациентов 3-й группы с тяжелой степенью заболевания была установлена статистически значимая связь между частотой обнаружения T. denticola и CMV, б = 0,047.
Присутствие любого из четырех изучаемых нами типов вирусов семейства Herpesviridae было статистически значимо связано с увеличением индекса ПMA, соответственно на 5,3 %, 8,5 %, 3,3 % и 3,6 %. Наличие HSV 1, HSV 2 и EBV, статистически значимо связано с увеличением глубины пародонтальных карманов на 0,6, 0,9 и 0,4 мм, CMV не влиял на этот показатель. Увеличение значений пародонтального индекса на 0,28 балла у людей с ХГП средней степени тяжести статистически значимо связано с присутствием в содержимом пародонтальных карманов HSV 2 типа, а у пациентов с ХГП тяжелой степени ? с любым из 4 типов изучаемых нами вирусов на 0,05 - 0,14 баллов. Присутствие вирусов HSV 1 и HSV 2 типов, но не СMV и EBV, в пародонтальных карманах пациентов с ХГП было статистически значимо связано с увеличением индекса кровоточивости (ИК), соответственно на 3,9 % и 8,4 %.
Kornman K.S. с соавторами (1997) описали специфический генотип кластера генов интерлейкина-1 (IL - 1), ассоциированный с тяжестью течения пародонтита. Полиморфизм гена IL - 1б локализован в позиции -899, гена IL - 1в - в позиции +3953. В обоих случаях аллель 1 содержит цитозин (С), тогда как аллель 2 - тимин (Т) в соответствующих позициях. Аллель 2 в позиции +3953 гена IL - 1в обусловливает изменение функций белков, что проявляется в избыточной продукции IL - 1в.
Мы изучили полиморфизм генов IL - 1б и IL - 1в у 95 человек европеоидной расы в возрасте от 18 до 65 лет, проживающих в г. Москве: 35 пациентов в возрасте до 35 лет с устойчивым не поддающимся лечению ХГП тяжелой степени (1-я группа), 40 больных ХГП тяжелой степени старше 50 лет (2-я группа) и 20 здоровых людей в возрасте от 41 до 64 лет без видимых заболеваний пародонта (контрольная группа). Все обследованные люди не имели системных заболеваний (ревматоидного артрита, миастении gravis, шизофрении), ассоциированных с полиморфизмом генов IL - 1б или IL - 1в. Все образцы, обладающие, по-крайней мере, одной копией аллеля 2 в обоих локусах считали GenoTypeR PRT - “положительными”. Гомозиготные аллели по обоим локусам или гетерозиготные, хотя бы по одному локусу аллеля 1 относили к “отрицательному” генотипу. Было установлено, что наблюдаемое распределение частот аллелей, как в локусе -899 гена IL - 1б (ч2 = 2,54, p > 0,05), так и гена IL - 1в +3953 (ч2 = 0,90, p > 0,05) в контрольной группе соответствовало теоретически ожидаемым частотам, рассчитанным по закону Харди - Вейнберга.
Тридцать семь человек (38,9 %) из всех обследованных людей были гомозиготными по аллелю 1 (1/1) в локусе -899 гена IL - 1б, 54 (56,8 %) человека являлись гетерозиготами (1/2) и 4 (4,2%) человека ? гомозиготами по мутантному аллелю 2 (2/2). Гомозиготами по аллелю 1 (1/1) гена IL - 1в +3953 были 43 (45,3 %) человека, по аллелю 2 (2/2) - 9 (9,4 %) человек, а гетерозиготами (1/2) - 43 (45,3 %) человека. Частоты аллельных вариантов локусов IL - 1б -899 и IL - 1в +3953 у больных пародонтитом и в контроле значительно различались. Так, среди пациентов 1 группы (моложе 35 лет) гомозиготные варианты аллеля 1 (1/1) в локусе -899 гена IL - 1б были выявлены у 5 (14 %) из 35 человек и ни у одного пациента в локусе +3953 гена IL - 1в. Во 2 - й группе больных (старше 50 лет) частота гомозиготных аллелей 1/1 была наибольшей, соответственно, 20 из 40 (50 %) в локусе -899 гена IL - 1б и 28 (70 %) из 40 - в локусе +3953 гена IL - 1в (табл. 1).
