Гепатопротекторные и иммунометаболические эффекты, вызываемые этанолом в сочетании с энергизаторами и антиоксидантами при различных формах нарушения гомеостаза

СЭВМ и МЭССЭ, в отличие от МАЭ, индуцируют выделение иммуномодулирующих факторов не только прилипающими, но и не прилипающими к стеклу спленоцитами. Некоторые из выделяемых прилипающими клетками цитокины усиливают выделение гепатоцитами белков острой фазы (С.А. Кетлинский и др., 1992).

К их числу относятся б-1-антипротеазы (ААП) и б-2-макроглобулины (АМГ), обладающие выраженными иммуносупрессорными свойствами (Л.Г. Прокопенко и др., 1994). В связи с изложенным, возникло предположение, что среди цитокинов, выделяемых не прилипающими к стеклу клетками селезенки животных, получавших инъекции МЭССЭ, есть не только соединения, стимулирующие развитие иммунного ответа, но и факторы, участвующие в сохранении иммунного гомеостаза. Для проверки этого предположения проведены эксперименты на крысах Вистар, получавших инъекции МЭССЭ. Исследовали супернатанты прилипающих и неприлипающих клеток селезенки этих животных. Определяли иммуномодулирующую активность полученных супернатантов и исследовали их иммунорегулирующее действие. С этой целью супернатанты прилипающих и неприлипающих спленоцитов, содержащие иммуностимулирующие факторы вводили интактным животным, полученные сыворотки использовали для обработки нативных эритроцитов интактных аллогенных крыс (Л.Г. Прокопенко, Ю.О. Яхонтов, 1976). После обработки эритроцитов сывороткой их инкубировали с менадионом. В части опытов сыворотку, используемую для обработки эритроцитов, предварительно истощали кроличьими сыворотками, содержащими антитела к ААП и АМГ (антиААП и антиАМГ). Использовали антиААП с титром антител 1:64 и антиАМГ с титром 1:128. Инъекции СПС приводили к повышению концентрации ААП и АМГ в крови аллогенных интактных крыс, а инъекции СНС не влияли на содержание в крови этих белков.

Принимая во внимание тот факт, что ААП и АМГ обладают иммуносупрессирующими свойствами, изучали иммуномодулирующую активность сыворотки крыс, получавших инъекции СПС и СНС (СКСПС и СКСНС). Сыворотки вводили внутрибрюшинно 5-кратно с 12-часовым интервалом по 0,2 мл. Одновременно с первой инъекцией сыворотки животных иммунизировали ЭБ. Установлено, что СКСНС при аллогенном переносе не оказывала влияния на развитие иммунного ответа, а СКСПС обладала иммуносупрессирующими свойствами.

Большой интерес представляет вопрос об иммуномодулирующих свойствах цитокинов, выделяемых неприлипающими клетками селезенки. Выше было показано, что СНС крыс, получавших МЭССЭ, не влияют на содержание ААП и АМГ, в сыворотке крови интактных животных, а СКСНС не обладают иммуносупрессирующими свойствами. В связи с этим, возникло предположение, что в составе СНС крыс, получавших инъекции МЭССЭ, есть соединения, влияющие на накопление в крови ААП и АМГ индуцируемые СПС. Для проверки этого предположения интактным крысам одновременно вводили СПС и СНС крыс, получавших инъекции МЭССЭ, и иммунизировали их ЭБ. Оказалось, что в сыворотке крови таких животных активность ААП и АМГ не отличалась от контроля. Сыворотки крови крыс, получавших инъекции СПС и СНС, не влияли на развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ, у аллогенных реципиентов и не индуцировали появление у эритроцитов резистентности к менадиону.

Обработка эритроцитов интактных крыс СКСНС или СКСПС не приводила к появлению у них иммуномодулирующих свойств. После обработки менадионом эритроциты, предварительно инкубированные с СКСНС, приобретали иммуностимулирующие свойства. У эритроцитов, инкубированных с СКСПС, менадион не индуцировал появления иммуностимулирующих свойств.

Это свидетельствует о наличии в СКСПС фактора, повышающего резистентность эритроцитов к действию менадиона. Инкубация эритроцитов с равной по белку смесью СПС и СНС увеличивала резистентность к действию менадиона. На основании полученных данных, можно заключить, что в составе СНС есть соединения, блокирующие выделение в сосудистое русло веществ, индуцирующих выделение субстанций, обладающих иммуносупрессорными свойствами и повышающих резистентность эритроцитов к действию менадиона. Вместе с тем, СНС, по-видимому, не содержит соединений, блокирующих действие факторов СПС на уровне мембраны эритроцитов.

В связи с тем, что введение животным СКСПС приводит к повышению концентрации в крови ААП и АМГ, возникло предположение, что появление у эритроцитов резистентности к менадиону обусловлено связыванием с их мембраной антипротеолитических белков СКСПС. Истощение СКСПС антиААП не влияло на ее свойство индуцировать появление у эритроцитов резистентности к действию менадиона. Вместе с тем, СКСПС теряла это свойство после истощения антиАМГ.

Проведенные эксперименты показывают, что резистентность эритроцитов к действию менадиона обусловлена связыванием с их мембраной АМГ. Повышение концентрации этого белка под влиянием цитокинов, выделение которых индуцируется МЭССЭ, снижает чувствительность к действию менадиона и таким путем ограничивает выраженность иммуномодулирующего эффекта, вызываемого этим препаратом. Вместе с тем, факторы, выделяемые под влиянием МЭССЭ неприлипающими клетками селезенки, ингибируют выделение антипротеаз в сосудистое русло. иммунометаболический фосфолипид витамин кровопотеря

Вероятно, с выделением указанных факторов неприлипающими к стеклу клетками селезенки, наблюдающемся при введении СЭВМ и МЭССЭ, и отсутствие этого эффекта при инъекциях МАЭ является причиной выпадения супрессорной фазы и большей продолжительности иммуностимулирующего эффекта, вызываемого СЭВМ и МЭССЭ. На основании этих данных, можно считать, что эритроциты, цитокины, выделяемые различными популяциями спленоцитов, и клетки, секретирующие АМГ, образуют функциональную систему, обеспечивающую сохранение иммунного гомеостаза при введении в организм нафтохинонов.

