Роль полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена Р53 в патогенезе онкологических заболеваний

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

РОЛЬ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ И ГЕНА Р53 В ПАТОГЕНЕЗЕ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14.00.16 - патологическая физиология

ДМИТРИЕВА Алла Ивановна

Томск - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Новицкий заслуженный деятель науки РФВячеслав Викторович

доктор медицинских наук Севостьянова Наталия Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Агафонов профессорВладимир Иванович

доктор медицинских наук, Степовая профессорЕлена Алексеевна

доктор медицинских наук, Кондакова профессорИрина Викторовна

Ведущая организация: ГУ Российский онкологический центр имени Н.Н. Блохина РАМН

Защита состоится на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Е.Н. Амосова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия отмечается большой рост и «омоложение» онкологических заболеваний. Существенными причинами увеличения числа злокачественных новообразований являются, с одной стороны, ухудшение социально-экономических условий, снижение жизненного уровня населения, распространение табакокурения, алкоголизма, загрязнение окружающей среды, с другой - недостаточный уровень профилактических мероприятий в сфере онкологии, и в том числе пропаганды среди населения знаний по профилактике злокачественных новообразований, а также по соблюдению здорового образа жизни, недостатки в организации и качестве медицинской помощи больным.

Онкогенез, как и любой морфогенетический процесс, является результатом действия многих генов так называемой генной сети, в которой онкогенам и генам-супрессорам отводится главная роль, а другим генам, в том числе генам биотрансформации ксенобиотиков - роль модификаторов функций главных генов (Kinzler K.W., Vogelstein B., 1997; Баранов В.С. и соавт., 2000; Колчанов Н.А. и соавт., 2000; Пальцев М.А., 2004,Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н., 2007; Имянитов Е.Н., Хансон К.П., 2007, Давыдов М.И., 2008).

Ген р53 играет центральную роль в поддержании стабильности генома и предотвращении удвоения поврежденной ДНК, при этом белок р53 либо временно блокирует процесс деления клетки для репарации ДНК или запускает апоптоз (программированную клеточную гибель), если эти повреждения невозможно устранить. р53 является фактором активации ряда генов, которые участвуют в ингибиции клеточного цикла, активации апоптоза и угнетении ангиогенеза опухоли. Важно подчеркнуть, что р53-зависимый апоптоз элиминирует из организма не только поврежденные клетки, но и клетки, в которых наблюдается нерегулируемая стимуляция пролиферации, вызываемая, например, онкогеном. Тот факт, что 50% опухолей содержит мутантный р53 в соматических клетках опухоли, подтверждает важную роль р53 в онкогенезе.

К изменению функциональной активности белков-онкосупрессоров в определенных условиях могут предрасполагать генетические полиморфизмы (Тюляндин С.А., 2000; Имянитов Е.Н., 2007; Бочков Н.П., 2008).

В качестве генов-модификаторв главных генов нередко могут выступать и гены «внешней среды», ответственные за метаболизм и инактивацию ксенобиотиков, в том числе табачного дыма, различных промышленных, сельскохозяйственных ядов и пр. (Wolf C.R., 1994; Foppa I., Spiegelman D., 1997; Le Marchand L. et al., 1998; Saarikoski S.T. et al., 1998; Garcia-Closas M., Lubin J.H., 1999; Spitz M.R. et al., 2000; He J.-Q. et al., 2002; Perera F.P. et al., 2002; Пальцев М.А., 2004, Бочков Н.П., 2006; Копнин Б.П., 2006; Имянитов Е.Н., Хансон К.П., 2007).

Индивидуальная чувствительность к канцерогенным воздействиям определяется двумя основными явлениями: многостадийным характером процесса канцерогенеза и генетическим полиморфизмом факторов, играющих ведущую роль на каждом его этапе. Генетический полиморфизм, вовлеченный в метаболизм канцерогенов, исследуется в качестве возможного фактора риска возникновения различных онкологических заболеваний (Alexandrie A.-K. et al., 1994; Баранов В.С., 2004; Пальцев М.А., 2004, Имянитов Е.Н., Хансон К.П., 2007; Давыдов М.И., 2008). Поступающие в организм чужеродные вещества (химические агенты, лекарственные средства, вирусы и др.) подвергаются метаболизму с участием ферментативной системы биотрансформации жирорастворимых эндогенных и экзогенных соединений в полярные водорастворимые производные. Как известно, процесс биотрансформации включает в себя две последовательные стадии. Ферменты первой фазы связывают ксенобиотики с образованием мутагенных промежуточных метаболитов (таких, как супероксид-анион-радикал и ароматические углеводороды), которые под действием ферментов второй фазы превращаются в нетоксичные для клетки водорастворимые продукты, легко выводимые из организма. Генетически запрограммированная система биотрансформации, деградации и выведения ксенобиотиков делает каждого индивидуума уникальным в отношении его адаптационных способностей, т.е. устойчивости или чувствительности к повреждающим внешним факторам.

У человека наиболее активно в метаболизме канцерогенов участвуют несколько изоформ цитохрома Р-450. К ним в первую очередь относятся изоформы CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2Е1 и CYP3A4. Так, для одной из изоформ цитохрома Р-450 - CYP1А1, метаболизирующей канцерогенные углеводороды, была показана корреляция между наличием мутации Val > Ile в 462 кодоне 7 экзона (в двух аллелях) и увеличением риска возникновения рака легкого в 9 раз при курении сигарет даже в умеренном количестве, вторым условием проявления данной корреляции было отсутствие активности фермента второй фазы детоксикации ксенобиотиков GSTM1 - глутатион-S-трансферазы М1 [Hayashi S. et al., 1992; Alexandrie A.K. et al., 1994; Bartsch H., Hietanen E., 1996; Garcia-Closas M. et al., 1997; Пальцев М.А., 2004, Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н., 2007; Имянитов Е.Н., Хансон К.П., 2007]. Кроме того, наличие мутации в данном гене ассоциировано с повышенным риском развития рака молочной железы, рака простаты, колоректального рака и рака почки. Для полиморфного гена CYP1В1 показана роль в развитии рака мочевого пузыря, опухолей мозга, рака почки, простаты, яичников, матки.

