Материал и методы. Материалом для исследования послужил операционный и биопсийный материал пациентов, проходивших лечение в МНИОИ им. П.А. Герцена по поводу рака мочевого пузыря с 1995 по 2004 год. В работу включены 372 больных. Исследован материал 266 биопсий, 229 трансуретральных резекций МП, 73 резекций, 113 цистэктомий (всего 681). Из 372 пациентов 294 были мужчинами, 78 - женщинами. Возраст мужчин от 23 до 82 лет (средний 61), женщин - от 37 до 81 года (средний 63). Распределение по стадии заболевания было следующим: Та - 60 больных, Т1 - 187, Т2 - 63, Т3 - 44, Т4 -18.

В соответствии с особенностями клинического течения и для оценки прогностической значимости изучаемых факторов пациенты были разделены на три группы: 1- группа с благоприятным течением заболевания (отсутствие рецидива заболевания или многолетняя ремиссия после 1-2 поверхностных рецидивов) , 2 - группа с упорно рецидивирующим течением (многократное поверхностное рецидивирование) , 3 - группа с неблагоприятным прогрессирующим течением (развитие более глубокой инвазии и/или метастазирование рака).

Иммуногистохимический метод

Для иммуногистохимического исследования были использованы более 20 коммерческих антител: PCNA, Ki67, циклин D1 (маркеры пролиферативной активности), Bcl2, BclX, CD95 (маркеры апоптоза), мутантный р53, р16 (маркеры супрессии опухолевого роста), HER2/neu, EGFR (рецепторы эпидермального фактора роста), VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста), CD34 (маркер эндотелия сосудов), ММР-1, ММР-2, ММР-9 (матриксные металлопротеинразы), TIMP-1 и TIMP-2 (тканевые ингибиторы матриксных металлопротениназ), Е-кадгерин, бета-катенин, CD44 (молекулы адгезии), тенасцин, коллаген IV типа, ламинин (компоненты внеклеточного матрикса), из них антитела к тенасцину, HER2/neu, ламинину - поликлональные, остальные - моноклональные. Большинство антител произведено фирмой «Dako»: PCNA, Ki-67(MIB.1), р53(DO7), Bcl2, Е-кадгерин, В-катенин, тенасцин, EGFR, коллаген IV, CD44, р16, HER2/neu, ламинин, ММР9. Антитела к BclX, ММР1, ММР2 и их ингибиторам, CD95 произведены фирмой «NovoCastra», а к циклину D1 - фирмой «Pick Cell Laboratories». Иммуногистохимические реакции проводили по стандартной методике. Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме (ММР, TIMP) и на мембранах клеток (молекулы адгезии) оценивали полуколичественным способом по шкале от 0 до 3 баллов с помощью анализатора изображения «Leica Q550», учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 - отсутствие реакции, 1 - слабая реакция, 2 - умеренная реакция, 3 - сильная реакция. При оценке реакции с антителами к HER2/neu и EGFR использовали общепринятую для фармакодиагностики шкалу оценки от 0 до 3+ (Jacobs T.W. et al., 1999).

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki67, p53, bcl2 и др.) оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения и выражая полученные результаты в процентах. Пролиферативную активность оценивали следующим образом:

1) 0% - 20% - низкая пролиферативная активность,

2) 21% - 50% - умеренная пролиферативная активность,

3) 51% - 100% - высокая пролиферативная активность

Метод количественной оценки экспрессии тенасцина

Нами была разработана специальная оригинальная методика с использованием анализатора изображения и модифицированной компьютерной программы. Интенсивность экспрессии тенасцина оценивали путем измерения площади среза, занятой положительной иммуногистохимической реакцией с антителами к тенасцину. Методика включала в себя следующие этапы:

Для получения цветного изображения использовали световой микроскоп LEICA DMRB, сопряженный с телекамерой ProgRes 3012 и компьютером. Изображения захватывались при увеличении x100, что соответствовало размеру поля зрения 1,28x0,98 мм2 при разрешении 1440x1100 пикселей. С каждого микропрепарата захватывалось по 3 наиболее репрезентативных поля зрения. Перед определением площадей, занимаемых элементами изображения, проводились четкие границы между ними с использованием инструментов программы АdоЬе Рhotoshop 7,0. Последовательные шаги обработки изображения (названия инструментов приведены для англоязычной версии программы):

1. Регулировка яркостно-контрастных параметров, позволяющая визуализировать слабую реакцию и, по возможности, удалить фон.

2. Сдвиг цветов изображения для повышения цветового контраста и облегчения выделения участков со слабой окраской белка.

