Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Биохимические механизмы повреждения мужской репродуктивной системы при действии полихлорированных бифенилов и фармакологическая коррекция выявленных нарушений (экспериментальное исследование)

03.01.04 - биохимия

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Аглетдинов Эдуард Феликсович

Уфа - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук, профессор Камилов Феликс Хусаинович

Заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук, профессор Алехин Евгений Константинович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, Терентьев Александр Александрович

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Гильмиярова Фрида Насыровна

доктор медицинских наук, профессор Юшков Владимир Викторович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится на заседании диссертационного совета Д 208.006.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Ученый секретарь диссертационного совета Мирсаева Г.Х.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Демографическая ситуация в России, несмотря на некоторую стабилизацию, наметившуюся в последние годы, продолжает оставаться неблагоприятной. Сохраняющиеся негативные тенденции представляют угрозу интеллектуальному, трудовому, культурному и оборонному потенциалу страны.

Доля семей на территории РФ, неспособных иметь детей составляет 15-19%, тогда как критическим уровнем считается 15%, при котором бесплодие следует рассматривать в качестве фактора, значительно влияющего на демографические показатели в стране (ВОЗ, 1999; Артифексов С.Б. и др., 2003). Основой государственной стратегии преодоления демографического кризиса является Концепция демографической политики Российской Федерации до 2025 года, в которой вопросам сохранения и восстановления репродуктивного здоровья мужчин впервые отведено особое внимание [Указ Президента РФ № 1351 от 9 октября 2007]. Удельный вес «мужского фактора» в семейном бесплодии за последние годы изменился с 30% до 50% и продолжает расти [Пшеничникова Т.Я., 1991; Селезнева И.Ю., 1999; Леонов Б.В., 2000; Тер-Аванесов Г.В., 2004; Кулаков В.И., 2005; Sigman M., 2009]. По данным научного Центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова РАМН, частота нарушений репродуктивной функции мужчин в структуре бесплодного брака составляет 47,2% [Тер-Аванесов Г.В., 2005].

Зарубежные исследования также выявили увеличение частоты рака яичек, простаты, молочной железы, врожденных пороков развития мужской половой системы и снижение фертильности мужчин за последние десятилетия. Скорость падения концентрации сперматозоидов в сперме здоровых мужчин составляет около 2% в год - со 113 млн/мл в 1940г. до 66 млн/мл в 1990г. [Carlsen E. et al., 1992; Auger J. et al., 1995]. Похожие результаты получены при обследовании мужчин Великобритании, Греции, Италии, Германии, Бельгии, Канады и др. [Waeleghem K. et. al., 1996; Pajarinen J. et. al., 1997; Никитин А.И., 2005]. За этот же период произошли беспрецедентные в медицинской теории и практике изменения общепринятых минимальных стандартов фертильной концентрации сперматозоидов - с 60 млн/мл до 40, а затем и до 20 млн/мл.

Причины, которые ведут к ухудшению качества спермы, недостаточно ясны, однако, ряд исследователей подчеркивает, что описанные тенденции характерны для промышленно развитых стран Европы и Америки и, в меньшей степени, для стран Азии и Африки [Menkveld R. et al., 1997; Swan Sh. et al. 2003]. Все это послужило основанием для выдвижения гипотезы о поражении мужской репродуктивной системы химическими факторами окружающей среды [Swan S. et al., 1997, 2000, 2003; Hauser R. et al., 2002; Comhaire F. et al., 2007]. В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что абсолютное большинство экотоксикантов появилось именно в середине прошлого века и имеет искусственное происхождение [Майстренко В.Н., 2004]. В настоящее время в литературе имеются сведения о влиянии различных промышленных химических соединений на функцию гонад. Наибольшую опасность среди прочих ксенобиотиков представляют полихлорированные бифенилы (ПХБ), обладающие чрезвычайно высокой физико-химической стабильностью и устойчивостью к биологической деградации [Юфит С.С., 2002; Norstrom R., 2003]. Всего в мировых масштабах было произведено от 1 до 2 млн. тонн этих соединений [Майстренко, 2004]. По данным ВОЗ, в организм человека, не имеющего профессионального контакта с этими соединениями, поступает от 5 до 100 мкг ПХБ в сутки [Толстопятова Г.В., Коркач В.И., 1982].