Делеционные формы генов глутатионтрансфераз GSTT1 и GSTM1, приводящие к отсутствию функции соответствующих ферментов, рассматриваются в качестве факторов риска возникновения рака легкого, рака молочной железы, пищевода, рака шейки матки, мочевого пузыря, неполипозного рака кишки.

В настоящее время обсуждается роль патологического аллеля гена GSTP1 в развитии рака легкого, мочевого пузыря, простаты. У индивидуумов с наследственно ослабленным генотипом инактивация ксенобиотиков, в том числе промышленных, сельскохозяйственных ядов и лекарственных средств, должна происходить особенно медленно и, соответственно, условия неблагоприятного действия вредных метаболитов на организм особенно реальны.

Представленные материалы свидетельствуют о принципиальной возможности использования молекулярно-генетических тестов для лабораторного скрининга злокачественных опухолей человека как метода формирования групп повышенного онкологического риска. Вероятно, полиморфизмы генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков могут быть использованы в качестве дополнительных маркеров при ранней диагностике рака. Окончательная оценка практической ценности генетических маркеров рака требует продолжения научных исследований в данном направлении.

Все сказанное определяет актуальность изучения полиморфизма генов ферментов биотрансформации и оценки их взаимосвязи, а также гена белка-онкосупрессора р53 с риском развития опухоли и особенностями клинико-морфологического проявления злокачественных новообразований различной локализации.

Цель исследования: установить роль полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, их комбинаций и гена р53 в патогенезе онкологических заболеваний.

Задачи исследования:

1. Оценить распределение вариантных генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1) и гена р53 у больных злокачественными новообразованиями различных локализаций (рак легкого, рак желудка, рак толстой кишки, рак предстательной железы).

2. Установить связь функционально неполноценных генотипов исследуемых генов с риском развития онкологических заболеваний и клинико-морфологическими особенностями опухолей.

3. Оценить распределение вариантных генотипов ферментов биотрансформации ксенобиотиков среди больных с распространенным злокачественным процессом.

4. Провести сравнительный анализ комбинаций вариантных генотипов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у всех обследованных больных и выявить специфичные сочетания, предрасполагающие к развитию рака легкого, рака предстательной железы, рака желудка, рака толстой кишки.

5. Определить способы инактивации генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 в опухолевых клетках легкого и установить роль гиперметилирования промотора гена GSTP1 в развитии злокачественной трансформации клеток легкого.

6. Выявить особенности распределения вариантных генотипов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1 и р53 у больных раком легкого в зависимости от причастности к курению.

Научная новизна: В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование роли генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена р53 в патогенезе онкологических заболеваний различных локализаций и выявлена связь неблагоприятных сочетаний генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1 с риском развития опухоли определенной локализации и ее клинико-морфологическими особенностями. Также впервые проанализированы механизмы участия полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, их комбинаций и гена белка-онкосупрессора р53 в развитии злокачественных новообразований.

Получены новые данные сравнительного анализа по участию глутатион-S-трансфераз в патогенезе рака легкого, желудка, толстой кишки и предстательной железы.

Обосновано, что баланс активации/инактивации канцерогенов складывается из соотношения активностей реакций I и II фаз биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1) и может влиять на степень риска развития рака. Частота функционально неполноценных генотипов цитохрома Р-4501А1, глутатион-S-трансфераз Т1, М1, Р1 и Про-аллеля гена р53 у обследованных по итогам проведенного исследования онкологических больных превышает таковую у здоровых лиц. Впервые выявлена взаимосвязь носительства патологических вариантов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1 и гена р53 с наличием очагов метастазирования у больных раком легкого и раком желудка, со стадией злокачественного процесса у больных раком предстательной железы.

Получены новые данные, касающиеся профиля поражения генов глутатион-S-трансфераз в опухолях легкого, учитывающие все возможные способы инактивации генов данного семейства. Выявлена роль гиперметилирования промотора гена GSTP1 и его сочетаний с полиморфными вариантами генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 в патогенезе рака легкого.

Установлено значительное увеличение частоты функционально неполноценных генотипов исследованных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у курящих больных раком легкого по сравнению с некурящими пациентами.

Впервые обосновано, что суммарное влияние функционально неполноценных вариантов генов цитохрома Р-450 и глутатион-S-трансфераз Т1, М1, Р1 превышает эффект индивидуальных вариантных генотипов, что увеличивает риск развития злокачественных новообразований. В результате сравнительного анализа выявлены комбинации генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, предрасполагающие к развитию рака легкого, рака предстательной железы, рака желудка и рака толстой кишки, а также определены протекторные комбинации в отношении злокачественных новообразований

Теоретическая и практическая значимость. Полученные по итогам проведенного исследования данные фундаментального характера, касающиеся полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: цитохрома Р-4501А1 и глутатион-S-трансфераз Т1, М1, Р1 и их комбинаций при опухолях легких, предстательной железы, желудка и толстой кишки, существенно расширяют имеющиеся представления о молекулярно-генетических механизмах возникновения и развития злокачественных новообразований. Установление роли полиморфизма генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1 и GSTP1 и их комбинаций в развитии злокачественных опухолей обосновывает возможность рекомендовать определение этих показателей в качестве диагностических параметров для выявления групп повышенного онкологического риска. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых патогенетически оправданных подходов к профилактике и ранней диагностике онкологических заболеваний, а также прогнозированию клинического течения злокачественных опухолей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вал-аллель цитохрома Р-450 СYP1A1, делеционные варианты генов глутатион-S-трансфераз Т1, М1 и Р1 играют важную роль в этиопатогенезе рака легкого, рака желудка, рака толстой кишки и рака предстательной железы, поскольку доля вариантных генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у онкологических больных статистически значимо превышает таковую у здоровых лиц.

2. Полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1 GSTT1, GSTM1, GSTP1 и гена онкосупрессора 53 участвуют в формировании повышенного риска возникновения злокачественных новообразований легкого, предстательной железы, желудка и толстой кишки.

3. Вариантные генотипы CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1 ассоциированы с клинико-морфологическими особенностями злокачественных новообразований легкого и предстательной железы и способствуют формированию неблагоприятного прогноза опухолей данных локализаций.

4. При местнораспространенном злокачественном процессе частота распределения вариантных генотипов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1 и гена онкосупрессора р53 превышает таковую при локализованном росте опухоли, что указывает на участие этих генов в процессе метастазирования.

5. Курение модулирует риск развития рака легкого, особенно его немелкоклеточной формы, при носительстве делеционных генотипов GSTT1, GSTM1, Вал-аллеля гена CYP1A1 и Про-аллеля гена р53.

6. Суммарное влияние функционально неполноценных вариантов генов цитохрома Р-450 и глутатион-S-трансфераз Т1, М1, Р1 превышает эффект индивидуальных вариантных генотипов, что увеличивает риск развития злокачественных новообразований. Выявлены специфичные комбинации генотипов, предрасполагающие к развитию рака легкого, рака предстательной железы, рака желудка и рака толстой кишки; определены интактные и протекторные комбинации полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в отношении злокачественных новообразований

Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на конгрессах Российского общества онкологов (г.Баку и г.Москва, 2005, 2006); на X Российском онкологическом конгрессе (г.Москва, 2006), на Российско-американской конференции «Профилактика и лечение злокачественных опухолей, связанных с курением» (г.Москва, 2006), на научно-практической конференции с международным участием «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи» (г.Барнаул, 2006), на I конгрессе Российского общества онкоурологов (г.Москва, 2006); на региональной конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (г.Томск, 2006); на 5 региональной научно-практической конференции урологов Сибири «Актуальные вопросы детской и взрослой урологии» (г.Томск, 2006); на конференции Всероссийской школы молодых онкологов «Актуальные вопросы онкоурологии» (г.Москва, 2006), на научно-практической конференции с международным участием «Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях» (г.Барнаул, 2007), на XI Российском онкологическом конгрессе (г.Москва, 2007), на II Российском симпозиуме «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» (г.Москва, 2009).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры патофизиологии (раздел «Патофизиология опухолевого роста»), кафедры биологии и генетики (разделы «Молекулярная генетика», «Популяционная генетика»), в лекционном курсе по молекулярной генетике для студентов медико-биологического факультета ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава, а также в практической деятельности ОГУЗ «Томский областной онкологический диспансер», в научно-практической деятельности НИИ гастроэнтерологии имени Г.К. Жерлова ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 работы, из них10 статей в ведущих рецензируемых журналах из «Перечня…» ВАК РФ, 14 статей и тезисов в материалах конференций, конгрессов, съездов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 240 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 57 таблицами. Библиографический указатель включает 377 источников, из них 177 отечественных и 200 зарубежных.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 255 больных раком легкого, 133 больных раком предстательной железы, 90 больных раком желудка и 66 больных раком толстой кишки (рак ободочной кишки, рак сигмовидной кишки) (табл. 1). В исследование были включены 255 больных раком легкого. Все они были радикально прооперированы в период с 2003 по 2007 год в онкологическом отделении ОГУЗ «Томский областной онкологический диспансер» («ТООД») г.Томска, в торако-абдоминальном отделении (зав. отделением - д.м.н. С.А. Тузиков) НИИ онкологии СО РАМН г.Томска. Среди этих пациентов было 232 мужчины и 23 женщины, средний возраст которых составил 56±9 лет. Диагноз рака легкого основывался на данных анамнеза и результатах рентгенологического, эндоскопического и морфологического обследований. Для формирования групп больных без метастазов (T1-4N0M0, 45,9% случаев, n=118) и больных, имевших очаги метастазирования в регионарных лимфоузлах и/или в отдаленных органах (T1-4N0-2M0-1, 54,1% случаев, n=137 пациентов) использовалась международная классификация рака легкого по системе TNM (1997г.). Гистологический тип опухоли определяли в соответствии с классификацией ВОЗ 1981г. Данное исследование проводилось в диагностическом отделении ОГУЗ «ТООД» (заведующий - д-р мед. наук Н. В. Севостьянова) и в отделении патологической морфологии НИИ онкологии СО РАМН (руководитель - д-р мед. наук, профессор В. М. Перельмутер). Во всех гистологических образцах уточнялся морфологический диагноз на основании унифицированных критериев различных типов рака легких в соответствии с современной гистологической классификацией (Colby T.V. et al., 1995).

Мелкоклеточный рак легкого был диагностирован в 46 случаях (18%, среди которых 5 женщин и 41 мужчина), немелкоклеточный рак легкого - в 209 случаях (82%, среди которых 18 женщин и 191 мужчина). В группу немелкоклеточного рака легкого вошли плоскоклеточный РЛ, аденокарциномы и крупноклеточный РЛ..