Эритротромбоцитарный механизм развития иммуносупрессии при интенсивных физических нагрузках и алкогольной интоксикации.

Изучено влияние липопротеидов и тромбоцитов на иммуносупрессирующие свойства эритроцитов, после выполнения интенсивной физической нагрузки и возможность коррекции этого влияния с помощью эссенциале и милдроната.

В ходе проведенных исследований установлено, что после инкубации с суммарной фракцией липопротеидов низкой и очень низкой плотности (ФЛП) интактных или плававших крыс, а также с тромбоцитами интактных крыс, эритроциты интактных животных не приобретали иммуносупрессирующих свойств. В отличие от этого эритроциты интактных крыс, инкубированные с тромбоцитами плававших животных, обладали иммуномодулирующей активностью. Это можно расценить как возможность индуцирования иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов без участия ФЛП, или как способность последних индуцировать появление у тромбоцитов свойства вызывать появление супрессирующей активности у эритроцитов. Для выяснения этого вопроса поставлено два варианта экспериментов. В первом эритроциты интактных крыс обрабатывали ФЛП плававших животных, и после осаждения центрифугированием их инкубировали с тромбоцитами интактных крыс, во втором эритроциты интактных крыс инкубировали с тромбоцитами интактных животных, предварительно инкубированных с ФЛП плававших крыс. В первом варианте экспериментов эритроциты не приобрели иммуносупрессирующей активности, во втором они становились способными вызывать при аллогенном переносе супрессирующий эффект. Результаты этих наблюдений позволяют считать, что феномен тромбоэритроцитарной иммуносупрессии возникает вследствие появления у тромбоцитов под влиянием ФЛП свойства индуцировать появление иммуносупрессирующей активности у эритроцитов. Вероятно, это свойство ФЛП обусловлено изменением их жирнокислотного состава (табл. 9).

Таблица 9 Влияние ФЛП и тромбоцитов плававших крыс на активность эритроцитов интактных крыс

Эритроциты интактных крыс, получавших эссенциале, после инкубации с тромбоцитами плававших крыс не приобретали иммуносупрессирующей активности. Инкубация эритроцитов интактных крыс, которым вводили милдронат, с тромбоцитами плававших крыс индуцировала появление у эритроцитов иммуносупрессирующих свойств. Такой же эффект наблюдался при инкубации эритроцитов интактных крыс с тромбоцитами плававших крыс, получавших эссенциале. В отличие от этого эритроциты интактных крыс, инкубированные с тромбоцитами плававших крыс, получавших милдронат, оставались иммунологически неактивными (табл. 10).

Таблица 10 Влияние эссенциале и милдроната на феномен тромбоэритроцитарной иммуносупрессии

Обобщение приведенных данных позволяет прийти к заключению о том, что ФЛП играют роль ключевого звена в развитии тромбоэритроцитарного механизма иммуносупрессии при интенсивных физических нагрузках. Эти соединения (вероятно, после окислительной модификации) приводят к возникновению у тромбоцитов свойства индуцировать появление у легких эритроцитов иммуносупрессирующей активности. На основе полученных данных можно сделать вывод, что отмена тромбоэритроцитарной супрессии может быть достигнута вызванным эссенциале повышением резистентности эритроцитов к действию модифицированных ФЛП и тромбоцитов или разобщением взаимодействия ФЛП и тромбоцитов под влиянием милдроната.

Ранее было показано, что появление иммунологической активности у эритроцитов коррелируют с активностью в их строме Mg2+ - АТФазы, обеспечивающей перенос в эритроциты ионов Mg2+, активирующих практически все ферменты гликолиза (А. Ленинджер, 1985) . Учитывая это, изучено влияние тромбоцитов, выделенных из крови плававших крыс, на активность Mg2+ - АТФазы стромы эритроцитов интактных животных.

Установлено, что инкубация тромбоцитов плававших крыс с цельными эритроцитами интактных животных или с их стромой (соотношение тромбоцитов и эритроцитов или стромальных частиц - 10:1) существенно снижает активность Mg2+ - АТФазы в стромальных частицах (активность Mg2+ - АТФазы в строме равнялась 0,63 ± 0,08, активность фермента после инкубации стромы с тромбоцитами - 0,42 ± 0,06 мкмоль фосфата на 1 г белка в час). В связи с изложенным возник вопрос о влиянии тромбоцитов на функциональную активность лейкоцитов периферической крови. С целью его выяснения тромбоциты плававших крыс инкубировали с лейкоцитами сенсибилизированными антисывороткой к ЭБ, а также несенсибилизированными ПЯЛ или лимфоцитами интактных животных. Оказалось, что тромбоциты не влияли на активность НАДФН - оксидазы ПЯЛ (до инкубации 1,31 ± 0,19, после инкубации 1,27 ± 0,16 п моль/(мин 103 клеток)) и содержание ФДФ в лимфоцитах (до инкубации 0,92 ± 0,18, после инкубации 0,86 ± 0,17 п моль/106 клеток). Вместе с тем тромбоциты снижали выраженность феномена АЗКЦ (до инкубации 11,6 ± 1,3%, после инкубации 7,2 ± 0,8%).