ПХБ в низких концентрациях вызывают серьезные нарушения нервной, иммунной, гормональной и др. систем, обладают канцерогенным и мутагенным эффектами [Bessmann A., 1981; Cooke P.S. et al., 1996; Hauser R, Altshul L., 2002; Lee Y.W., Park H.J., 2003; Sripada S. et al., 2007]. Полихлорбифенилы способны индуцировать в организме процессы свободнорадикального окисления [Safe S., 1995; McLean M.R. et al., 2000; Twarovski T.P. et al., 2001; Supriyo De et al., 2004; Murugesan P. et al., 2007]. Известно, что окислительный стресс, развивающийся в тканях репродуктивной системы, является одним из важных патогенетических факторов снижения мужской фертильности [Agarwal A., 2006; Aitken 2007; Артифексов С.Б. и др., 2008; Божедомов В.А. и др., 2009; Громенко и др., 2009].

Некоторые исследования показали, что отравление ПХБ приводит к угнетению продукции половых гормонов, ухудшению количественных и качественных параметров спермы [Faqi A.S. et al., 1998; Safe S., 2000; Камилов Ф.Х. и др., 2000, 2003, 2005, 2009; Murugesan P. et al., 2005; Хабиров Р.Э., 2003, 2004; Галимов Ш.Н. и др., 2005, 2006; Галимова Э.Ф., 2005, 2006; Громенко Д.С. и др., 2007; Макашева Л.О., 2008; Булыгин К.В. и др., 2008, 2009].

В то же время, имеющиеся в литературе сведения о влиянии ПХБ на мужскую половую систему крайне неоднозначны, весьма противоречивы и требуют дальнейшего изучения [Barone M.A. t al., 1991; De Guise S. et al., 1995; Rozati R. et al., 2002; Colborn T., 2004; Acharya U.R. et al., 2006, Arunakaran J. et al., 2010]. Между тем, без углубленного исследования механизмов повреждения бифенилами мужской репродуктивной системы невозможна разработка эффективных патогенетически обоснованных принципов фармакологической коррекции нарушений фертильности, обусловленных экополлютантами.

Целью настоящей работы являлось выявление биохимических механизмов влияния полихлорированных бифенилов на мужскую репродуктивную систему и способов фармакологической коррекции установленных сдвигов в условиях эксперимента.

Задачи исследования:

1. Изучить действие различных доз промышленной смеси полихлорированных бифенилов «Совол» на сывороточные концентрации основных гормонов, регулирующих репродуктивную функцию.

2. Охарактеризовать действие поллютанта в различных дозах и длительности перорального введения на метаболический и морфофункциональный статус семенников.

3. Определить уровни биохимических маркеров функционального состояния акцессорных половых органов экспериментальных животных, подвергшихся субхроническому отравлению ксенобиотиком.

4. Выполнить исследование оплодотворяющей способности крыс-самцов in vivo, подвергшихся отравлению токсикантом в различных дозах, биохимических параметров и морфо-функциональных свойств нативного физиологического эякулята in vitro при интоксикации бифенилами.

5. Охарактеризовать интенсивность прооксидативных процессов и состояние неферментного и энзиматического звеньев физиологической антиоксидантной защиты тканей репродуктивных органов и печени самцов крыс, подвергшихся длительному воздействию полихлорбифенилов.

6. Дать сравнительную оценку эффективности использования фармакологических препаратов с антиоксидантным действием с целью коррекции ПХБ-индуцированных сдвигов оксидантного баланса в семенниках, эякуляте и печени самцов крыс.

7. Исследовать влияние комбинированного применения фармакологических препаратов на состояние основных показателей метаболического и морфофункционального статуса репродуктивной системы самцов крыс на фоне длительного воздействия полихлорированных бифенилов.

Научная новизна.

Впервые показано, что экспозиция крыс ПХБ в низких концентрациях приводит в тестикулах к дозозависимому усилению липопероксидации, уменьшению общей антиокислительной активности, истощению пула неферментных водо- и жирорастворимых антиоксидантов, подавлению активностей ферментов физиологической антиокислительной защиты, угнетению биосинтеза белков, снижению уровня НАДФН, интенсивности апотомического окисления глюкозы и активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, развитию гипоэнергетического состояния, падению концентрации АТФ и скорости окисления НАД- и ФАД-зависимых энергетических субстратов.

Впервые охарактеризовано динамическое состояние системы глутатиона в тканях репродуктивных органов под действием совола: показано дозо- и хронозависимое снижение под действием ПХБ уровня глутатиона восстановленного, свободных сульфгидрильных групп, фазовые изменения активностей глутатионзависимых ферментов детоксикации (глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы), обмена и рециклирования глутатиона (глутатионредуктазы и г-глутамилтрансферазы) и особенности взаимосвязи системы глутатиона с другими ферментативными (супероксиддисмутаза, каталаза) и неферментными (б-токоферол, аскорбат) антиоксидантами при интоксикации бифенилами.