3. Размывание изображения для более равномерной окраски участков, содержащих тенасцин.

4. Получение на изображении более четких, чем исходные, границ между участками с/без реакции.

5. Выделение всех участков изображения без реакции.

6. Инвертация выделения (Select\Invers). Выделенными оказываются структуры, содержащие тенасцин.

7. Контроль точности выделения на исходном изображении.

8. Сохранение в б-канале.

9. Создание пустого слоя. Закрашивание выделения красным цветом. Инвертация и закрашивание выделения голубым цветом.

Таким образом, получено изображение, где все структуры, содержащие тенасцин, закрашены красным цветом, не содержащие - голубым; при этом отсутствует оптическая гетерогенность внутри соответствующих областей изображения. Граница между структурами четкая, структуры однозначно определяются программами анализа изображений.

Методика определения плотности сосудистой сети

Нами разработана новая методика с использованием анализатора изображения, состоящая из нескольких этапов:

1. Проводится сканирование всей площади гистологического среза, на котором сосуды визуализированы при помощи иммуногистохимической реакции с антителами к эндотелию CD34.

2.Ручное выделение и закрашивание черным цветом участков изображения, не относящихся к опухоли.

3.Регулировка яркостно-контрастных параметров с улучшением визуализации слабой реакции удалением фона.

4.Сдвиг цветов изображения для повышения цветового контраста.

5.Размывание изображения для равномерного окрашивания. Устранение мелких дефектов.

6.Выделение инструментом Magic Wang участков, соответствующих сосудам. Чувствительность инструмента подбирается под конкретное изображение. Выделение сохраняется в a-канале.

7.Контроль точности выделения на исходном изображении (слой Background).

8.Закрашивание выделенных объектов красным цветом.

9.Инвертация выделения (Select/Invers). Выделенными оказываются структуры без сосудов. Выделение закрашивается голубым цветом.

10.Контроль правильности разметки.

11. Определение количества сосудов на единицу площади среза опухоли с помощью программы анализа изображения (Quontinut), т.е. определение плотности сосудистой сети.

По разработанной методике подана заявка на патент.

Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)

Для определения амплификации гена HER2/neu и выявления анеуплоидии по хромосомам 3,7,17 и делеции локуса 9р21 использовались наборы для флуоресцентной гибридизации фирм «Dako» и «Vysis (Abbott)» и автоматический гибридайзер «Hybridazer Dako». Результаты оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioscop 40» («Zeiss») c телекамерой «Axiocam» с использованием двойного фильтра для красителей FITC и Texas Red: подсчитывали количество зеленых меток, связанных с центромерным участком 17 хромосомы и количество красных меток, связанных с геном HER2/neu. Наличие или отсутствие амплификации определяли по соотношению красных (ген HER2) и зеленых сигналов (центромерный участок), амплификация считалась обнаруженной при соотношении больше чем 2,2. Анеуплоидию по хромосомам 3,7,17 и делецию локуса 9р21 оценивали с использованием набора Uro Vysion Bladder Cancer Kit (Abbott), содержащего 4 различные по цвету флуоресцентные метки: хромосома 17 - голубой, хромосома 7 - зеленый, хромосома 3 - красный, 9р21 - желтый. Оценку результатов проводили, подсчитывая количество каждой из флуоресцентных меток в 60 клетках опухоли, принимая, что нормой является содержание во всех клетках по 2 сигнала каждой цветной метки.

Метод хромогенной гибридизации in situ (CISH)

Для определения наличия ДНК вируса папилломы человека в клетках уротелиального рака использовали детекционные наборы «Микровирус ВПЧ» (Экспериментальное медико-биологическое производство Кардиологического научно-производственного центра, Россия) и «Rembrandt HPV» (PathPan, Нидерланды). Исследование проводили также с использованием автоматического гибридайзера. После ферментативной предобработки парафиновых срезов и нанесения зондов к ВПЧ разных типов (общему, 6,11, 16, 18, 31, 33) денатурацию ДНК проводили при 95⁰С, а гибридизацию - при 37⁰С в течение 16-18 часов. В качестве хромогена использовали краситель АЕС. Реакцию оценивали с помощью анализатора изображения «Leica Q550».

Также для молекулярно-генетических исследований применялись следующие методы:

1. Лазерная микродиссекция

Микродиссекция выполнялась на депарафинированных срезах толщиной 7мкм с помощью системы лазерной микродиссекции ASLMD (Leica microsystems, Германия). Участки опухоли и окружающей ткани вырезали лазером и собирали в отдельные пробирки.

2. Полимеразно-цепная реакция для определения мутаций гена FGFR.