В ходе дальнейших исследований изучено влияние эссенциале и регуляторов энергетического обмена на вышеуказанные иммунометаболические параметры. Установлено, что введение плававшим крысам эссенциале с рибоксином отменяло способность тромбоцитов снижать активность Mg2+ - АТФазы стромы эритроцитов интактных животных, но не влияло на вызываемое ими снижение выраженности феномена АЗКЦ. После инъекции, плававшим животным, эссенциале с мексидолом или милдронатом тромбоциты сохранили способность снижать Mg2+ - АТФазы стромы эритроцитов и теряли свойство снижать выраженность феномена АЗКЦ.

Результаты проведенных экспериментов показали, что тромбоциты участвуют в возникновении иммуносупрессорного эффекта, взаимодействуя с эритроцитами и некоторыми популяциями лейкоцитов. Характер взаимодействия эритроцитов и лейкоцитов не одинаков, так как оно избирательно корригируется сочетанием эссенциале с другими препаратами. Вероятно, в реализации этого взаимодействия участвуют генерируемые тромбоцитами активные метаболиты кислорода, стабильные и радикальные формы окислов азота, а также продукты перекисного окисления липидов.

В ходе дальнейших исследований изучали механизм развития эритротромбоцитарной иммуносупрессии при длительном поступлении этанола и возможность её коррекции эссенциале и регуляторами энергетического обмена. Выраженная имуносупрессирующая активность характерна для окислительно-модифицированных липопротеинов низкой плотности. Они индуцируются активированными формами кислорода, генерация которых резко усиливается при токсических поражениях печени, вызываемых ксенобиотиками и этанолом (В.В. Зинчук, М.Н. Ходосовский, 2006). Одним из наиболее часто возникающих окислителей является стабильный оксид азота (NO) и его радикал (NO?), генерируемые в больших количествах клетками печени и крови (И.П. Серая, Я.Р. Нарциссов, 2006). Учитывая это, можно было предположить, что NO является одним из метаболитов, вызывающих окислительную модификацию липопротеинов. Проведенные для проверки этого предположения эксперименты показали, что нейтрофилы алкоголизированных крыс, инкубированные в полной среде (30 мин., 37°С), выделяют большее количество оксида азота (N0), чем нейтрофилы интактных животных (содержание NО в среде соответственно равнялось 0,45 и 1,15 нмоль/5х106 клеток). Клетки осаждали центрифугированием, к надосадочной жидкости добавляли ФЛП интактных крыс и инкубировали 1 час. После инкубации в среде увеличивалось содержание МДА на 7-12% по сравнению с исходным уровнем в той же пробе. Это позволяет считать, что под влиянием NO среды происходит окислительная модификация ЛНП и ЛОНП.

После инкубации тромбоцитов интактных крыс с ФЛП алкоголизированных животных определяли в них содержание МДА. До инкубации оно равнялось 0,54, после инкубации 1,63 нмоль/108 тромбоцитов. Таким образом, под влиянием ФЛП произошла окислительная модификация тромбоцитов (ОМТ).

Эритроциты интактных животных инкубировали с окислительно-модифицированными тромбоцитами. После инкубации и отделения тромбоцитов в эритроцитах обнаруживалось увеличение содержания продуктов ПОЛ и снижение концентрации БФГ. Такие эритроциты при аллогенном переносе супрессировали развитие иммунного ответа у интактных крыс (в норме АОК - 26,4±2,1 тыс/селезенка после инкубации с тромбоцитами - 12,6±1,0 тыс/селезенка). Инкубация ОМТ с нейтрофилами интактных животных ингибировала их ФМА (в норме ИАФ = 64,2±5,8, ОРН = 17,8±1,5; после инкубации с тромбоцитам ИАФ=47,5±3,9; ОРН=9,4±1,0). ОМТ in vitro не влияли на величину метаболических маркеров активации лимфоцитов (содержание в них фруктозо-2,6-дифосфата и концентрация лактата после инкубации с тромбоцитами оставались таким же как до нее).

Эффекты вызываемые действием тромбоцитов на функциональную активность клеток опосредуются многими факторами, не исключено, что одним из которых является индукция образования вторичных мессенджеров в том числе простагландинов и Са2+. Учитывая это, исследовано влияние ингибитора циклооксигеназы, диклофенака, блокатора Са2+-каналов L-тина, изоптина, на вызываемое тромбоцитами алкоголизированных животных появление иммуносупрессирующей активности у эритроцитов и снижение ФМА нейтрофилов. Установлено, что внесение в среду инкубации тромбоцитов и эритроцитов диклофенака или изоптина не влияло на появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов. Вероятно появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов не зависит от изменения содержания простагландинов и Са2+ в эритроцитах. Добавление в среду инкубации тромбоцитов и нейтрофилов диклофенака увеличивало ФМА последних, а внесение изоптина не влияло на показатели защитной функцией этих клеток.

Таким образом, угнетающее влияние тромбоцитов алкоголизированных крыс на ФМА нейтрофилов in vitro зависит от активности циклооксигеназы. Это предполагает непосредственное участие простагландинов, способных ингибировать функциональную активность нейтрофилов через увеличение в них цАМФ. Вместе с тем угнетающее влияние тромбоцитов не зависит от состояния Са2+-каналов, блокируемых изоптином. Это может рассматриваться как низкая чувствительность поглотительной и окислительной функции нейтрофилов к изменению содержания Ca2+ или как проникновение в клетку Ca2+ или как проникновение в клетку Сa2+ через каналы не блокируемые изоптином.

Введение алкоголизированным крысам эссенциале предотвращало появление у тромбоцитов свойства оказывать влияние на метаболизм и функцию эритроцитов и нейтрофилов интактных крыс. Рибоксин и милдронат такого эффекта не вызывали. Инъекции интактным животным рибоксина предотвращали снижение содержания БФГ и увеличение концентрации МДА в эритроцитах, а также появление иммуносупрессирующих свойств у этих клеток после инкубации их с тромбоцитами алкоголизированных крыс. Эссенциале не снижал чувствительность эритроцитов и нейтрофилов интактных крыс к действию тромбоцитов алкоголизированных животных. При введении интактным крысам милдроната нейтрофилы приобретали резистентность, эритроциты сохраняли чувствительность к действию тромбоцитов алкоголизированных животных.