Впервые установлено, что продолжительное воздействие совола вызывает нарушения метаболического статуса сперматозоидов, выделенных из эякулята: в лизате сперматозоидов обнаружено увеличение содержания мочевой кислоты, уменьшение концентрации общего белка, альбумина, фруктозы, глюкозы, снижение активностей аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы.

Впервые выявлено существенное снижение метаболической активности акцессорных половых желез, участвующих в формировании эякулята: в тканях семенных пузырьков, эпидидимиса и вентральной простаты отравленных животных зафиксировано снижение уровня фруктозы, активностей нейтральной гликозидазы и кислой фосфатазы.

Показана относительная сохранность и функциональная способность к адаптационным сдвигам неферментативного и энзиматического звеньев антиоксидантной системы печени крыс. Обнаружены динамические сдвиги оксидантного статуса тканей репродуктивных органов и печени животных на фоне поступления поллютанта: выявлено снижение общей антиоксидантной активности и возрастание концентрации продуктов пероксидации в зависимости от дозы и длительности воздействия ксенобиотика.

Продемонстрировано негативное влияние полихлорированных бифенилов на репродуктивный потенциал экспериментальных животных - снижение оплодотворяющей способности самцов крыс и численности их потомства, полученного при спаривании с интактными самками.

Впервые показано, что длительная интоксикация промышленной смесью ПХБ «Совол» в низких концентрациях приводит к поражению тестикулярной ткани самцов экспериментальных животных. Об этом свидетельствует дозозависимое уменьшение при действии бифенилов содержания сперматогоний, сперматоцитов, ранних и поздних сперматид, сперматозоидов в тестикулах экспонированных самцов.

Впервые выявлено снижение количества клеток Сертоли и интерстициальных клеток Лейдига в яичках, сопровождающееся падением сывороточных и тестикулярных концентраций ингибина и активина, уровней тестостерона и эстрадиола в крови отравленных крыс. Установлено, что длительное воздействие полихлорбифенилов (1,5-2,0 мес.) приводит к заметному уменьшению общей концентрации сперматозоидов в эякуляте крыс. Кратковременное поступление токсиканта вызывает ухудшение способности половых гамет к активному поступательному движению, существенное увеличение долей половых клеток с колебательными движениями и неподвижных спермиев в эякуляте.

Показано, что при интоксикации низкими концентрациями ПХБ у самцов крыс наблюдается падение сывороточных концентраций трийодтиронина и тироксина на фоне одновременного уменьшения плазменного содержания тиреотропного гормона. Уровни лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гонадотропинов в крови самцов, подвергшихся длительному воздействию больших доз бифенилов, снижаются.

Впервые экспериментально апробированы новые подходы к коррекции выявленных нарушений. Установлено, что использование препаратов антиоксидантного действия оказывает существенное влияние на соотношение прооксидантных процессов и антиоксидантной активности в тканях печени, семенников и эякуляте крыс, подвергшихся отравлению соволом. Полученные данные также указывают на центральную роль развития окислительного стресса в патохимических механизмах репротоксического действия полихлорбифенилов.

Впервые показано, что применение оксиметилурацила, а также витаминно-минерального комплекса «Селмевит», оказывает защитное действие на метаболический статус тканей животных при субхронической интоксикации соволом. Под влиянием иммурега и селмевита в органах мужской репродуктивной системы и в печени крыс, подвергнутых воздействию полихлорированными бифенилами, снижается интенсивность свободнорадикального окисления и стимулируется антиокислительная защита, восстанавливается функциональная активность ферментативного звена антиоксидантной системы, нормализуется уровень основных водо- и жирорастворимых антиоксидантов.

Впервые продемонстрировано, что комбинированное применение селмевита и иммурега на фоне длительной интоксикации полихлорбифенилами способствует восстановлению большинства параметров энергетического, углеводного, белкового видов обмена веществ, оксидантного баланса в тканях репродуктивных органов крыс-самцов и их фертильности при спаривании с интактными самками.

Полученные данные определяют возможные способы рациональной патогенетически обоснованной фармакологической коррекции экологически обусловленных субфертильных состояний.

Научная и практическая значимость.

Полученные данные существенно расширяют и уточняют имеющиеся представления о биохимических механизмах репротоксического действия стойких органических загрязнителей класса хлорбифенилов. Разработка механизмов развития окислительного стресса при интоксикации диоксино-подобными экотоксикантами позволяет наметить пути фармакологической коррекции метаболических и структурно-функциональных нарушений мужской репродуктивной системы, вызванных отравлением стойкими органическими загрязнителями.