Максимальная частота - 30 (86 %) из 35 гетерозиготных вариантов аллелей 1/2 обоих генов была выявлена у пациентов 1-й группы. Гомозиготные аллели 2/2 в обоих локусах были определены у 4 (10 %) из 40 пациентов 2-й
Таблица 1 - Распределение аллельных частот локусов IL - 1б -899, IL - 1в +3953 у пациентов с пародонтитом и в контрольной группе, n (частота)
Группа |
IL - 1б -899 |
IL - 1в+3953 |
N |
|||||
1/1 |
1/2 |
2/2 |
1/1 |
1/2 |
2/2 |
|||
Контроль |
12* (0,60)** |
8(0,40) |
0(0,00) |
15 (0,75) |
5 (0,25) |
0 |
20 |
|
До 35 лет |
5(0,14) |
30(0,86) |
0(0,00) |
0(0,00) |
30 (0,86) |
5(0,14) |
35 |
|
Старше 50 лет |
20 (0,50) |
16(0,40) |
4(0,10) |
28 (0,70) |
8 (0,20) |
4(0,10) |
40 |
|
Всего |
37 (0,389) |
54(0,568) |
4(0, 453) |
43(0,453) |
43(0,179) |
9(0,095) |
95 |
группы и у 5 (14 %) пациентов 1-й группы в локусе +3953 гена IL - 1в. большинство людей в контрольной группе (45 %) обладали генотипом 1/1 по обоим изученным локусам генов IL - 1.
Генотипом c одним мутантным аллелем в локусе IL - 1б -899 (1/2, 1/1) обладали 6 (30 %) людей контрольной группы. Еще 3 (15 %) людей имели генотип (1/1, 1/2) с мутантным аллелем в локусе IL - 1в +3953. Генотипом 1/2, 1/2 по обоим изученным локусам генов IL - 1 обладали всего 2 (10 %) человека из группы людей со здоровым пародонтом. Ни один человек этой группы не обладал генотипом с сочетанием мутантных аллелей в гомозиготном состоянии. Частота комбинированного генотипа 1/2, 1/2 у пациентов 1-й группы была значительно выше ? 25/35 (71 %), чем в контрольной группе людей со здоровым пародонтом - 2/20 (10 %), p = 0,0001. Она также была статистически достоверно выше по сравнению с частотой “положительного” генотипа 1/2, 1/2 ? 8/40 (20 %) у пациентов 2-й группы, p = 0,0001. Частота генотипа 1/2, 1/2 у пациентов 2-й группы отличалась незначительно от показателей контрольной группы, p = 0,540. Кроме этого генотип 1/2, 2/2 выявлен еще у 5 (14 %) пациентов 1-й группы, а генотип 2/2, 2/2 - у 4 (10 %) пациентов 2-й группы.
У пациентов с “положительным” генотипом IL - 1 наблюдалось увеличение частоты 29 (69 %) выявления в содержимом пародонтальных карманов P. intermedia в 1,5 раза по сравнению с частотой 15 (45 %) у пациентов с “отрицательным” генотипом (рТКФ = 0,034). Частота идентификации T. denticola у пациентов с “положительным” генотипом IL - 1 ? 24 (58 %) также была в 1,5 раза выше, чем у пациентов с “отрицательным” генотипом ? 13 (39 %), рТКФ = 0,047. Статистически значимые различия были также выявлены и для P. gingivalis: 33 (79 %) и 14 (42 %), соответственно (рТКФ = 0,001). С “положительным” генотипом IL - 1 было также связано повышенное содержание вирусов семейства Herpesviridae в пародонтальных карманах больных ХГП. Так частота выявления HSV 1 типа у 13 (31 %) пациентов с “положительным” генотипом была в 2,6 раза выше, чем у 4 (12 %) больных с “отрицательным” генотипом (рТКФ = 0,019), а EBV в 4,7 раза, соответственно у 12 (29 %) и 2 (6 %) пациентов, рТКФ = 0,006. Связь генотипа IL - 1 с курением не выявлена (рТКФ = 0,437).