В группу больных раком предстательной железы вошли 133 мужчины, средний возраст которых составил 74±8 года, которые в период с 2005 по 2007 год были поставлены на диспансерный учет в ОГУЗ «ТООД» и НМУ «Лечебно-диагностический центр» г.Томска. Диагноз рак предстательной железы основывался на данных анамнеза, результатах ультразвуковой и лабораторной диагностики, рентгенологического, морфологического и эндоскопического обследований. Для формирования групп больных в соответствии со стадией заболевания была использована отечественная четырехстадийная классификация. Среди обследованных больных не оказалось ни одного с первой стадией процесса, вторая стадия была установлена у 41 больного, третья - у 60 и четвертая - у 32 пациентов.

В исследование были включены 90 больных раком желудка, которые находились на диспансерном учете и стационарном лечении в ОГУЗ «ТООД» в период с 2005 по 2007 год. Среди этих пациентов было 41 женщина и 59 мужчин, средний возраст которых составил 59±12 лет. Диагноз рака желудка основывался на данных анамнеза и результатах рентгенологического, эндоскопического и морфологического обследований.

Для формирования групп больных без метастазов (T1-4N0M0, 68,9% случаев) и больных, имевших очаги метастазирования в регионарных лимфоузлах и/или в отдаленных органах (T1-4N0-2M0-1, 31,1% случаев), использовалась международная классификация рака по системе TNM (1997г.). Гистологическое исследование биопсийного и операционного материала больных (выполнено в лаборатории патоморфологии диагностического отделения ОГУЗ «ТООД») позволило разделить всех больных раком желудка на 2 группы в соответствии с классификацией P.Lauren (1956): в первую группу (n=54) вошли пациенты, имеющие интестинальный гистотип (аденокарцинома), во вторую (n=36) - диффузный тип рака желудка, представленный мелко-, полиморфно-, и перстневидноклеточным раком.

В группу больных раком толстой кишки вошли 100 пациентов (73 женщины и 27 мужчин), средний возраст которых составил 69±8 лет, которые в период с 2005 по 2007 год были поставлены на диспансерный учет в ОГУЗ «ТООД» и радикально прооперированы в сочетании с химиотерапией. Диагноз рака толстой кишки основывался на данных анамнеза и результатах рентгенологического, эндоскопического и морфологического исследований.

Для формирования групп больных без метастазов (T1-4N0M0, n=40в) и больных, имевших очаги метастазирования в регионарных лимфоузлах и/или в отдаленных органах (T1-4N0-2M0-1, n=26), использовалась международная классификация злокачественных новообразований по системе TNM (1997г.).

Взятие клинического материала у всех обследованных лиц производился однократно до начала лечения. Впоследствии больным раком легкого проводилось комбинированное лечение (хирургическое лечение и лучевая терапия/ химиотерапия). Больные раком предстательной железы после постановки диагноза в большинстве случаев получали гормональную (антиандрогенную) или комплексную терапию. Больным раком желудка и кишечника проводились радикальные операции в сочетании с химио-/ лучевой терапией. Из исследования были исключены больные с обострением хронических воспалительных процессов, аутоиммунными заболеваниями, наследственными и психическими болезнями.

ген ксенобиотик онкологический заболевание

Таблица 1 Распределение обследованных лиц по группам наблюдения в соответствии с использованными методами исследования

Группу сравнения составили здоровые лица (первичные и штатные доноры крови ОГУЗ «Томская областная станция переливания крови») (231 обследованный с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту).

Средний возраст онкологических больных оказался равным 56±9 лет, здоровых доноров - 49±5 лет, что позволило сделать заключение o возможности сопоставления обследованных лиц по их возрастной характеристике. При этом наибольшее количество обследованных больных и здоровых доноров составляли мужчины среднего возраста. Во все обследованные группы больных и в контрольную группу здоровых были включены индивидуумы только европеоидного происхождения, поскольку существуют значительные межрасовые различия в распределении исследуемых генотипов и аллелей.

Материалом для исследования полиморфизмов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, цитохрома CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1 (кодируют соответственно глутатион S-трансферазы и1, м1 и р1), гена-супрессора опухолевого роста р53 явилась ДНК, выделенная из лейкоцитов венозной крови стандартным методом с использованием фенол-хлороформной очистки [Lahiri D.K. et al., 1992].

В работе был изучен MspI-полиморфизм (Ile/Val) гена CYP1A1, кодирующего фермент арилгидрокарбонгидроксилазу и участвующего в активации полициклических углеводородов [Белогубова Е.В. и соавт., 2004]. Типирование образцов по генам GSTT1 и GSTM1 проводили путем мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Spurdle A.B. et al., 2001] (рис. 1).

Рис. 1. Примеры идентификации 0/0 и + генотипов по генам GSTT1 и GSTM1:

ER - контроль амплификации (183 п.н.); 1 - генотип GSTT1 0/0 GSTM1 0/0; 2, 5, 7 - GSTT1 + GSTM1 + (131 и 114 п.н. соответственно); 3, 4, 6 - GSTT1 0/0 GSTM1 +; 8 - GSTT1 + GSTM1 0/0.

Для гена GSTP1 определяли полиморфизм, связанный с наличием в пятом экзоне гена «дикого типа» или «мутантного» аллелей, характеризующихся соответственно наличием или отсутствием сайта рестрикции для BSTMA I [Miller D. P., 2002].

Гомозиготную делецию (del105/del105) гена GSTP1 определяли по наличию на электрофореграммах фрагментов, размером 91 и 85 п.н., гетерозиготную делецию (GSTP1/del105) выявляли по присутствию на электрофореграммах трех фрагментов, размером 176, 91 и 85 п.н. Наличие на электрофореграмме одного фрагмента, размером 176 п.н., свидетельствовало о наличии нормального (без делеции) гена GSTP1 (рис. 2).