Установлен ведущий патогенетический механизм действия полихлорированных бифенилов, заключающийся в развитии окислительного стресса в тканях семенников, акцессорных половых органов, эякуляте и печени экспериментальных животных.

Выявленные особенности эндокринного статуса, результаты биохимического и морфометрического исследования тестикулярной ткани и спермы экспериментальных животных указывают на многоуровневый характер токсического действия бифенилов и предопределяют направления дальнейших исследований.

Показано корригирующее влияние экзогенного введения препаратов с антиоксидантным механизмом действия на основные показатели оксидантного статуса тканей на фоне отравления бифенилами. Уточнены некоторые биохимические механизмы репропротекторного действия селмевита и иммурега при субхронической интоксикации соволом. Результаты экспериментального исследования позволяют рекомендовать применение при интоксикации ксенобиотиками препаратов с антиоксидантной активностью в качестве средств, улучшающих тканевой метаболизм и функциональное состояние органов репродуктивной системы и печени. полихлорированный гормон репродуктивный

Экспериментально обоснована необходимость периодического контроля функционального состояния половой системы и печени у мужчин, имеющих профессиональный контакт с полихлорбифенилами, а также проживающих на экологически дестабилизированных территориях, с целью ранней диагностики интоксикации, определения степени ее тяжести и своевременного предупреждения развития субфертильного состояния.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Репротоксическое действие полихлорированных бифенилов на мужской организм реализуется на различных уровнях организации половой системы. Снижение сывороточных концентраций гонадотропных гормонов, тиреотропина и отсутствие адекватной реакции гипофиза на снижение уровней в крови тестостерона, ингибина В, активина А, трийодтиронина, тироксина при отравлении соволом указывает на претестикулярный уровень нарушения функции самовоспроизведения и ее регуляции.

2. Пероральное поступление поллютанта приводит к поражению тестикулярной ткани - нарушению белкового, энергетического, углеводного видов обмена веществ, уменьшению количества сперматогоний, сперматоцитов, сперматид, сперматозоидов, клеток Лейдига, клеток Сертоли и угасанию сперматогенной и стероидогенной функций яичек.

3. Проявлением посттестикулярной токсичности полихлорбифенилов является ухудшение биохимического статуса и функциональной активности акцессорных органов мужской половой системы, а также сперматозоидов, полученных из эякулята крыс, подвергшихся кратковременному воздействию соволом в низких дозах.

4. Интоксикация полихлорбифенилами вызывает в тканях репродуктивных органов, эякуляте и печени самцов крыс накопление продуктов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков, изменения уровней глутатиона, свободных сульфгидрильных групп, аскорбиновой кислоты, токоферола и активностей ферментов физиологической антиоксидантной защиты. Их направленность и выраженность определяются интенсивностью и продолжительностью перорального введения токсиканта.

5. Использование препаратов антиоксидантного действия в целях патогенетической коррекции при отравлении самцов животных полихлорированными бифенилами способствует нормализации метаболического статуса семенников, спермы и печени.

6. Одновременное применение витаминно-минерального комплекса «Селмевит» и препарата «Иммурег» на фоне продолжающегося воздействия ксенобиотика более эффективно препятствует развитию эндокринотоксических и репротоксических эффектов ПХБ и способствует нормализации функции мужской репродуктивной системы экспериментальных животных

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедрах биологической и биоорганической химии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии, фармакологии №2, мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф, урологии с курсом ИПО ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Росздрава, кафедре биохимии ГОУ ВПО Ижевская государственная медицинская академия Росздрава, кафедре биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической и лабораторной диагностики последипломного образования ГОУ ВПО Омская государственная медицинская академия Росздрава, кафедре биохимии с курсом физколлоидной и токсикологической химии ГОУ ВПО Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава, кафедре биохимии ГОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия, кафедре биохимии ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Росздрава.