Итак, в обследованной нами группе людей частота генотипов 1/2, 1/2, 1/2, 2/2 и 2/2, 2/2 локусов IL - 1б -899 и IL - 1в +3953 составила 46,3 %, что соответствует показателям, характерным для жителей Северной Европы. Мы считаем, что пациенты с данным генотипом относятся к группе риска заболевания тяжелыми формами пародонтита в более молодом возрасте по сравнению с лицами, имеющими “отрицательный” генотип.
У 171 человека: 48 пациентов в возрасте до 35 лет с устойчивым не поддающимся лечению ХГП тяжелой степени (1-я группа), 69 больных ХГП тяжелой степени старше 38 лет (2-я группа) и 54 здоровых человека в возрасте от 20 до 64 лет без видимых заболеваний пародонта (контрольная группа) проведено исследование аллельного полиморфизма генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1). Наиболее частыми специфичностями гена DRB1 у представителей контрольной группы были специфичности *01 (28,7 %), *15 (12,9 %), *11 (12,0 %), *03 (8,3 %); аллели локуса DQA1*0101 (30,6 %), *0501 (25,9 %), *0102 (17,6 %) и *0301 (9,3 %); DQB1 *0501 и *0602-8 (каждый 21,3 %), *0301 (20,4 %), *0201 (10,2 %). У больных пародонтитом чаще всего выявляли специфичности *04 (17,9 %), *15 (15,8 %), *07 (12,4 %), *11 (11,5 %), *13 (7,7 %) и *01 (8,9 %); аллели локуса DQA1*0301 (21,8 %), *0102 (20,1 %), *0501 (18,4 %) и *0101 (11,1 %); DQB1*0301 (20,9 %), *0602-8 (17,9 %), *0201 (14,9 %) и *0302 (12,4 %).
Установлено, что у больных пародонтитом наблюдалось снижение частоты специфичности DRB1 *01 и аллеля DQA1 *0101 (pc < 0,05), как в целом, так и в группах с различным течением заболевания. По-видимому, эти специфичности можно отнести к “протективным”. У больных ХГП старше 38 лет (2-я группа) наблюдалось увеличение частоты специфичности DRB1 *04 и аллеля DQA1 *0301 (pcor < 0,05). Выявлены положительные ассоциации данной формы пародонтита с этими показателями (RR > 2). За счет высокой частоты встречаемости специфичности DRB1 *04 и аллеля DQA1 *0301 у пациентов 2-й группы наблюдалась тенденция к увеличению их частоты в целом у обследованных больных пародонтитом.
Нами также были выявлены некоторые различия в системе HLA у пациентов с различными формами пародонтита в зависимости от пола индивидуума. Причем у женщин, страдающих пародонтитом, но не у мужчин, различия были более значимыми.