Для выявления мутаций 7 экзона гена FGFR ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1 мкг геномной ДНК добавляли 0.05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl₂. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95⁰С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95⁰С - 30 с, отжиг и элонгация при 58⁰С - 2 мин 30 с. Нуклеотидная последовательность праймеров представлена в таблице 2. Продукты ПЦР разделяли в 6%-ном денатурирующем полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра.

3. Секвенирование гена FGFR.

Для приготовления пробы на сиквенс вырезанный фрагмент агарозного геля с необходимой ДНК инкубировали при -70°С не менее 30 мин. В жидкость, выдавленную из геля и помещенную в отдельную пробирку, добавляли 3M раствор ацетата натрия (pH=5.2) (1/12 объема) и равный объем изопропанола. Смесь повторно инкубировали при -70°С в течении 30 мин, а затем центрифугировали 15 мин. (миницентрифуга MiniSpin, Eppendorf, 13000 об/мин). Осадок высушивали на воздухе и растворяли в 15-25 мкл бидистиллированной воды. Секвенирование проводилось по протоколам ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits (“Applied Biosystems”, США).

4. Микросателлитный анализ.

Для идентификации потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности (МН) в хромосомных районах 17р13 и 9р21 были использованы 3 высокополиморфных маркера TP53, D9S942, D9S169. В качестве контроля использовали ДНК лейкоцитов периферической крови. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1 мкг геномной ДНК добавляли 0.05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50мМ KCl, 10мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5мМ MgCl₂. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95⁰С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95⁰С - 30 с, отжиг и элонгация при 58-60⁰С - 2 мин 30с.

Нуклеотидная последовательность праймеров и режимы отжига представлены в таблице 1.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров.

5. Электрофорез в ПААГ.

Электрофорез продуктом ПЦР проводили в 8% ПААГ при 4^ОС в течение 3-5 часов.

Состав 8% ПААГ:

8,4 мл 30% раствора АА (29:1)

1,5 мл 10х буфера ТВЕ,

до 30 мл дист. воды,

600 мкл 10% аммония персульфата (APS),

26 мкл ТЕМЕД.

Визуальный контроль пробега проб ДНК проводили по ксиленцианолу и бромфеноловому синему. Для фиксации результатов ПААГ проводили ксерокопирование или сканирование гелей.

6. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра.

После электрофореза гель помещали в раствор 10% метанола и 5% уксусной кислоты на 10-15 минут. Затем дважды отмывали дистиллированной водой. После этого гель инкубировали в растворе 0,011М AgNO₃ в течение 10-15 минут, трижды промывали в дистиллированной воде. Проявление проводили в модифицированном растворе проявителя (увеличена концентрация НСНО) следующего состава: 0,75M NaOH; 0,5 M HCHO; 2,3mM Na(BH₄) около 10-15 минут, в зависимости от интенсивности проявления геля. ПГ оценивали как ослабление или отсутствие полосы одного из аллелей относительно контроля, на МН указывало появление дополнительной полосы.

7. Программное обеспечение.

Компьютерный анализ ДНК проводился с использованием следующих программ:

1) поиск полноразмерной нуклеотидной последовательности генов по базам данных Blast и Fasta;

2) анализ ДНК на наличие сайтов ферментов рестрикции при помощи программ Genebank Pustell, Genepro, WIN-SUN;

3) компьютерное конструирование олигонуклеотидных праймеров и подбор условий для проведения ПЦР с использованием программы Oligo 4.0 и MethPrimer;

4) анализ хроматограмм секвенированных последовательностей и распечатка результатов - с помощью программ Executor и Chromas.

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ проводили с использованием программы Excel с пакетом анализа данных по методам, описанным в книге «Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel» (Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2000г.).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Прогноз уротелиального рака в нашем исследовании был связан со степенью анаплазии. Опухоли с прогрессирующим течением преобладали в группе карцином G3 - 47,2%, в группе G2 составляли 10,8%, а в G1 - 5,9%. Мы не обнаружили связи степени дифференцировки с рецидивами. Возможно, имеет значение способ лечения и более агрессивная тактика, в частности хирургическая, применяемая при уротелиальном РМП с высокой степенью анаплазии.