Однонаправленность действия милдроната, рибоксина и эссенциале при введении в организм алкоголизированных животных и в культуральную среду, содержащую тромбоциты крыс получавших этанол позволяет считать, что тромбоциты во взаимодействии с эритроцитами играют важную роль в развитии иммуносупрессии при длительном поступлении в организм этанола и в реализации иммуномодулирующего действия изученных препаратов.

Иммунометаболические эффекты, вызываемые кратковременным поступлением этанола. Изучено влияние кратковременно поступающих в организм малых доз этанола на иммунометаболические параметры организма и о роли эритроцитов в реализации этого влияния.

Эксперименты проведены на крысах Вистар, которым вводили внутрижелудочно через зонд этанол в дозе 0,3 г/100 г массы тела 7- кратно с интервалом 24 часа.

Установлено, что после 7-кратного введения этанола наблюдалась выраженная стимуляция развития ГИО на ЭБ. Количество АОК в селезенке контрольных крыс после иммунизации ЭБ равнялась 24,5±2,6 тыс., а в селезенке животных, получавших этанол 51,4±5,3 тыс. Выраженность ГИО на ЛПС после введения этанола не отличалось от контроля (соответственно 18,5±2,0 тыс. и 17,4±1,9 тыс.).

Семикратное введение малых доз этанола не оказывало существенного влияния на содержание триацилглицеролов, холестерина и общего билирубина, активность щелочной фосфатазы, повышало активность аланин- и аспартатаминотрансфераз в сыворотке крови, увеличивала активность супероксиддисмутазы и каталазы, не влияла на концентрацию диеновых коньюгатов и малонового диальдегида в клетках печени. В эритроцитах увеличивалось содержание 2,3 - бисфосфоглицерата и аденозинтрифосфата, повышалась активность супероксиддисмутазы и каталазы, не изменялось содержание ацилгидроперекисей и малонового диальдегида (табл. 11).

Таблица 11. Влияние малых доз этанола на метаболические параметры

Приведенные данные показывают, что метаболические изменения после приема малых доз этанола направлены в основном на сохранение антиоксидантного статуса и энергетического потенциала клеток. Повышение аспартат- и аланинаминотрансфераз, преимущественно последней (коэффициент де-Ритиса до поступления этанола - 0,78, после поступления - 0,45), вероятно следует рассматривать не как следствие повреждения цитоплазматических мембран гепатоцитов, а как усиление анаболической направленности обменных процессов (И.М. Рослый и др., 2004).

Можно предположить, что предварительное поступление малых доз этанола будет индуцировать возникновение иммунометаболических сдвигов, противодействующих последующему деструктивному влиянию на организм больших доз этого препарата (явление гомеостаза).

Однократное введение большой дозы этанола снижало показатели ФМА нейтрофилов и иммунологической реактивности в отношении ЭБ и ЛПС, повышало активность АЛТ и АСТ в крови, снижало активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах и гепатоцитах, увеличивало содержание продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах и печени. Предварительное кратковременное введение малых доз этанола ослабляло иммуносупрессорное действие и ограничивало снижение антиоксидантных ферментов в эритроцитах и печени (табл. 11).

Полученные данные свидетельствуют о важной роли антиокислительного состояния клеток в реакции иммуномодулирующего действия низких доз этанола.

Повышение иммунологической активности, наблюдающееся после действия некоторых стрессиндуцирующих агентов (умеренно высокой внешней температуры, физической нагрузки низкой интенсивности, дозированной кровопотери), а так же после введения некоторых лекарственных средств (протео- и гликолитических ферментов, жирорастворимых витаминов) обусловлено появлением в крови эритроцитов, обладающих иммуностимулирующими свойствами (Л.Г. Прокопенко, И.Л. Бровкина, 2003). В связи с этим возникло предположение, что такие эритроциты могут накапливаться в крови и при поступлении в организм низких доз этанола. Установлено, что после 7-дневного введения 0,3 г/100 г массы тела этанола в сосудистом русле животных появляются эритроциты, стимулирующие у аллогенных реципиентов развитие ГИО на ЭБ и не влияющие на иммунный ответ индуцированный ЛПС. Иммуномодулирующими свойствами обладали тяжелые эритроциты, легкие клетки такого эффекта не вызывали.

Результаты проведенных исследований показывают, что при кратковременном поступлении в организм небольших доз этанола в сосудистом русле появляются эритроциты, оказывающие влияние на иммунологическую реактивность организма. Тяжелые эритроциты животных, кратковременно получавших этанол, стимулируют развитие Т-зависимого иммунного ответа, но не влияют на интенсивность Т-независимого ответа. Это свидетельствует о том, что иммуностимулирующее действие эритроцитов реализуется при участии иммунорегуляторных популяций макрофагов и Т-лимфоцитов.

Регуляторный эффект этих клеток опосредуется выделяемыми ими гуморальными факторами. Учитывая это, исследовано влияние тяжелых эритроцитов крыс, кратковременно получавших этанол, на выделение прилипающими и не прилипающими к стеклу клетками селезенки интактных крыс факторов, модулирующих развитие иммунного ответа.

Установлено, что супернатанты прилипающих и не прилипающих спленоцитов крыс, получавших инъекции эритроцитов интактных крыс не обладали иммуномодулирующей активностью, не вызывал иммуномодулирующего эффекта так же супернатант неприлипающих клеток селезенки крыс, получавших этанол. Вместе с тем супернатант прилипающих к стеклу спленоцитов крыс, получавших инъекции эритроцитов кратковременно алкоголизированных крыс стимулировал у неалкоголизированных аллогенных реципиентов развития Т-зависимого иммунного ответа, но не влияли на выраженность Т-независимого иммунного ответа.