Для изучения метилирования промотора гена GSTP1 из опухолевого материала больных раком легкого выделяли ДНК (метод фенол-хлороформной очистки). Перед постановкой метил-специфичной ПЦР [Jeronimo, C., 2001, Susan V.H., 2002] ДНК подвергалась бисульфитной модификации и очистке с помощью набора реактивов«Wizard DNA clean-up system», Promega [Jeronimo, C., 2001, Susan V.H. 2002]. Наличие сайта метилирования определяли по присутствию на электрофореграмме участка, длиной 173 п.н., контролем амплификации служило обязательное наличие на электрофореграмме участка ДНК такой же длины, соответствующее неметилированной области гена GSTP1.

Рис. 2. Идентификация полиморфизма аллелей GSTP1 методом ПДРФ: 1, 2, 3, 8, 9 - генотип GSTP1/del105 (176, 91 и 85 п.н.); 4, 5, 6 - генотип GSTP1 (176 п.н.); 7 - генотип GSTP1 del105/del105 (91 и 85 п.н.).

Исследование Arg/Pro-полиморфизма кодона 72 гена р53 проводили методом ПЦР/ПДРФ-анализа. Арг/про-полимофизм гена р53 выявлялся эндонуклеазой рестрикции BstFNI.

При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания, а также методы проверки статистических гипотез [Лакин Г.Ф., 1980, Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2006]. Для анализа имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Колмогорова-Смирнова). При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (U-тест). Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 [Лакин Г.Ф., 1989; Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2006]. При сравнении частот генотипов использовался стандартный критерий ² Пирсона. При условии, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали двусторонний критерий Фишера. Относительный риск (OR) развития заболевания при определенном генотипе рассчитывался по стандартной формуле

OR=a/b x d/c,

где a и b - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно, и d и с - количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип. OR указан с 95%-ным доверительным интервалом [Флейс Д., 1989].

С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). Коэффициент корреляции считали значимым, если вероятность ошибки не превышала 0,05 (5%).

Таблица 2 Последовательность праймеров и условия проведения ПЦР-ПДРФ-анализа

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Большинство онкологических заболеваний по своей природе являются мультифакториальными, так как в механизмы их возникновения и развития вовлекаются много разных функционально взаимосвязанных генов (генные сети), включающих, наряду с главными генами (онкогены и гены-супрессоры), другие, второстепенные, так называемые гены-модификаторы, эффект которых во многом определяется средовыми факторами [Kinzler K.W., Vogelstein B., 1997; Баранов В.С. и соавт., 2000; Колчанов Н.А. и соавт., 2000; Пальцев М.А., 2004;Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н., 2007; Давыдов М.И. и соавт., 2008].

Вероятность возникновения в одной клетке нескольких генетических изменений резко повышается при нарушении работы систем, контролирующих целостность генома. В связи с этим нарушения, ведущие к генетической нестабильности, также являются неотъемлемым этапом опухолевой прогрессии [Курчин В.П., 2003; Копнин Б.П., 2006; Бочков Н.П., 2008]. Факторы, участвующие в развитии онкопатологии, реализуются в человеческой популяции с высокой степенью вариабельности. В последнее время интенсивно развивается молекулярная эпидемиология, целью которой является поиск и практическое применение специфичных, чувствительных и обладающих прогностической информативностью маркеров патогенного воздействия окружающей среды и маркеров предрасположенности индивидов к злокачественным новообразованиям [Баранов В.С.и соавт., 2000; Давыдов М.И., 2006; Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н., 2007].

К изменению функциональной активности белков-онкосупрессоров в определенных условиях могут предрасполагать генетические полиморфизмы (ГП) [Тюляндин С.А., 2000]. Полиморфными являются гены, представленные в популяции несколькими разновидностями - аллелями. В отличие от мутаций, приводящих к патологическим изменениям, влияние генетического полиморфизма на фенотип выражено менее отчетливо. Являясь в основном нейтральными, полиморфизмы меньше подвергаются естественному отбору, а поэтому их частота в популяции нередко весьма значительна. С другой стороны, генетические полиморфизмы далеко не всегда проявляются как нейтральные мутации. Значительно чаще ГП приводят к появлению белковых продуктов с несколько измененными физико-химическими свойствами и, соответственно, параметрами функциональной активности. При этом известно, что различные аллельные варианты генов в зависимости от географических условий, диеты, этнической принадлежности могут предрасполагать, либо, напротив, препятствовать проявлению того или иного заболевания. Гены, аллельные варианты которых предрасполагают к определенным заболеваниям, получили название генов предрасположенности [Kinzler K.W., Vogelstein B., 1997; Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А, 2002; Баранов В.С., 2004; Пальцев М.А., 2004; Бочков Н.П., 2006].

Проведенный нами комплексный анализ полиморфизмов генов, кодирующих ферменты фазы 1 (CYP1А1) и фазы 2 (GSTT1, GSTM1 и GSTP1) биотрансформации ксенобиотиков, позволил выявить ряд закономерностей и более четко определить спектр генов, вовлеченных в патогенез рака легкого, рака желудка, рака толстой кишки и рака предстательной железы.

Выбор исследованных генов был не случаен. Как известно, ген CYP1А1 кодирует цитохром Р-450, экспрессия которого наиболее активна в печени и легких. Если в белке, кодируемом данным геном, изолейцин заменен на Валин, то такой фермент в 2 раза более активен, чем исходный белок, и это сопровождается увеличением концентрации токсических метаболитов и накоплением свободных радикалов [Засухина Г.Д., 2005]. В немногочисленных исследованиях [Goldstein J.A., de Morais S.M.F., 1994; Benhamou S. et al., 1997; Sadйe W., 1999; Wang H. et al., 2003; Ляхович В.В. и соавт., 1997; Улыбина Ю.М. и соавт., 2005; Имянитов Е.Н., 2007] показано, что некоторые ферменты семейства цитохромов (CYP), метаболизирующие канцерогенные составляющие табака (ПАУ) и стероидные гормоны, связаны с повышенным риском злокачественных новообразований легких, пищевода, головы и шеи, раком молочной железы. Следует отметить, что основное внимание исследователей, судя по имеющимся у нас данным литературы, сосредоточено на изучении полиморфизма гена CYP1A1 у больных раком легкого.