Изучалась значимость метапластических изменений в РМП. Обнаружено, что в умеренно и низкодифференцированных уротелиальных карциномах плоскоэпителиальная и железистая метаплазия выявлена в 50,5% и 56,9% случаев соответственно, в то время как в высокодифференцированных карциномах - лишь в 2,15% наблюдений. Отмечено также нарастание метапластических изменений с увеличением стадии процесса. Однако достоверной зависимости прогноза от этого фактора получено не было, отмечено некоторое увеличение (47,3%) частоты метапластических изменений в группе больных с неблагоприятным прогрессирующим течением. Это вероятнее всего связано не столько с клиническим поведением опухоли, сколько с повышением степени анаплазии, которая, безусловно, сопровождается изменением направления дифференцировки опухолевых клеток. Особенно это свойственно уротелиальной карциноме, так как и нормальный уротелий обладает свойствами и железистого и плоского эпителия.

Мы не выявили связи между наличием сосудистой инвазии и метастатическим поражением лимфатических узлов, однако обнаружили корреляцию со степенью дифференцировки. В карциномах G1 инвазия опухоли в сосуды констатирована в 16,1% наблюдений, G2 -23,8%, G3 - 51,4%. Таким образом, более чем в половине низкодифференцированных уротелиальных карцином отмечается врастание в сосуды, что обусловлено, вероятнее всего, способностью этих опухолей вырабатывать значительное количество протеаз, разрушающих базальные мембраны и облегчающих проникновение клеток в сосудистое русло. Этим можно объяснить и значительное число наблюдений с сосудистой инвазией в группе больных с неблагоприятным прогрессирующим течением (72,7%). В группе опухолей с упорно рецидивирующим течением инвазия сосудов обнаружена в 39,2% случаев, в группе с благоприятным прогнозом - 8,9%.

В исследовании Jimenez R.E. at al (2000) рекомендуется указывать не только глубину, но и способ стромальной инвазии. Считается, что опухоль, инфильтрирующая строму «широким фронтом», менее агрессивна, чем «щупальцеобразный» рост. Мы изучили способ стромальной инвазии у пациентов с уротелиальной карциномой стадии Т1. Не выявлено зависимости способа стромальной инвазии от степени дифференцировки опухоли. Также установлено, что способ стромальной инвазии рака достоверно не влияет на прогноз, однако нельзя не отметить тенденцию к некоторому повышению частоты щупальцеобразного роста в третьей прогностической группе.

Кроме формальных морфологических характеристик большое значение имеют индивидуальные молекулярно-генетические свойства опухоли, которые обуславливают ее биологическую агрессивность.

В результате проведенных исследований было выявлено достоверное увеличение пролиферативной активности при снижении степени дифференцировки уротелиальных карцином (G1 - среднее значение PCNA 35,2%, Ki67- 27,5%. G2 - PCNA - 49,4%, Ki67 - 41,9%. G3 -PCNA - 59,3%, Ki67 - 49,4%. коэффициенты корреляции для PCNA и Ki67 0,39 и 0,4 соответственно). Экспрессия маркеров пролиферации не отличалась в опухолях разных стадий. Отмечено повышение пролиферативной активности и в опухолях с наличием сосудистой инвазии (среднее значение PCNA - 50,1%, Ki67 - 42%, в опухолях без инвазии сосудов - PCNA - 38,8%, Ki67 - 30,2%). По нашим данным, в опухолях с благоприятным прогнозом и упорно рецидивирующих пролиферативная активность не отличалась. Следует отметить, что высокая пролиферативная активность отмечалась в части неинвазивных высокодифференцированных уротелиальных карцином, а также в случаях благоприятного прогноза, поэтому, на наш взгляд, маркеры пролиферации не могут являться самостоятельными предикторными факторами.

При изучении факторов апоптоза bcl-2, bcl-х, CD95 не было выявлено каких-либо закономерностей в экспрессии этих маркеров.

Огромное значение онкологи придают изменению функции белка р53 и его влияния на прогноз РМП. Существуют сведения о влиянии р53 на миграционную способность клеток. В эпителиальных клетках р53 способен к подавлению экспрессии Е-кадхерина на поверхности клеток, что ведет к нарушению межклеточных контактов и повышению миграционной способности и инвазии раковых клеток. При исследовании экспрессии мутантного белка р53 выявлена корреляция со степенью дифференцировки опухоли (коэффициент 0,43), стадией заболевания (коэффициент 0,37). (рис. 1) Также отмечено повышение экспрессии р53 в опухолях с наличием сосудистой инвазии и метастазами в лимфатических узлах. Регулируя активность гена VEGF-C, р53 может стимулировать размножение и миграцию лимфатического эндотелия, индуцируя лимфангиогенез в опухоли и регионарных лимфоузлах, способствуя, таким образом, лимфогенному метастазированию. Выявлена корреляция уровня экспрессии р53 с прогнозом заболевания (коэффициент 0,34).