Апробация результатов работы. Результаты исследований были представлены и обсуждены на VII конференции Российской ассоциации репродукции человека «Лечение бесплодия: нерешенные проблемы» (Саратов, 2001); III Съезде Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); Российской конференции «Национальный план действий по экологически обоснованному управлению диоксинами/фуранами и диоксиноподобными веществами» (Санкт-Петербург, 2002); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы охраны репродуктивного здоровья в медицине труда» (Самара, 2002); 1-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Влияние загрязнения окружающей среды на здоровье человека» (Новосибирск, 2002); Российском научном форуме «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2003, 2004, 2008); International Ecologic Forum "Environment and Human Health» (St.Petersburg, 2003); межрегиональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов - до внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003); Международном конгрессе «Профилактика нарушений репродуктивного здоровья от профессиональных и экологических факторов риска» (Волгоград, 2004); Всероссийской конференции с международным участием «Биологические аспекты экологии человека» (Архангельск, 2004); ІV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Всероссийской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения профессора Р.И. Лифшица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009); 7-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2010); совместном заседании кафедр биологической и биоорганической химии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии с участием сотрудников кафедр фармакологии №2, общей гигиены с экологией с курсом гигиенических дисциплин медико-профилактического факультета, патологической физиологии, мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф, клинической лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Росздрава (Уфа, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, из них 13 - в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 304 страницах печатного текста, содержит 27 рисунков, 34 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав результатов исследований, заключения, выводов и списка литературы, который включает 354 иностранных и 127 отечественных источников.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены на 1250 белых беспородных крысах-самцах половозрелого возраста (3 мес.) массой 180-220 г. Животные содержались в виварии при 12-часовом цикле день/ночь в условиях постоянной температуры и влажности на стандартной диете. Эксперименты выполнены в соответствии с требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., №267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., регламента Европейской Конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению, уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации.

Интоксикацию вызывали воздействием отечественной смеси ПХБ «Совол», включающей 26% тетра-, 64,6% пента-, 9% гексахлорбифенилов и следовые количества гептахлорбифенилов. Учитывая, что ведущим путем поступления полихлорбифенилов в организм человека и животных считается пероральный, экспериментальную интоксикацию вызывали внутрижелудочным введением совола в составе оливкового масла один раз в сутки с помощью специального металлического зонда.

Все животные были разделены на 6 групп. Самцы 2-й и 5-й групп подвергались воздействию совола в ежесуточной дозе 5 мг·кг^-1 веса тела в течение 30-и и 60-и дней соответственно. Крысы 3-й и 6-й групп получали поллютант в количестве 10 мг·сут·кг^-1 на протяжении 30-и и 60-и дней соответственно. Таким образом, суммарная токсическая экспозиция крыс 5-й и 6-й групп составляла 0,05 ЛД₅₀ (300 мг·кг^-1) и 0,1 ЛД₅₀ (600 мг·кг^-1), установленных для совола. Крысам контрольных групп (группы 1 и 4) вводили оливковое масло в тех же объемах - по 1,0 мл в течение 30 и 60 дней соответственно. В отдельных сериях экспериментов моделировали подострое отравление крыс (28 суток), при котором суммарная токсическая экспозиция крыс групп составляла 0,05 ЛД₅₀ и 0,1 ЛД₅₀.

Животных умерщвляли под легким эфирным наркозом путем декапитации - группы 2 и 5 на 30-й день, группы 3 и 6 на 60-й день эксперимента. Собирали кровь, извлекали для исследования семенники, эпидидимис, семенные пузырьки, вентральную простату, печень.

Эксперименты по изучению эффективности применения фармакологических препаратов с целью патогенетической коррекции токсических эффектов полихлорбифенилов выполнялись в два этапа. На первом осуществлялась предварительная оценка влияния препаратов «Триовит», «Селмевит», «Иммурег» на антиоксидантный статус печени, семенников и эякулята крыс на фоне подострой интоксикации полихлорированными бифенилами (28 дней в дозе 10 мг·сут·кг^-1). Препараты вводили перорально с помощью специального зонда, начиная с 14-го дня подострой интоксикации. При выборе лечебных доз руководствовались подходами, описанными в литературе [Мышкин С.А., 2000; Бышевский А.Ш., 2006;] и общепринятой схемой использования фармакологических препаратов в пересчете на крыс [Гуськова Т.А., 1990]. Забой животных всех групп осуществляли на 28-й день.

На втором этапе была использована модель субхронической интоксикации соволом (60 дней по 10 мг·сут·кг-1). В этой серии экспериментов применяли «Селмевит», «Иммурег» и их комбинацию. Препараты вводили в тех же дозах, начиная с 30 дня экспериментального отравления. Группа 1 (контроль) получала оливковое масло, группа 2 - совол, группы 3, 4, 5, помимо токсиканта - селмевит, иммурег, комбинацию селмевит+иммурег, соответственно. Эвтаназию животных осуществляли на 60-й день экспериментального отравления.

В сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) содержание тестостерона, эстрадиола, лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) трийодтиронина (Т₃), тироксина (Т₄), тиреотропного гормона (ТТГ) с использованием стандартных тест-систем производства «DRG Diagnostics» (Германия). Тестикулярные и сывороточные концентрации ингибина В и активина А определяли с применением тест-систем производства фирмы DSL (США).