Фракционирование супернатантов прилипающих клеток на сефадексе G-150 позволила выделить три белковые фракции. Установлено, что фракция III повышала иммунологическую реактивность реципиентов в отношении ЭБ, но не влияла на реактивность в отношении ЛПС.

Результаты проведенного исследования показывают, что иммуномодулирующее действие кратковременного поступления в организм этанола опосредовано различными соединениями, выделяющимися прилипающими к стеклу клетками селезенки, после активации их модифицированными тяжелыми эритроцитами алкоголизированных крыс.

Иммуномодулирующие эффекты полиненасыщенных фосфолипидов и жирорастворимых витаминов опосредуются эритроцитами, поэтому интересно было выяснить влияние малых доз этанола на иммуномодулирующее действие этих соединений.

Установлено, что введение эссенциале или менадиона не оказывало влияния на развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Введение этанола с указанными выше препаратами приводило к значительно более выраженному усилению иммунного ответа, чем при введении только этанола.

Однократное поступление в организм этанола, а также введение эссенциале, менадиона, ретинола ацетата или токоферола ацетата не приводило к появлению в крови животных эритроцитов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Поступление этанола, сочетающееся с введением эссенциале, менадиона или ретинола ацетата индуцировало появление иммуностимулирующих свойств у эритроцитов. Введение этанола и токоферола ацетата не сопровождалось возникновением иммуномодулирующих свойств у эритроцитов.

Результаты экспериментов позволяют считать, что этанол или метаболиты, накапливающиеся в крови после введения этанола, не индуцируя появление иммуномодулирующих свойств у эритроцитов, повышают чувствительность эритроцитов к действию фосфолипидов, витаминов К и А.

Эритроцитзависимые иммунометаболические эффекты, вызываемые кратковременным поступлением этанола в сочетании с жирорастворимыми витаминами и эссенциале при кровопотере и физической нагрузке. Изучено влияние эритроцитов интактных крыс, экстракорпорально обработанных этанолом, на развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ у животных, получавших инъекции препаратов фосфолипидов и жирорастворимых витаминов.

Обработка эритроцитов раствором этанола различных концентраций показала, что при инкубации с 0,5% раствором этанола эритроциты не приобретали иммуномодулирующих свойств. Обработка 1 и 5% этанолом индуцировало появление иммуностимулирующих свойств.

Инъекции крысам эритроцитов экстракорпорально обработанных этанолом (ЭЭОЭ), или одного из вышеуказанных лекарственных препаратов не влияли на выраженность иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Введение ЭЭОЭ животным, получавшим эссенциале, менадион или ретинола ацетат, стимулировало у них развитие иммунного ответа. Введение ЭЭОЭ крысам, получавшим токоферол ацетат, не усиливало их реакции на ЭБ.

Результаты этих экспериментов свидетельствуют о возможности усиления иммуномодулирующего эффекта эссенциале, менадиона и ретинола ацетата путем введения животным ЭЭОЭ.

Принимая во внимание наиболее высокую иммуномодулирующую эффективность сочетаний менадиона с этанолом и менадиона с ЭЭОЭ в норме, было изучено влияние этих сочетаний при кровопотере и физической нагрузке.

Оказалось, что введение после кровопотери или плавания этанола с менадионом усиливало (но не нормализовало) развитие ГИО и ГЗТ. Вместе с тем инъекции менадиона с ЭЭОЭ нормализовало развитие обеих форм иммунного ответа.

Таким образом, инъекции ЭЭОЭ потенцируют иммуномодулирующее действие менадиона в большей степени, чем введение свободного этанола.

Состояние иммунологической реактивности в условиях стресса и патологии в значительной степени определяется функциональной активностью клеток крови - лимфоцитов, нейтрофилов и эритроцитов, активирующих иммунные процессы, а также тромбоцитов, вызывающих иммуносупрессирующий эффект (Л.Г. Прокопенко, И.Л. Бровкина, 2003).

После кровопотери или физической нагрузки содержание ФДФ2 в лимфоцитах, активности НАДФН - оксидазы в нейтрофилах и Mg2+- АТФазы мембраны эритроцитов значительно снижались, а содержание МДА в тромбоцитах увеличивалось.

Введение после кровопотери и физической нагрузки менадиона с этанолом уменьшало выраженность изменения этих параметров, а инъекции менадиона с ЭЭОЭ нормализовало их величины (табл. 12).

Изучено влияние менадиона, этанола и ЭЭОЭ на метаболические параметры гепатоцитов и эритроцитов после кровопотери и физической нагрузки. Установлено, что раздельное введение менадиона, этанола или ЭЭОЭ не влияло на показатели антиоксидантного потенциала и интенсивности ПОЛ гепатоцитов и эритроцитов. Совместное введение менадиона с этанолом уменьшало выраженность, вызванных кровопотерей снижения активности СОД и каталазы, повышения содержания ДК, АГП и МДА в гепатоцитах и эритроцитах. Инъекции менадиона с ЭЭОЭ нормализовали показатели антиоксидантной защиты и интенсивности ПОЛ гепатоцитов и эритроцитов.

Таблица 12 Влияние менадиона, этанола и ЭЭОЭ на метаболические маркеры функциональной активности клеток крови.

После физической нагрузки нормализация метаболических параметров гепатоцитов и эритроцитов наблюдалась как при инъекции менадиона с ЭЭОЭ, так и в случае введения менадиона со свободным этанолом.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что при состояниях, характеризующихся нарушением энергетического гомеостаза, угнетение иммунологической реактивности сочетается с нарушением функциональной активности гепатоцитов, нейтрофилов, эритроцитов и тромбоцитов. В основе этого лежит усиление генерации активных метаболитов кислорода, индуцирующих перекисное окисление липидов, нарушение структуры двойного фосфолипидного слоя клеточных мембран и их функций. Из гепатоцитов в кровь поступают окислительно-модифицированные липопротеины и продукты перекисного окисления липидов. Они модифицируют мембрану легких эритроцитов, вследствие чего эти клетки приобретают свойство индуцировать выделение прилипающими к стеклу спленоцитами иммуносупрессирующих цитокинов (Л.Г. Прокопенко и др., 1995).