Рис. 1. Экспрессия р53 в РМП. (G1 - G3 - степень дифференцировки; СИ - сосудистая инвазия; N - статус лимфатических узлов; 1гр - 3гр - прогностические группы).

При сопоставлении результатов иммуногистохимического и генетического исследования (секвенирование гена ТР53) было показано отсутствие корреляции между содержанием белка р53 и мутациями его гена. Позитивная иммуногистохимическая реакция может быть обусловлена стрессиндуцированной стабилизацией белка дикого типа, а инактивирующие мутации ТР53 могут уменьшать или не изменять содержание белка.

Белок циклин D1 входит в семейство циклинов, функционально он связан с важными регуляторными белками клетки, такими как р53, р16, Rb и другими. При изучении экспрессии этого белка были получены результаты, сходные с экспрессией р53. Обнаружена значимая корреляция со степенью дифференцировки опухоли (коэффициент 0,49), наличием сосудистой инвазии (коэффициент 0,38) и метастазами в лимфатических узлах. Выявлено повышение экспрессии циклина D1 с увеличением стадии заболевания, однако корреляция не является значимой. Кроме того, отмечено повышение экспрессии циклина D1 в опухолях с метастазами в лимфатических узлах, а также в карциномах с неблагоприятным прогрессирующим течением. (рис. 2) Эти данные подтверждают мнение о циклине D1 как о маркере неблагоприятного прогноза для РМП.

Рис. 2. Экспрессия циклина D1 в РМП.

Значимую роль в канцерогенезе играет ген-супрессор опухолевого роста INK4a, продукт этого гена - белок р16 является ингибитором циклин-Д-зависимых киназ и задерживает клетку в S-фазе. При мутациях гена белок не вырабатывается, что приводит к пролиферации и неконтролируемому делению клеток. Известно, что при раке шейки матки уровень р16 наоборот повышается, это обусловлено участием белка Е7 вируса папилломы человека. РМП является опухолью урогенитальной зоны и в части случаев связан с папилломавирусной инфекцией, поэтому изучение р16 представляет значительный интерес. При анализе экспрессии этого белка не было выявлено статистически значимых различий в зависимости от степени дифференцировки опухоли, стадии заболевания и наличия сосудистой инвазии. Отмечена лишь тенденция к некоторому снижению экспрессии р16 со снижением степени дифференцировки опухоли. Кроме того, уровень экспрессии р16 отличался в опухолях с метастазами в регионарные лимфатические узлы и без метастазов. Средний показатель в группе с метастазами составил 38,1%, в группе без метастазов -19,8%. В отличие от карциномы шейки матки не обнаружена достоверная связь с вирусной инфекцией, было отмечено лишь некоторое повышение его экспрессии в опухолях, содержащих ДНК ВПЧ. ДНК ВПЧ 16 и 18 типов выявлена у 23 из 79 больных (29,1%), при этом не проводилось специального отбора образцов, в которых присутствуют морфологические признаки вирусной инфекции в виде койлоцитоза (при таком отборе число опухолей с ДНК ВПЧ может достигать 50%). В исследованных опухолях чаще выявлялась ДНК ВПЧ 16 типа, причем отмечалась заметная тенденция к преобладанию этого вируса в опухолях с рецидивирующим течением заболевания. ДНК ВПЧ 16 типа обнаружена в 30% карцином с рецидивирующим течением и в 14% - 1 прогностической группы (благоприятный прогноз).

Экспрессия рецепторов эпидермальных факторов роста HER2/neu и EGFR в нашем исследовании не была связана с прогнозом заболевания. Отмечена гиперэкспрессия этих белков лишь в немногочисленных, хотя преимущественно низкодифференцированных карциномах, а также в опухолях с мышечной инвазией и метастазами в лимфатических узлах. Однако нельзя не отметить низкий процент амплификации гена HER2/neu в опухолях с гиперэкспрессией соответствующего белка (амплификация гена обнаружена в 8,7% случаев с HER2-статусом 2+ и в 41,7% с HER2-статусом 3+). При генетическом исследовании установлено, что в карциномах с гиперэкспрессией HER2/neu, имела место полисомия 17 хромосомы, что, по всей видимости, и обусловило гиперпродукцию белка, однако наличие полисомии не является основанием для назначения таргетной терапии.