Однако, канцерогенный эффект реактивных метаболитов, образующихся с участием цитохрома Р-450-1А1, может проявляться и в других органах и тканях, являющихся «входными воротами» для ксенобиотиков, и в которых есть экспрессия этого цитохрома. Кроме того, реактивные метаболиты могут мигрировать из тканей, в которых они образовались, например клеток печени, где происходит основной метаболизм ксенобиотиков, и оказывать влияние на другие органы и ткани [Raunio H. еt al., 1995; Ляхович В.В. и соавт., 1997].

Желудок и кишечник являются органами, подвергающимися контакту с поступающей водой и пищей. Кроме того, они являются также интенсивно перфузируемыми органами. Поэтому эпидемиологическое значение исследуемых генотипов для рака этих локализаций может быть весьма существенным.

Полученные нами результаты исследования полиморфизма CYP1A1 в группах больных раком легкого, раком желудка, раком толстой кишки и раком предстательной железы (рис. 3) выявили достоверное увеличение Вал-аллеля по сравнению со здоровыми донорами.

Рис. 3. Частота (в %) Вал-аллеля CYP1A1, функционально неполноценных генотипов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком легкого, раком желудка, раком толстой кишки, раком предстательной железы; * - достоверность различий по сравнению с показателями у здоровых доноров (р< 0,05).

Рис. 4. Показатели относительного риска (OR) развития злокачественных новообразований (рака легкого - РЛ, рака желудка - РЖ, рака толстой кишки - РТК, рака предстательной железы - РПЖ) для носителей Вал-аллеля CYP1A1 при р<0,05.

Таблица 3 Частота (в %) вариантных генотипов и аллелей генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1, р53 у больных раком легкого, раком предстательной железы, раком желудка, раком толстой кишки и у здоровых доноров

Примечание: p - уровень статистической значимости различий параметров, достигнутый с помощью теста Хи-квадрат с поправкой Йейтса, по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров; OR - относительный риск развития злокачественного новообразования.

Так, OR в группах обследованных составил 5,86; 5,06; 4,43; 3,43, соответственно, при р<0,05 (рис. 4). Таким образом, проведенные нами исследования полиморфизма CYP1A1 свидетельствуют, что наличие мутантного Вал-аллеля является фактором риска рака для всех изученных нами локализаций опухолей.

Поскольку в литературе нам не встретились данные по распределению вариантных аллелей CYP1A1 в зависимости от клинико-морфологических особенностей опухолевого роста изученных локализаций, мы провели исследование полиморфизма данного гена в зависимости от наличия очагов метастазирования у онкологических больных, гистологического типа опухоли и стадии заболевания.

Сравнительный анализ частоты патологического аллеля CYP1А1 в группах больных с разными гистологическими типами опухоли (РЛ и РЖ) не обнаружил достоверных различий, хотя в выборке немелкоклеточного рака легкого регистрировалась более высокая частота Вал-аллеля CYP1A1 (13,6%), чем у пациентов с мелкоклеточной формой опухолевого роста (9,8%) (рис 5).

Рис. 5. Частота (в %) вал-аллеля CYP1A1, функционально неполноценных генотипов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легкого (МРЛ, НМРЛ), интестинальным и диффузным раком желудка (ИРЖ, ДРЖ); * - достоверность различий по сравнению с показателями у здоровых доноров (р< 0,05).

При проведении изучения частоты распределения вариантных аллелей CYP1A1 в зависимости от стадии заболевания у больных раком предстательной железы статистически значимых различий выявлено не было.

У больных раком легкого и раком желудка, имеющих метастазы, было выявлено двукратное увеличение частоты Вал-аллеля, у больных раком толстой кишки с метастатическими очагами данный показатель был повышен в 4 раза по сравнению с таковым у пациентов соответствующих локализаций без очагов метастазирования (рис.6). Полученные ассоциации, на наш взгляд, можно объяснить тем обстоятельством, что реактивные формы промежуточных метаболитов, интенсивно образующихся в процессе биоактивации ксенобиотиков под воздействием мутированного CYP1A1, способствуют ангиогенезу. В результате этого будет наблюдаться быстрый рост снабжающих опухоль кровеносных сосудов, которые способствуют прогрессии опухоли и раннему метастазированию, что, в конечном итоге, и обусловливает неблагоприятный прогноз заболевания.

Рис. 6. Частота (в %) вал-аллеля CYP1A1 у больных раком легкого, раком желудка и раком толстой кишки с метастазами и без таковых; * - достоверность различий по сравнению с показателями у пациентов без метастазов (р< 0,05).

Кроме того, в настоящее время для многих форм рака описано появление мутаторного фенотипа у клеток злокачественных новообразований, основной причиной которого считают мутационные нарушения ферментных систем репарации, что имитирует внутриклеточное возрастание концентрации мутагенов [Патрушев В.Л., 2004; Копнин Б.П., 2006; Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н., 2007; Коничев А.С., Севостьянова Г.А. 2008]. Обсуждается также еще один возможный путь малигнизации нормальных клеток через образование эндогенных мутагенов. При этом повреждение систем репарации ДНК будет вторичным по отношению к первичному синтезу эндогенного мутагена. Помимо высокоэффективных репаративных систем, понижающих частоту спонтанного мутагенеза в соматических клетках, защиту от эндогенных ксенобиотиков отчасти осуществляет иммунная система. Предполагается, что при ее участии элиминируются мутантные соматические клетки, экспонирующие мутантные белки на своей поверхности и распознающиеся как чужеродные антигены [Патрушев В.Л., 2004; Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н., 2007; Бочков Н.П., 2007]. Однако в большинстве случаев, по-видимому, этого не происходит, так как мутантные белки локализованы внутри клеток. Кроме того, для опухолевых клеток характерно ускользание из-под иммунологического надзора [Головизин М.В., 2001; М.А. Пальцев М.А. и соавт., 2007].