Анализ распределения частот трехлокусных гаплотипов показал большую вариабельность, чем отдельных генов HLA. При этом было показано, что характер распределения трехлокусных гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 у обследованных нами представителей населения г. Москвы, в целом, соответствует таковому для представителей европеоидной расы. Выявлено 26 наиболее часто встречающихся сочетаний гаплотипов у представителей контрольной группы, составляющих 84 % из всех определенных у них гаплотипов, 23 варианта - у пациентов 1-й (73 %) и 22 - у пациентов 2-й группы (93 %). У пациентов, резистентных к пародонтиту, с наибольшей частотой (17,6 %) определяли гаплотип DRB1*01- DQA1*0101 - DQB1*0501. Отмечена тенденция к снижению его встречаемости до 6,3 % у пациентов 1-й группы (р = 0,024) и 8,7 % - у пациентов 2-й группы (р = 0,052). Наиболее сильные отклонения были показаны для гаплотипа DRB1*04 - DQA1*0301 - DQB1*0302, частота встречаемости которого у пациентов 2-й группы была больше в 5,4 раза, чем в контрольной группе (рсor = 0,052) и 3,2 раза, чем в 1-й группе (р = 0,009, рсor = 0,52).
Кроме этого нами были выявлены различия в распределении частот специфичностей локуса HLA - DRB1 у пациентов с ХГП при наличии (1-я группа) или отсутствии (2-я группа) в пародонтальных карманах генетических маркеров герпесвирусов.
Относительная частота выявления “протективной” специфичности DRB1* 01 у пациентов 2-й группы (11 %) была меньше, чем у здоровых людей (29 %) более, чем в два раза, а у пациентов 1-й группы (4,3 %) - в 6,7 раза (р = 0,0001, pcor = 0,0013). Положительные ассоциации специфичности DRB1* 04 с клиническими проявлениями пародонтита были выявлены только у пациентов 1-й группы. Так, частота выявления этой специфичности у людей со здоровым пародонтом составляла 7 %, у пациентов, не инфицированных ГВ ? 12 %, а у пациентов с идентифицированными вирусами - 31 % (pcor = 0,012). Разница частот выявления других специфичностей локуса DRB1 у пациентов обследованных групп была статистически не достоверной.
Увеличение частоты аллеля DQA1 *0301 у пациентов с ХГП было обусловлено в большей степени с частотой его определения у пациентов 1-й группы (31,4 %), чем у пациентов 2-й группы (17,7 %), по сравнению со здоровыми людьми (11 %). Разница частот выявления аллеля DQA1 *0301 у пациентов обследованных групп была статистически достоверной (р = 0,03, RR = 2,13, ДИ: 1,12; 3,6). Ни у одного пациента 1-й группы не был выявлен аллель DQA1 *0401, в тоже время у пациентов 2-й группы его выявили с частотой 5,5 %, р = 0,08. Статистически достоверные различия в частоте аллелей локуса HLA - DQB1 у пациентов разных групп не были выявлены, хотя и была установлена тенденция увеличения частоты аллеля DQB1 *0302 у пациентов 1-й группы (22,8 %) по сравнению с пациентами 2-й группы (9,7 %), р = 0,017, pcor = 0,204. Частота аллеля DQB1 *0501 у пациентов 1-й группы составила 5,7 %, у представителей контрольной группы - 21,3 %, а у пациентов 2-й группы - 17 %, то есть была, соответственно ниже в 3,7 раза (р = 0,019, pcor = 0,220) и 3 раза (р = 0,03, pcor = 0,36).
Таким образом, из полученных нами результатов следует, что специфичность HLA-DRB1 *04 и аллель DQA1 *0301 могут являться “маркерами риска” ХГП, ассоциированного с вирусами семейства Herpesviridae, а “протективными” свойствами, обладают специфичность HLA-DRB1 *01, аллель локуса DQA1 *0501 и DQB1 *0501. В связи с этим, можно предположить, что выявленные ассоциации специфичности DRB1*04 с ХГП, возможно, связаны с доклиническими проявлениями аутоиммунных процессов, индуцированных вирусами.