Тяжелые эритроциты, модифицированные этанолом ускоряют секрецию цитокинов, стимулирующих развитие различных форм иммунного ответа, а так же соединений, обладающих антиоксидантной активностью (М.В. Павлова, 2007). Не исключено, что эти цитокины усиливают эффекты, вызываемые менадионом и другими соединениями, взаимодействующими со структурными компонентами мембраны эритроцитов (фосфолипидами, глико- и протеолитическими ферментами).

Для проверки этого предположения спленоциты здоровых крыс, получавших инъекции ЭЭОЭ, фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре. Супернатанты фракционировали на сефадексе G-150, полученные фракции вводили крысам внутрибрюшинно, подвергнутыми кровопотере или выполнявшим интенсивную физическую нагрузку одновременно с внутримышечными инъекциями менадиона, ретинола ацетата или токоферола ацетата. Через 6 ч после введения супернатантов и препаратов жирорастворимых витаминов определяли активность НАДФН - оксидазы в нейтрофилах, содержание ФДФ в лимфоцитах. Кроме того устанавливали активность СОД и каталазы, содержание ДК и МДА в гепатоцитах.

Оказалось, что высокомолекулярная фракция I (ММ>150 кД) супернатанта спленоцитов прилипающих к стеклу при 32-37єС усиливала влияние витаминов на активность СОД и каталазы, содержание ДК и МДА в гепатоцитах. В отличие от этого низкомолекулярная фракция III (ММ<15 кД) супернатанта потенциировала вызываемое менадионом и ретинола ацетатом увеличение содержания ФДФ в лимфоцитах и активность НАДФН - оксидазы в нейтрофилах (рис. 3).

Таким образом, различные по молекулярной массе соединения супернатанта спленоцитов неодинаково влияют на метаболические изменения, вызываемые витаминами в гепатоцитах и клетках периферической крови.

Эргопротекторное действие этанола. После 7-кратного введения этанола (0,3 г/100г массы тела с интервалом 24 ч) физическая работоспособность, тестируемая по максимальной продолжительности плавания с грузом 8% массы тела значительно возросла. До введения этанола максимальная продолжительность плавания крыс с грузом 8% массы тела равнялась 7,6±1,3 мин, а после введения этанола 15,2±2,4 мин. Этанол увеличивал также продолжительность плавания с грузом 30% массы тела (в контроль 1,8±0,3 мин, после введения этанола 3,7±0,5 мин).

Семикратное введение малых доз этанола увеличивало активность супероксиддисмутазы и каталазы, не влияло на концентрацию диеновых коньюгатов и малонового диальдегида в клетках мышц.

Можно предположить, что предварительное поступление малых доз этанола будет индуцировать возникновение эргопротекторного эффекта, противодействующего последующему деструктивному влиянию на организм больших доз этого препарата (явление гомеостаза).

Подтверждение этому служат эксперименты в которых продолжительность плавания крыс с грузом 30% (ФНСИ) после однократного введения большой дозы этанола (3 мг/100 г массы тела) была существенно ниже чем у контрольных (не получавших этанол) животных (в контроле 1,8±0,3 мин, после приема этанола 0,8±0,1 мин), а у крыс, однократно получивших 3 мг/100 г этанола после 7- кратного введения малых доз этого соединения (0,3 мг/100 г) способность выполнять ФНСИ не отличалось от контроля (1,7±0,3 мин).

Однократное введение большой дозы этанола снижало активность супероксиддисмутазы и каталазы в мышцах, увеличивало содержание продуктов перекисного окисления липидов в миоцитах. Предварительное кратковременное введение малых доз этанола ослабляло иммуносупрессорное действие и ограничивало снижение антиоксидантных ферментов мышцах. Полученные данные свидетельствуют о важной роли антиокислительного состояния клеток в реакции эргопротекторного действия низких доз этанола.

Рисунок 3. Влияние фракций прилипающих к стеклу при 32-37?С спленоцитов крыс, получавших инъекции ЭЭОЭ на метаболические параметры лейкоцитов (ФДФ2 и НАДФН-окс.) и гепатоцитов (СОД, КАТ, ДК и МДА) плававших крыс, получавших инъекции менадиона.

1 - контроль; 2 - плавание; 3 - плавание, введение фракции I и менадиона; 4 - плавание, введение фракции III и менадиона.

В ходе дальнейших исследований установлено, что введение интактным крысам тяжелых эритроцитов, полученных от аллогенных животных после 7-кратного введения этанола, повышало их способность выполнять физическую работу субмаксимальной и высокой интенсивности.

Проведенные исследования показали, что при кратковременном поступлении в организм небольших доз этанола в сосудистом русле появляются тяжелые эритроциты, оказывающие влияние на физическую работоспособность организма. Регуляторный эффект этих клеток опосредуется выделяемыми ими гуморальными факторами. Учитывая это, исследовано влияние тяжелых эритроцитов крыс, кратковременно получавших этанол, на выделение прилипающими и не прилипающими к стеклу клетками селезенки интактных крыс факторов, модулирующих физическую работоспособность.

Установлено, что введение животным супернатантов, обладающих иммуностимулирующей активностью, повышали способность неалкоголизированных крыс выполнять физические нагрузки субмаксимальной интенсивности и не влияли на возможность выполнения нагрузок высокой интенсивности. После фракционирования супернатантов прилипающих клеток на сефадексе G-150 оказалось,что при аллогенном переносе фракции I увеличивалась продолжительность плавания крыс с грузом 30% массы тела (рис. 4).