Известно, что этот фермент цитохрома CYP1А1 осуществляет в клетке метаболическую активацию ксенобиотиков. Нередко, однако, промежуточные продукты биотрансформации, особенно на начальных этапах, могут быть весьма токсичными, обнаруживать более выраженную мутагенную, канцерогенную и даже тератогенную активность по сравнению с нативными ксенобиотиками и вследствие этого быть причиной различных патологических состояний и болезней. Токсический эффект промежуточных метаболитов в значительной мере определяется функциональным состоянием ферментов фазы 2 детоксикации [Иващенко Т.Э. и соавт., 2003]. Логично предполагать, что сниженная активность или отсутствие некоторых ферментов фазы 2 детоксикации способствует более длительному сохранению в организме промежуточных продуктов биотрансформации ксенобиотиков, которые могут провоцировать и способствовать развитию патологических процессов, связанных со злокачественной трансформацией клеток.

Исследованные нами гены ферментов второй фазы биотрансформации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1 и GSTP1 кодируют три различные формы глутатион-S-трансфераз - Т1, М1, Р1. В настоящее время известны аллельные варианты генов GSTT1, GSTM1, так называемые, нулевые аллели, которые на уровне фенотипа проявляются отсутствием белковых продуктов. Поскольку данные ферменты являются важными компонентами системы детоксикации, гомозиготность по нулевому аллелю одного или другого гена может быть связана с повышенной восприимчивостью организма к вредным воздействиям и, как следствие, с увеличением риска возникновения злокачественных новообразований. Полиморфизм гена GSTM1, картированного на хромосоме 1p13.3, ведет к полной потере фермента [Seidegard J., Pero R.W. 1985], таким образом, самоустраняясь из пути сопряжения и детоксикации реактивных метаболитов, особенно эпоксидов ПАУ [Smith G. et al., 1995]. Аналогичный вариант полиморфизма, приводящего к полной потере ферментативной активности, был обнаружен для гена GSTT1, расположенного на хромосоме 22q11.23 [Pemble S. et al., 1994]. GSTT1 участвует в детоксикации канцерогенных промежуточных продуктов сгорания табачного дыма, а именно моногалогенметанов и бутадиена. GSTP1 - это самая представленная изоформа глутатион-S-трансфераз в легких, которая детоксицирует ПАУ [Anttila S. et al.,1993]. Полиморфизм замены единственного нуклеотида в 5 экзоне гена GSTP1 (Ile105Val), расположенного на хромосоме 11q13, проявляется значительным снижением активности фермента среди индивидуумов, которые несут одну или более копий Г (гуанина) (Ile/Val или Val/Val) по сравнению с теми, кто имеет A/A (аденин/аденин; Ile/Ile) генотип [Watson M.A. et al., 1998]. Наличие, по крайней мере, одной копии аллеля Г в гене GSTP1 также связано с увеличением уровня ДНК-аддуктов в ткани легкого [Butkiewicz D.et al., 2000]. Учитывая количество известных канцерогенных веществ и путей их метаболизма, в которых они, предположительно, взаимодействуют, исследование комбинаций этих генотипов может обеспечить лучшее понимание механизмов онкогенеза легкого. Представленные далее результаты показывают, что оценка вариантных генотипов глутатион-S-трансфераз и (особенно) их комбинаций связаны с риском развития онкологических заболеваний и играют немаловажную роль в прогнозе течения опухолевого процесса. Оценивая полученные нами результаты, уместно напомнить, что делеционные формы генов GSTT1 и GSTM1, приводящие к отсутствию соответствующих ферментов, рассматриваются как факторы риска возникновения рака молочной железы, рака пищевода, рака шейки матки, рака мочевого пузыря, неполипозного рака толстой кишки, рака легкого [Zong S. et al., 1991, 1993; Kim J.W. et al., 2000; W.Tan, et al., 2001; Benhamou S. et al., 2002; Hung R.J. et al., 2003; Пальцев М.А., 2004; Имянитов Е.Н., 2007].

В настоящем исследовании было установлено, что индивидуальные эффекты каждого из исследуемых генов ведут к увеличению риска развития РЛ. Наименьший относительный риск (OR) выявлен для носителей делеционного варианта гена GSTМ1, он составил 2,34 (CI_95% 1,60-3,42) (рис. 7). Большинство американских исследователей не находили значимого увеличения риска развития РЛ, связанного с 0/0- генотипом GSTM1, в популяциях американцев европеоидного происхождения, однако объединение разрозненных данных и проведение мета-анализа позволило достигнуть статистически достоверных значений [Benhamou S. et al., 2002]. В крупном исследовании американцев европеоидного и африканского происхождения также сообщается об умеренном увеличении относительного риска развития РЛ (1,3 и 1,5 соответственно), связанного с GSTM1-нуль генотипом [Cote M.L., 2005]. Немногочисленные же российские источники, напротив, сообщают о высоком риске РЛ при носительстве нулевого аллеля гена GSTM1 [Ляхович В.В., 1997]. Акцент на страну проведения исследования и антропологические характеристики обследованных лиц нам представляется уместным, поскольку имеются значительные межрасовые и межпопуляционные различия в полиморфизме генов глутатион-S-трансфераз [Watson M.A. et al.,1998]. Учитывая данные современной литературы, GSTM1-нуль генотип оценивается как вероятный фактор риска для развития РЛ, хотя для некоторых популяций и с малой величиной эффекта.