Чтобы обосновать критерии определения микробиологических и иммуногенетических индикаторов риска генерализованного пародонтита, необходимых для оптимизации диагностики и прогнозирования характера течения воспалительных заболеваний пародонта, мы провели исследования с помощью методов статистического моделирования. С этой целью мы выделили предикторы - переменные, на основе которых можно было бы предсказывать интересующие нас признаки, в частности, глубину пародонтального кармана (ПК) или степень тяжести пародонтита. В первоначальный список предикторов включили 20 микробиологических и иммуногенетических показателей, имеющих наиболее высокие значения при пародонтите (оценены с помощью критерия хи - квадрат и ОШ), возможно, влияющих на изменение глубины ПК и клинический диагноз. Для этих признаков была вычислена корреляционная матрица, из которой следовало, что многие из предикоторов значимо коррелировали между собой, особенно бактерии с бактериями и генетические показатели с генетическими. Так, были выявлены корреляционные связи каждого вида пародонтопатогенов с десятью - двенадцатью, а P. gingivalis - со всеми показателями. С вирусами коррелировали пять - семь показателей, с иммуногенетическими признаками - восемь - пятнадцать показателей. Чтобы избежать неустойчивости результатов мы агрегировали предикторы с помощью метода главных компонент и факторного анализа, которые позволяют большое число переменных свести к меньшему количеству независимых влияющих величин, называемых факторами. При этом в один фактор объединяются переменные, сильно коррелирующие между собой. Переменные из разных факторов слабо коррелируют между собой.
Подобные документы
Методы диагностики туберкулеза легких. Роль метода полимеразно-цепной реакции в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания. Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видов микобактерий из культурального материала.
дипломная работа [532,6 K], добавлен 28.05.2013Осуществление рутинных методик полимеразно-цепной реакции (ПЦР). ПЦР диагностика туберкулеза легких. Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видов микобактерий из культурального материала. ПЦР диагностика внелегочных форм туберкулеза.
курсовая работа [1,2 M], добавлен 20.05.2013Изучение влияния 15% водного раствора димефосфона на клиническое течение хронического генерализованного пародонтита при различных вариантах комплексной терапии. Анализ результатов лечения у лиц пожилого возраста с воспалительными заболеваниями пародонта.
статья [18,2 K], добавлен 01.09.2013Роль метода полимеразно-цепной реакции в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания. Молекулярно-генетическое исследование для определения устойчивости комплекса Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам.
дипломная работа [1,3 M], добавлен 13.06.2013Сущность, значение и области применения молекулярно-генетических методов исследования. Специфика метода полимеразной цепной реакции. Блот-гибридизация по Саузерну. Картирование генов и идентификация хромосомных аберраций с помощью "FISH"-метода.
презентация [971,4 K], добавлен 07.12.2014Причинные факторы воспалительных заболеваний пародонта, их разделение на первичные и вторичные. Концепция патогенеза пародонтита. Развитие поражения пародонта из клинически здоровой десны в течение 2-4 дней после аккумуляции бляшки. Основные виды защиты.
презентация [251,7 K], добавлен 22.07.2015Разновидности гингивитов, признаки пародонтита. Виды физиотерапевтического лечения. Основы бальнеотерапии при воспалительных заболеваниях тканей пародонта. Парафинотерапия, лечение грязями. Светолечение, лазерная, аэрозольная терапия при пародонтозе.
презентация [2,7 M], добавлен 02.07.2014Строение и функции пародонта. Факторы риска возникновения и развития его заболеваний, их симптомы, методы, средства профилактики. Регистрация состояния тканей пародонта с помощью пародонтальных индексов. Клиника пародонтоза - поражения околозубных тканей.
реферат [468,2 K], добавлен 22.12.2013Анализ показаний к применению стимулирующей терапии: снижение показателей реактивности, отсутствие эффектов от лечения. Характеристика методов общего лечения заболеваний пародонта у детей. Знакомство с физиотерапевтическими методами лечения пародонта.
презентация [370,3 K], добавлен 16.05.2014Описание анатомического строения и функций тканей пародонта. Этиология и патогенез пародонтита, особенности его классификации при воспалении и дистрофии. Характеристика современных терапевтических методов и средств местной терапии при лечении пародонтита.
реферат [1,5 M], добавлен 27.06.2011