В тканях акцессорных органов исследовали содержание фруктозы [Mann Т., 1954], активности кислой фосфатазы (ЕС 3.1.3.2) [Paquin R., 1984] и нейтральной гликозидазы (ЕС 3.2.1.20) с помощью набора производства FertiPro N.V., (Belgium).

В эякуляте и гомогенатах тканей определяли содержание глутатиона восстановленного (ГВ) [Гаврилова А.Н., 1986; Карпищенко А.И., 1997], свободных сульфгидрильных групп (ССГ) [Bellomo G., 1990], аскорбата [Omaye S.T. et al., 1979], токоферола [Desai I.D., 1984], активности глутатионпероксидазы (ГПО) (EC 1.11.1.9, GPx) [Rotruck J.T., 1973; Гаврилова А.Н., 1986], глутатионредуктазы (ГР) (EC 1.6.4.2, GR) [Carlberg I. & Mannervik B. 1985], глутатион-S-трансферазы (ГТ) (EC 2.5.1.1.8, GST) [Habig W.H., 1974], г-глутамилтрансферазы (ГГТ) (EC 2.3.2.2, г-GT) [Orlowski M. & Meister A., 1965], каталазы (EC 1.11.1.6, CAT) [Королюк М.А., 1988], супероксиддисмутазы (СОД) (EC 1.15.1.1, SOD) [Murklund S. & Marklund G., 1974].

Концентрацию соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП), и общую антиокислительную активность (ОАА) изучали с использованием диагностических наборов производства ООО «Агат-Мед» (Россия) и по Клебанову Г.И. (1988), соответственно. Содержание окисленных белковых производных определяли спектрофотометрическим методом, предложенным Дубининой Е.Е. (1995).

В лизате сперматозоидов определяли содержание общего белка биуретовым методом, альбумина с использованием бромкрезолового зеленого, мочевой кислоты энзиматическим кoлориметрическим методом с уриказой и пероксидазой, фруктозы по Mann Т. (1954), глюкозы глюкозооксидантным методом, активности щелочной фосфатазы (ЕС 3.1.3.1) (ЩФ) с помощью п-нитрофенилфосфата, аспартатаминотрансферазы (ЕС 2.6.1.1) (АсТ), аланинаминотрансферазы (ЕС 3.6.1.2) (АлТ), лактатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.27) (ЛДГ) кинетическими УФ-методами.

В тканях исследовали содержание АТФ [Lamprecht W., Trautschold I., 1965], окислительный метаболизм 1,4-¹⁴С-сукцината, 1,2-¹⁴С--кетоглутарата и 2-¹⁴С-пирувата - по выделению ¹⁴СО₂, содержание НАДФН, интенсивность биосинтеза белка по скорости включения [2-¹⁴С]-гистидина и [2-¹⁴С]-аланина в состав суммарных белков гомогенатов тканей, активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (ЕС 1.1.1.49) (Г-6-Ф ДГ) [Прохорова М.И., 1982], общего белка [Lowry O., 1951].

При морфометрическом исследовании тестикулярной ткани проводили подсчет сперматогоний, сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов [Рыжаков Д. И. и др., 1980; Косюга Ю.И. и др., 1994; Шевантаева О.Н. и др., 1995].

Эякулят у самцов крыс получали путем трансректальной электростимуляции семенного бугорка через слизистую прямой кишки [Рыжаков Д.И., Молодюк А.В., Артифексов С.Б, 1980].

Оценку оплодотворяющей способности проводили по стандартной методике in vivo. Для этого самцов, подвергшихся интоксикации, помещали в одну клетку с интактными самками в (1 самец : 2 самки). Через неделю самок отсаживали. После родоразрешения производили подсчет потомства.

Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета Statistica 6.0 фирмы StatSoft. В группах выборки оценивали следующие параметры: значения медианы, нижний и верхний квартили. Для оценки достоверности различий использовали непараметрический критерий (U) Манна-Уитни с поправкой Бонферонни. Корреляционный анализ полученных в эксперименте данных проводили по Спирмену.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Влияние полихлорированных бифенилов на мужскую репродуктивную систему экспериментальных животных. При оценке гормонального статуса экспериментальных животных обнаружено достоверное снижение сывороточной концентрации тестостерона уже при непродолжительном действии малых доз полихлорбифенилов (5 мг·сут·кг^-1) до 54,3% от показателей интактных самцов, усиливающееся с увеличением дозы и длительности интоксикации (рис. 1).