Для рака желудка, толстой кишки и предстательной железы также было зарегистрировано статистически значимое увеличение частоты нулевого генотипа GSTM1 по сравнению с контрольными значениями. Рисковая значимость при этом составила для рака желудка - 1,70, для рака толстой кишки - 1,78, для рака предстательной железы - 2,24.

Рис. 7. Показатели относительного риска (OR) развития злокачественных новообразований (рака легкого - РЛ, рака желудка - РЖ, рака толстой кишки - РТК, рака предстательной железы - РПЖ) для носителей нулевых генотипов GSTM1 (А), GSTT1 (В) при р<0,05.

Анализ доли гомозигот по нулевому аллелю глутатион-S-трансферазы Т1 показал достоверную связь делеционной формы этого гена и риска развития рака легкого (OR=4,26), что согласуется с данными современной литературы, которые также постулируют увеличение относительного риска рака легкого, связанного с GSTT10/0 [Spitz M.R. et al., 2000, Hou S.M. et al., 2001, Sorensen M. et al.,2004]. Для рака предстательной железы было выявлено двукратное увеличение частоты нулевого генотипа GSTT1 по сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц. Риск развития рака предстательной железы у носителей нулевого генотипа GSTT1 составил 2,98 (рис. 7).

В распределении вариантных генотипов гена GSTT1 были получены достоверные различия между больными раком легкого и раком предстательной железы по сравнению со здоровыми лицами.

Из генов семейства глутатион-S-трансфераз полиморфизм GSTP1 наименее представлен в публикациях по раку легкого. Аллельные варианты данного гена (GSTP1/del105 - А/Г и del105/del105 - Г/Г), кодирующие синтез белка со сниженной ферментативной активностью, нами были объединены в одну группу показателей. При этом частота делеционного аллеля гена GSTP1 (29,8%) почти в 2 раза превышала таковую у здоровых доноров (15,4%), а относительный риск развития рака легкого составил 2,34 (CI_95% 1,68-3,25). Для рака желудка и кишечника также была установлена статистически более высокая частота функционально неполноценного аллеля по сравнению со здоровыми лицами (26,7 и 31,8%, соответственно при р=0,000). Наибольшая частота делеционного аллеля данного гена регистрировалась в выборке больных раком предстательной железы (41%), при этом риск развития данного заболевания составил 5,10 (CI_95% 3,14-8,31) (рис. 8).

Рис. 8. Показатели относительного риска (OR) развития злокачественных новообразований (рака легкого - РЛ, рака желудка - РЖ, рака толстой кишки - РТК, рака предстательной железы - РПЖ) для носителей нулевых генотипов GSTР1 при р<0,05.

Противоречивость данных литературы о влиянии глутатион-S-трансфераз на формирование онкологического риска при различных онкологических заболеваниях побудило нас исследовать различные по механизмам развития онкопатологии (рак легкого, рак желудка, рак толстой кишки и рак предстательной железы) и сделать заключение о специфичности участия этих ферментов в канцерогенезе.

С клинической и особенно прогностической точки зрения метастазирование представляет собой важнейший этап в патогенезе злокачественных опухолей. Это свойство злокачественного онкологического процесса в значительной степени зависит от свойств первичной опухоли, а также от неоангиогенеза и подвижности опухолевых клеток [Engers R., Gabbert H.E., 2000; Meyer T., Hart I.R., 1998; Георгиев Г.П., 2000; Заридзе Д.Г., 2000; Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., 2000; Аничков Н.М., 2003; Давыдов М.И., 2008; Чиссов В.И. и соавт., 2009].

В настоящем исследовании установлено, что нулевые генотипы GSTT1, GSTM1 и патологические аллели GSTP1 играют важную роль в прогрессии злокачественных новообразований, поскольку нами была обнаружено достоверное увеличение доли делеционных вариантов GSTT1 и тенденция к преобладанию нулевых вариантов гена GSTM1 у больных раком легкого с метастазами (рис. 9).

Рис. 9. Частота функционально неполноценных генотипов GSTT1, GSTM1, GSTP1 у больных раком легкого, раком желудка, раком толстой кишки в зависимости от наличия очагов метастазирования.

Наличие метастатических очагов у больных раком желудка ассоциировано с более высокой частотой нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1. Поскольку в доступной литературе мы не нашли данных по распределению генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в зависимости от клинических особенностей опухолевого процесса, таких как стадия онкологического заболевания, распространенность опухолевого узла, наличие очагов метастазирования, прогрессирование заболевания, влекущее вслед за собой неблагоприятный исход, можно предположить, что нулевые генотипы GSTT1 и GSTМ1, кодирующие функционально неполноценные ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков - глутатион-S-трансферазы Т1 и М1, способствуют более длительному сохранению в организме активных промежуточных метаболитов, обладающих мутагенными и канцерогенными свойствами, которые могут не только провоцировать возникновение злокачественной опухоли, но и способствовать её метастазированию и прогрессированию заболевания. Метастазирование злокачественных новообразований является динамическим, многоэтапным, каскадным процессом. Для образования метастатического очага необходимо разъединение, обособление малигнизированных клеток с полной утратой межклеточных кадхерин-катениновых контактов и выход их из озлокачествленного паренхиматозного комплекса в первичном опухолевом узле [Engers R., Gabbert H.E., 2000; Георгиев Г.П., 2000; Аничков Н.М., 2003; Галицкий В.А., 2003; Луценко С.В. и соавт., 2003;Давыдов М.И., 2008; Коничев А.С. и соавт., 2008].