Не только биология клеток опухоли определяет ее инвазивный и метастатический потенциал, но и изменения в структуре белков межклеточного матрикса. Замена белков типичной соединительной ткани на тенасцин приводит к утрате клетками адгезивных свойств и способствует их миграции и имплантации на отдалении. Доказано, что большое значение для прогноза РМП имеет не столько появление тенасцина, сколько повышение его количества, которое мы определяем по разработанной в отделении методике. Выявлено, что количественное содержание тенасцина достоверно возрастало с понижением степени дифференцировки опухоли, в карциномах с сосудистой инвазией и метастазами в лимфатических узлах. Обнаружено высокое содержание тенасцина в РМП у пациентов третьей прогностической группы (опухоли с прогрессирующим течением). (рис. 3)

Рис. 3. Количественное содержание тенасцина в РМП.

Нормальные белки, входящие в состав БМ и ВКМ, коллаген IV типа и ламинин, активно участвуют в межклеточных взаимодействиях и клеточно-субстратной адгезии. В нашем исследовании выявлено значительное снижение экспрессии ламинина и коллагена в низкодифференцированных карциномах МП. (рис. 4)

Кроме того, обнаружена обратная корреляция со стадией процесса и сосудистой инвазией. Достоверных отличий в выработке этих белков у больных с метастазами и без метастазов в лимфатических узлах выявлено не было, также как и в группах с различными способами стромальной инвазии. Нет оснований считать уровень экспрессии ламинина и коллагена независимым прогностическим фактором, хотя в опухолях третьей прогностической группы было снижено их содержание.

Рис. 4. Экспрессия ламинина и коллагена IV в РМП.

Помимо белков ВКМ важную роль в процессе инвазии и метастазирования играют молекулы адгезии, Е-кадхерин и -катенин, которые обеспечивают прочные межклеточные контакты и препятствуют миграции клеток опухоли за пределы первичного очага. Достоверно снижается экспрессия этих гликопротеидов при повышении степени анаплазии опухоли. Кроме того, сниженное содержание молекул адгезии ассоциировано с наличием сосудистой инвазии и метастазов в лимфатических узлах. (рис. 5) Очевидно, что утрата адгезивных свойств ведет к повышению инвазивной и метастатической активности. Отмечено заметное снижение экспрессии этих гликопротеидов в уротелиальных карциномах третьей прогностической группы, при этом связи с рецидивами РМП мы не обнаружили.

Рис. 5. Экспрессия Е-кадхерина и -катенина в РМП.

Рис. 6. Экспрессия CD44 в РМП.

Опухолевые клетки выделяют металлопротеиназы, которые расщепляют компоненты ВКМ. Особенно увеличивается количество и скорость выделения ММР в зонах инвазивного роста опухоли. Мы изучали не только экспрессию ММР, но и их ингибиторов. Отмечено существенное повышение экспрессии ММР-2 и 9 в низкодифференцированных карциномах в совокупности с понижением уровня TIMP. Подобный характер реакций наблюдался в карциномах с сосудистой инвазией. (рис. 7) Вместе с тем, уровень экспрессии ММР-1 не связан со степенью анаплазии рака, однако отмечено значительное снижение экспрессии этой протеазы в инвазивном РМП (стадии Т2-4). В карциномах с метастазами в лимфатические узлы отмечена повышенная экспрессия ММР-2 и ММР-9 в 79 и 71% случаев соответственно и сниженная экспрессия ингибиторов металлопротеиназ.

Рис. 7. Экспрессия металлоротеиназ и их ингибиторов в РМП.

Прогностическое значение для РМП имели преимущественно ММР-2 и 9, TIMP-1 и TIMP-2. (рис. 8) Мы обнаружили значительное повышение экспрессии ММР-2 и ММР-9 и лишь относительное повышение ММР-1 в опухолях с прогрессирующим характером течения. Вместе с тем, в этой группе отмечается устойчивое снижение экспрессии ингибиторов металлопротеиназ. На наш взгляд, уровень экспрессии ММР-2, ММР-9, TIMP-1 и TIMP-2 может быть независимым фактором прогноза прогрессии и метастазирования РМП.

Рис. 8. Экспрессия металлоротеиназ и их ингибиторов в разных прогностических группах РМП.

При сопоставлении иммуногистохимических факторов была обнаружена корреляция между некоторыми маркерами. Высокая экспрессия циклина D1 сопровождается снижением уровня -катенина, ламинина, коллагена и TIMP, однако сочетается с повышенным уровнем тенасцина и ММР. Стромальная гиперэкспрессия неспецифической молекулы адгезии CD44 коррелирует с повышением уровня тенасцина и ММР и понижением TIMP. (рис. 9)

Рис. 9. Корреляция экспрессии исследуемых маркеров.