Рисунок 1. Концентрации гормонов в сыворотке крови самцов крыс на 30-й и 60-й дни отравления соволом в различных дозах (% от контроля)

Плазменное содержание стимулирующего андрогенопоэз лютеинизирующего гормона при этом отнюдь не увеличивалось, а, либо не отличалось от уровня контроля при экспозиции меньшими дозами ксенобиотика, либо заметно уменьшалось в условиях большей интенсивности и длительности интоксикации. Аналогичные результаты были получены при определении сывороточной концентрации другого гипофизарного гонадотропина - ФСГ, контролирующего сперматогенез. Об эндокринотоксичности ПХБ на гипофизарном уровне также свидетельствуют результаты определения ТТГ в крови крыс, содержание которого также снижалось на фоне резкого падения уровня тиреоидных гормонов. Концентрация в крови крыс эстрадиола, образующегося в мужском организме преимущественно в результате внетестикулярного метаболизма тестостерона, также значительно уменьшалась, однако лишь к окончанию экспериментальной интоксикации полихлорбифенилами - до 61,4-70%.

В отдельной серии экспериментов нами было выполнено динамическое изучение количественных и качественных параметров спермы крыс на фоне отравления полихлорбифенилами в различных дозах. Для этого у интактных половозрелых самцов методом трансректальной электростимуляции был получен эякулят и выполнено исследование исходного уровня показателей спермограммы (0 день). Затем животные были разделены на две равные группы, которым ежедневно вводили совол в дозе 5 мг·кг^-1 (группа 1) и 10 мг·кг^-1 (группа 2). На 15-е, 30-е, 45-е, 60-е сутки наблюдения на фоне продолжающейся интоксикации у животных указанным способом получали и исследовали эякулят. Согласно полученным данным у животных обеих групп зафиксировано последовательное ухудшение основных параметров спермограммы (таблица 1). Зарегистрированное уменьшение общего содержания половых клеток в сперме крыс обеих групп достигало уровня статистически значимых отличий на 45-е и 60-е сутки воздействия ксенобиотика. Общая концентрация сперматозоидов в эякуляте крыс группы 1 к 45-му дню составила 77,3%, а у самцов группы 2 - 65,5% от исходного уровня. На 60-й день экспериментальной интоксикации ПХБ падение общего содержания гамет в сперме этих животных продолжилось и составило 67,1% и 54,0% от исходного уровня, соответственно.

Более ранние нарушения в структуре спермограммы выявлены при оценке функциональных свойств сперматозоидов. Уже на 15-й день отравления поллютантом в меньшей дозе (5 мг·сут·кг^-1) доля спермиев с поступательным характером движения достоверно снижалась на 14,5% - за счет увеличения относительного содержания малоподвижных клеток на 17,3% и неподвижных гамет на 68,3%. Однонаправленные, но более выраженные сдвиги были зарегистрированы в эякуляте крыс, получавших бульшую дозу токсиканта. К окончанию срока наблюдения (60 дней) у самцов этой группы сперматозоиды с поступательной двигательной активностью отсутствовали, а доля неподвижных половых гамет достигала 43,2%, тогда как относительное содержание последних в сперме данных животных до начала введения совола не превышала 3,0%.

Специальная серия экспериментов была посвящена изучению некоторых параметров фертильности самцов крыс, подвергнутых отравлению полихлорированными бифенилами при их спаривании с интактными самками.

Таблица 1 - Концентрация и двигательная активность сперматозоидов в эякуляте крыс, подвергшихся воздействию соволом в дозе 5 мг·сут·кг^-1

Доля самок, принесших приплод после спаривания с самцами, получавшими по 5 мг·сут·кг^-1 смеси ПХБ в течение 30 и 60-и дней снизилась на 20% и 30% от группы контроля, соответственно (рис. 2). Увеличение дозы совола приводило к более выраженным нарушениям мужской фертильности. При спаривании с самцами групп 3 и 6 потомство было получено лишь у шести и двух из десяти самок, соответственно. Наблюдалось значительное уменьшение (на 26-65% от контроля) количества новорожденных крысят в одном помете.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии у полихлорбифенилов выраженных антиандрогенных и спермотоксических свойств. Направленность и динамика обнаруженных сдвигов отдельных параметров репродуктивного статуса экспериментальных животных позволяет предположить, что механизмы репротоксичности бифенилов реализуются на различных уровнях оси гипофиз-гонады, а также на эякуляторном уровне. На это указывает, с одной стороны - развитие гипоандрогенного состояния, уменьшение общей концентрации спермиев через 1,5-2 мес. наблюдения, отсутствие адекватной реакции на эти сдвиги со стороны гипофиза; с другой - ухудшение двигательной активности гамет, обнаруженное уже в ранние сроки интоксикации.