Результаты проведенного исследования показывают, что эргопротекторное действие кратковременного поступления в организм этанола опосредовано различными соединениями, выделяющимися прилипающими к стеклу клетками селезенки, после активации их модифицированными тяжелыми эритроцитами алкоголизированных крыс.

Рисунок 4. Влияние фракций супернатантов прилипающих к стеклу спленоцитов крыс, получавших инъекции тяжелых эритроцитов алкоголизированных крыс, на физическую работоспособность аллогенных животных, не получавших этанол.

Рисунок А: Продолжительность плавания с грузом 30%

Рисунок Б: Продолжительность плавания с грузом 8%

По оси абсцисс: продолжительность плавания в мин. По оси ординат: К-контроль (без фракции супернатантов) I, II и III - введение фракций I, II и III соответственно.

ВЫВОДЫ

1. Полиненасыщенные фосфолипиды, активаторы энергетического обмена и жирорастворимые витамины, введенные по отдельности, не оказывают существенного влияния на функционально-метаболическую активность нейтрофилов, развитие гуморального и клеточного иммунного ответа и метаболические процессы в печени после кровопотери, интенсивной физической нагрузки и длительного поступления в организм этанола.

2. Полиненасыщенные фосфолипиды в сочетании с активаторами энергетического обмена после кровопотери вызывают иммуномодулирующий и гепатопротекторный эффекты. Иммуномодулирующее действие наиболее выражено при совместном введении фосфолипидов и кудесана, гепатопротекторное действие при сочетании фосфолипидов с мексидолом.

3. Полиненасыщенные фосфолипиды в сочетании с активаторами энергетического обмена эффективно коррегируют функционально- метаболическую активность нейтрофилов и иммунологическую реактивность животных после выполнения физической нагрузки высокой интенсивности.

4. Физическая нагрузка высокой интенсивности индуцирует выделение в сосудистое русло окислительно модифицированных липопротеинов низкой и очень низкой плотности под влиянием которых, тромбоциты приобретают свойство вызывать появление у легких эритроцитов иммуносупрессирующих свойств. Фосфолипиды введенные с милдронатом подавляют развитие тромбоэритроцитарной иммуносупрессии.

5. Фосфолипиды в сочетании с активаторами энергетического обмена коррегируют иммунометаболические процессы, нарушенные длительным поступлением в организм этанола. Высокоэффективным является совместное введение фосфолипидов с милдронатом, а также фосфолипидов с менадионом фиксированном эритроцитами.

6. Иммуномодулирующей активностью обладает менадион адсорбированный на эритроцитах (МАЭ) здоровых крыс, строма эритроцитов, включившая менадион (СЭВМ), менадион и эссенциале соиммобилизованные стромой эритроцитов (МЭССЭ). Наиболее выраженный и длительно сохраняющийся иммуномодулирующий эффект у здоровых и алкоголизированных животных вызывает МЭССЭ.

7. Менадион и эссенциале соиммобилизованные стромой эритроцитов индуцируют выделение прилипающими (при 32є-37єС) и неприлипающими к стеклу спленоцитами алкоголизированных животных соединений, обладающих свойством усиливать развитие клеточного и гуморального иммунного ответа. Прилипающие (при 4-10єС) клетки алкоголизированных крыс выделяют альфа-2-макроглобулин, супрессирующий развитие обеих форм иммунного ответа и отменяющий свойство эритроцитов приобретать иммуномодулирующую активность под влиянием МЭССЭ.

8. Этанол, кратковременно введенный в малых дозах стимулирует у здоровых животных развитие Т-зависимого иммунного ответа, уменьшал или нормализовал показатели антиоксидантного потенциала и интенсивности перекисного окисления эритроцитов и гепатоцитов алкоголизированных животных.

9. Кратковременное введение здоровым животным малых доз этанола с менадионом или ретинола ацетатом вызывало более выраженный иммуномодулирующий эффект, чем поступление каждого из этих соединений в отдельности. Инъекции менадиона или ретинола ацетата с эритроцитами экстракорпорально обработанными этанолом (ЭЭОЭ) стимулировали развитие гуморального и клеточного иммунного ответа в большей степени, чем введение препаратов витаминов со свободным этанолом.

10. Эритроциты экстракорпорально обработанные этанолом (ЭЭОЭ) стимулировали развитие различных форм иммунного ответа после острой кровопотери или выполнения физической нагрузки высокой интенсивности ЭЭОЭ уменьшали выраженность вызываемого кровопотерей и физической нагрузкой снижения антиоксидантного потенциала и повышения интенсивности перекисного окисления в гепатоцитах и эритроцитах.

11. Этанол и менадион при раздельном введении не влияли на показатели антиоксидантного потенциала и интенсивности перекисного окисления липидов гепатоцитов и эритроцитов. Совместное введение этанола с менадионом уменьшало выраженность вызванных кровопотерей и плаванием изменений антиоксидантного потенциала и перекисного окисления липидов. Инъекции менадиона с ЭЭОЭ нормализовали эти параметры гепатоцитов и эритроцитов.

12. Высокомолекулярная (>150 кД) фракция соединений выделяемых спленоцитами, прилипающими к стеклу при 32є -37єС, усиливала влияние витаминов на активность антиоксидантных ферментов и продуктов перекисного окисления в гепатоцитах и эритроцитах. В отличие от этого низкомолекулярная (<15 кД) фракция соединений, секретируемых этими клетками потенциировала вызываемое менадионом и ретинола ацетатом увеличение активности лимфоцитов и нейтрофилов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Принимая во внимание наличие иммунотропного, антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов у регуляторов энергетического обмена, целесообразно дальнейшее изучение фармакологических эффектов других представителей этой группы при кровопотере, интенсивной физической нагрузке, алкогольной интоксикации.