прямая (коэкспрессия)

обратная

Кроме состояния ВКМ, уровня протеаз и их ингибиторов, важную роль играет неоангиогенез в опухоли, который во многом определяет ее клиническое поведение и прогноз. Раковые клетки секретируют факторы роста, стимулирующие миграцию эндотелия, пролиферацию и образование капилляров. Степень развития микроциркуляторного русла может влиять на чувствительность опухоли к химиотерапии, определять метастатический потенциал. Наиболее целесообразным представляется изучение не только плотности сосудов, но и уровня экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), являющегося одним из основных факторов ангиогенеза. При изучении плотности сосудов микроциркуляторного русла выявлена значимая корреляция между интенсивностью васкуляризации и степенью дифференцировки опухоли (коэффициент корреляции 0,36). (рис. 10) Отмечено увеличение числа сосудов в карциномах с наличием мышечной инвазии (стадии Т2-3). (рис. 11) Не было обнаружено статистически значимых отличий в зависимости от наличия метастазов в лимфатических узлах.

Рис. 10. Плотность микрососудистого русла в РМП разной степени дифференцировки.

Рис. 11. Плотность микрососудистого русла в РМП различных стадий.

Интересно, что наиболее выраженная экспрессия VEGF отмечена в опухолях со средними значениями плотности васкуляризации (102-150 сосудов на 1ммІ), причем реакция наблюдалась как в паренхиме, так и в строме РМП. Возможно, существуют механизмы регуляции синтеза и выделения эндотелиального фактора роста, действующие по принципу обратной связи. Отмечена тенденция к увеличению плотности сосудов в карциномах с метастазами в лимфатических узлах. Известно, что VEGF принимает участие в образовании новых лимфатических сосудов, способствуя лимфогенному распространению опухоли. Имеются также данные о том, что эндотелиальные клетки вырабатывают металлопротеиназы, которые способствуют их проникновению через базальные мембраны в окружающую строму. При сравнительном анализе ангиогенеза и экспрессии ММР обнаружена прямая корреляция с высоким уровнем содержания ММР1 и ММР9 (коэффициенты корреляции 0,39 и 0,36) и обратная корреляция с уровнем ингибиторов металлопротеиназ TIMP1 и TIMP2 (коэффициенты корреляции 0,4 и 0,41). Гиперэкспрессия металлопротеиназ отмечалась в опухолях с высокой плотностью васкуляризации, однако для ММР2 данные статистически не достоверны. Эти результаты подтверждают, что металлопротеиназам принадлежит важная роль в стимуляции ангиогенеза.

Учитывая гетерогенность морфологического строения некоторых уротелиальных карцином, мы изучали наиболее характерные генетические повреждения в различных участках опухоли и окружающей ткани с использованием предварительной лазерной микродиссекции. Не выявлено генетической гетерогенности РМП. Делеции гена р16 выявлены в 60% случаев, причем в 66,7% из них аналогичное повреждение обнаружено в окружающем нормальном уротелии. Микросателлитная нестабильность локуса 9р выявлена в 6,7% образцов уротелиальной карциномы при отсутствии мутаций в участке нормального эпителия. Делеции гена ТР53 установлены в 53 случаях, в половине из них и в окружающей неизмененной слизистой оболочке. Мутации в 7-м экзоне гена FGFR3 обнаружены в 40% случаев только в клетках опухоли и не обнаружены в нормальном уротелии. Мутации FGFR3 были выявлены как в поверхностном, так и в инвазивном раке.

Было проведено исследование на гистологических срезах с использованием FISH-набора UroVysion. Обнаружены хромосомные аберрации во всех изученных образцах, причем в 80% - сочетание по трем исследуемым хромосомам (3,7 и 17). Делеция гена р16 выявлена в 70% случаев. Для умеренно и низкодифференцированных карцином, а также инвазивных опухолей (Т2-3) была характерна выраженная полиплоидия хромосомы 3, а в высокодифференцированных поверхностных карциномах 3 прогностической группы отмечена выраженная полиплоидия по хромосомам 3 и 7 в сочетании с делецией гена р16.

Выводы

1. Повышение степени анаплазии РМП связано с прогрессирующим течением заболевания, но не с местными рецидивами. Наличие плоскоклеточной или железистой метаплазии выявляется в уротелиальной карциноме G2-3, однако не оказывает прямого влияния на прогноз заболевания, а обусловлено изменением направления дифференцировки опухолевых клеток при нарастании уровня анаплазии. Сосудистая инвазия не повышает частоту лимфогенных метастазов, однако, коррелирует со степенью дифференцировки, рецидивирующим и прогрессирующим течением процесса. Способ стромальной инвазии в карциномах Т1 не имеет прогностической значимости.