Следует рекомендовать проведение клинической апробации иммуномодулирующей и гепатопротекторной эффективности сочетанного применения полиненасыщенных фосфолипидов с кудесаном и полиненасыщенных фосфолипидов с мексидолом соответственно, для фармакологической коррекции функций эритроцитов, иммуноцитов, гепатоцитов при острой кровопотере.

Экспериментально обоснована целесообразность кратковременного использования малых доз этанола в сочетании с менадионом или ретинола ацетатом для коррекции иммунометаболических нарушений.

Учитывая синергичность действия полиненасыщенных фосфолипидов, жирорастворимых витаминов, регуляторов энергетического обмена в отношении их иммунометаболических эффектов при кровопотере, интенсивной физической нагрузке, алкогольной интоксикации, целесообразно дальнейшее исследование различных комбинаций этих групп лекарственных веществ при других нарушениях энергетического гомеостаза.

Целесообразно рекомендовать дальнейшее изучение иммунометаболических эффектов лекарственных соединений, корригирующих тромбоэритроцитарные взаимодействия при различных формах нарушения окислительно-энергетического гомеостаза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лосенок, С.А. Иммуномодулирующее действие активаторов энергетического обмена при физических нагрузках различной интенсивности / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвященной 120-летию ветеринарной службы Курской области. - Курск, 2005. - С. 70-76.

2. Лосенок, С.А. Коррекция иммунометаболических нарушений у спортсменов / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, М.И. Лукашов // Материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвященной 120-летию ветеринарной службы Курской области. - Курск, 2005. - С. 82-85.

3. Лосенок, С.А. Взаимосвязь иммуномодулирующего действия регуляторов энергетического обмена, гликозаминогликанов и фосфолипидов / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Материалы Междунар. конгр. «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (3-8 окт., Москва). - М., 2005. - С. 148.

4. Лосенок, С.А. Актопротекторное и иммуномодулирующее действие феноболила при нарушении гомеостаза / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Университетская наука: взгляд в будущее: сб. тр. 71-й науч. конф. КГМУ и сессии Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2006. - Т. 2. - С. 244-245.

5. Лосенок, С.А. Коррекция иммунометаболических нарушений при синдроме перетренированности у спортсменов / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Материалы VI Всерос. науч. форума «РеаСпоМед 2006». - Москва, 2006. - С. 77-78.

6. Лосенок, С.А. Коррекция тромбоэритроцитарной иммуносупрессии стабилизаторами клеточных мембран при интенсивных физических нагрузках / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Вестн. Уральской мед. академической науки. - 2006. - № 3 (1). - С. 307 - 309.

7. Коррекция иммунометаболических нарушений, вызываемых длительным поступлением в организм этанола, регуляторами энергетического обмена и эссенциале / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Н.А. и др. // Вестн. новых мед. технологий. - 2007. - Т. XIV. - № 3. - С. 202 - 205.

8. Лосенок, С.А. Изменение иммунометаболических параметров при алкогольной интоксикации / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2007. - № 1. - С. 5 - 10.

9. Лосенок, С.А. О взаимосвязи иммуномодулирующих и актопротекторных эффектов, вызываемых этанолом / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2007. - № 1. - С. 11 - 18.

10. Иммунометаболические эффекты, вызываемые милдронатом, рибоксином и эссенциале при длительном поступлении в организм этанола / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, М.В. Павлова и др. // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2007. - № 2. - С. 18 - 25.

11. Лосенок, С.А. Антиоксидантный и иммуномодулирующий эффекты регуляторов энергетического обмена и полиненасыщенных фосфолипидов при физических нагрузках высокой интенсивности / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Вестн. новых мед. технологий. - 2007. - Т. XIV. - № 4. - С. 188 - 190.

12. Эритроцитзависимые эффекты лекарственных и физиотерапевтических средств / С.А. Лосенок, А.И. Лазарев, И.Л. Бровкина и др. - Курск, 2008. - 336 с.

13. Лосенок, С.А. Иммунометаболические эффекты фосфолипидов и активаторов окислительной цепи при кровопотере / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Вестн. новых мед. технологий. - 2008. - Т. XV, № 1. - С. 211-213.

14. Лосенок, С.А. Тромбоэритроцитарная иммуносупрессия и ее коррекция стабилизаторами клеточных мембран при интенсивной физической нагрузке / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 2008. - № 1. - С. 20 - 22.

15. Иммунометаболические нарушения при синдроме перетренированности спортсменов и их коррекция / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко, Д.С. Наседкин // Воен.- мед. журн. - 2008. - Т. 329, № 2. - С. 70.

16. Лосенок, С.А. Влияние алкогольной интоксикации на иммунометаболические параметры организма / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Воен.- мед. журн. - 2008. - Т. 329, № 3.- С. 90-91.

17. Лосенок, С.А. Иммуномодулирующий и актопротекторный эффекты феноболила при нарушении энергетического гомеостаза / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, П.И. Лосенок // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 1. - С. 151-152.

18. Лосенок, С.А. О взаимосвязи иммуномодулирующего и антиоксидантного эффектов регуляторов энергетического обмена, полиненасыщенных фосфолипидов и гликозаминогликанов / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, П.И. Лосенок // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 1. - С. 151.

19. Лосенок, С.А. Иммунометаболические эффекты сочетанного применения эссенциале и витаминов при кровопотере / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Системный анализ и управление в биомед. системах. - 2008. - Т. 7, № 3. - С.658-661.

20. Лосенок, С.А. Эритроцитзависимые иммунометаболические эффекты этанола, полиненасыщенных фосфолипидов и жирорастворимых витаминов в норме и при острой кровопотере / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Вестн. новых мед. технологий. - 2008. - Т. XV, № 3. - С. 221 - 222.