2. Маркеры пролиферативной активности PCNA и Ki67 и факторы апоптоза bcl-2, bcl-х, CD95 не могут являться самостоятельными прогностическими факторами. Уровень экспрессии циклина D1 коррелировал со степенью дифференцировки опухоли, стадией, наличием сосудистой инвазии и метастазов в лимфатических узлах. Средний уровень циклина D1 в опухолях с прогрессирующим течением составил 57,4%, а в опухолях с благоприятным прогнозом и рецидивирующим течением не превышал 38%.

3. Белок р53 является самостоятельным фактором прогноза, уровень его экспрессии повышен в опухолях с рецидивирующим и прогрессирующим характером течения (коэффициент корреляции 0,34), кроме того, усиливается его экспрессия в низкодифференцированных и инвазивных карциномах (более 25%), в том числе с наличием сосудистой инвазии, а также в опухолях с метастазами в лимфатических узлах (более 32%).

4. Уровень экспрессии белка р16 не связан со степенью дифференцировки опухоли, стадией заболевания, сосудистой инвазией и статусом лимфатических узлов, нет значимой корреляции и с вирусной инфекцией. Имеется связь ВПЧ 16 типа с рецидивами поверхностной уротелиальной карциномы (ДНК ВПЧ выявлена в 30,2% рецидивирующих опухолей и в 14% карцином с благоприятным прогнозом).

5. Гиперэкспрессия эпидермальных факторов роста HER2/neu и EGFR выявлена в немногочисленных случаях, преимущественно низкодифференцированных карциномах, опухолях с мышечной инвазией и метастазами в лимфатических узлах. Нет прямой связи статуса этих рецепторов с прогнозом РМП. Повышение выработки HER2/neu было обусловлено в большинстве случаев (58,3%) не амплификацией соответствующего гена, а полисомией 17 хромосомы.

6. Количественное содержание антиадгезивного гликопротеида - тенасцина значительно возрастает с понижением степени дифференцировки опухоли, началом инфильтративного роста, в карциномах с сосудистой инвазией и метастазами в лимфатических узлах. При этом отмечается значительное снижение экспрессии нормальных компонентов ВКМ, ламинина и коллагена. Более чем в два раза повышается содержание тенасцина в РМП у пациентов с прогрессирующим течением заболевания (в среднем 46,3%).

7. Происходит заметное снижение экспрессии молекул адгезии, Е-кадхерина и -катенина в уротелиальных карциномах с прогрессирующим течением, наличием метастазов в лимфатических узлах и сосудистой инвазией, однако нет связи с рецидивами РМП. В низкодифференцированных карциномах выявляется не только значительное увеличение экспрессии CD44, но и перераспределение белка из клеток в строму опухоли (коэффициент корреляции 0,39). Выявлено также значительное увеличение стромальной экспрессии CD44 в опухолях с наличием сосудистой инвазии (61,6%) и метастазами в лимфоузлах (75%).

8. Уровень экспрессии металлопротеиназ и их ингибиторов может быть независимым фактором прогноза прогрессии и метастазирования РМП. В опухолях с прогрессирующим характером течения выявлено значительное повышение основных факторов инвазии - ММР-2 и ММР-9 (гиперэкспрессия обнаружена в 75,1 и 88% опухолей соответственно) и устойчивое снижение экспрессии TIMP-1 и TIMP-2. Аналогичное распределение выявлено в низкодифференцированных карциномах, опухолях с метастазами в лимфатические узлы и наличием сосудистой инвазии.

9. Интенсивность васкуляризации достоверно связана со степенью дифференцировки опухоли (коэффициент корреляции 0,36). Не обнаружено статистически значимых отличий в зависимости от стадии процесса и наличия метастазов в лимфатических узлах, однако по сравнению с поверхностными карциномами отмечено увеличение числа сосудов с появлением мышечной инвазии (стадии Т2-4). Имеется прямая корреляция неоангиогенеза с высоким уровнем содержания ММР1 и ММР9 (коэффициенты 0,39 и 0,36) и обратная корреляция с уровнем TIMP1 и TIMP2 (коэффициенты -0,4 и -0,41). Эти данные свидетельствуют о том, что эндотелиальные клетки вырабатывают металлопротеиназы, которые способствуют их проникновению через базальные мембраны в окружающую строму.

10. В уротелиальных карциномах разной степени дифференцировки и стадий обнаружены сходные молекулярно-генетические нарушения ДНК. Выявленные делеции генов р16 и ТР53 более чем в половине случаев сочетаются с аналогичными повреждениями в морфологически нормальном уротелии, что свидетельствует о более ранних поломках в геноме клеток. Мутации FGFR3 выявлены как в поверхностном, так и в инвазивном раке МП.