Формирование сперматозоидов происходит в яичках из первичных половых клеток и состоит из последовательных фаз пролиферации сперматогоний, мейоза и спермиогенеза. Поэтому на следующем этапе выяснения механизмов репротоксичности ПХБ в условиях субхронической интоксикации соволом было проведено исследование важнейших морфо-функциональных и биохимических параметров тестикулярной ткани.

Рисунок 2. Параметры репродуктивного статуса самцов крыс, подвергшихся воздействию совола в различных дозах (% от контроля)

Отравление в течение 60 суток позволяет оценить влияние токсиканта на все этапы сперматогенеза, продолжительность которого у крыс составляет около 40 дней. Для морфологического исследования использовали левый семенник крыс, подвергшихся интоксикации соволом в суточных дозах 5 и 10 мг·кг^-1 массы животного. Забой животных осуществляли с периодичностью в 30 дней. В приготовленных из тестикулярной ткани мазках осуществляли подсчет количества отдельных клеток гаметогенеза: сперматогоний, сперматоцитов, ранних и поздних сперматид, сперматозоидов. Воздействие токсиканта в меньшей суточной дозе (5 мг·кг^-1) в течение 30 дней не оказывало заметного влияния на изучаемые параметры за исключением сперматоцитов, количество которых достоверно снижалось на 18,7% по сравнению с контролем (рис. 3).

Возможно, фаза активного деления является наиболее чувствительной к токсическому действию поллютанта, образование сперматоцитов происходит в результате нескольких митотических делений и морфофункциональной перестройки родоначальных клеток гаметогенеза. С увеличением длительности введения ксенобиотика наблюдается снижение количественного содержания сперматогоний, клеток дальнейших этапов формирования спермиев и собственно сперматозоидов. Наиболее выраженные сдвиги зафиксированы у животных, получавших бульшую суточную дозу токсиканта (10 мг·кг^-1). Полученные данные указывают на глубокое поражение сперматогенеза, а наиболее чувствительными, вероятно, являются этапы ранней дифференцировки половых клеток.

Эндокринная функция яичек выполняется клетками интерстициальной ткани Лейдига, являющимися главными продуцентами мужских половых стероидов [Нишлаг Э., 2005]. Анализ мазков тестикулярной ткани выявил достоверное трехкратное падение содержания эндокриноцитов к концу экспериментального отравления соволом в максимальной дозе, что, очевидно, является непосредственной причиной развития ПХБ-индуцированной андрогенной недостаточности.

Рисунок 3. Клеточный состав тестикулярной ткани крыс, подвергшихся воздействию соволом в дозах 5 и 10 мг·сут·кг^-1 (% от контроля)

Большая часть (60-80%) объема яичек образована семенными канальцами, выстланными сустентоцитами - клетками Сертоли, обеспечивающими нормальное развитие сперматогенных клеток и выполняющими трофическую, барьерную, фагоцитарную и эндокринную функции [Griswold M.D., 1995].

Согласно полученным данным, их количество в тестикулярной ткани крыс также снижалось, особенно при длительной экспозиции токсикантом в обеих дозах - на 27,8% (группа 5) и 44,7% (группа 6) от уровня контроля. Клетки Сертоли принимают непосредственное участие в механизмах регуляции гонадостата, синтезируя и секретируя в кровь углеводсодержащие белки ингибин и активин. Их биологические эффекты на системном уровне проявляются разнонаправленным действием - подавлением, либо стимуляцией секреции гипофизарного гонадотропина - ФСГ.

Рисунок 4. Влияние совола на концентрацию ингибина и активина в сыворотке крови и тестикулярной ткани экспериментальных животных

Согласно экспериментальным данным (рис. 4), на 30 сутки отравления ПХБ в большей дозе зафиксировано достоверное увеличение уровня активина в гомогенате ткани яичек крыс, тогда как в условиях 60-дневного воздействия токсиканта наблюдалось заметное снижение и тестикулярного, и сывороточного содержания обоих димеров, что указывает на срыв регуляторных механизмов в силу, вероятно, прямого токсического действия ксенобиотика на гонады.

Эксперименты по изучению интенсивности биосинтеза белка в семенниках крыс при интоксикации соволом в экспериментах с введением [2-¹⁴С]-гистидина и [2-¹⁴С]-аланина выявили снижение темпов включения меченых аминокислот в состав суммарных белков ткани (рис. 5). Изменения были достоверными и носили отчетливый дозо- и хронозависимый характер. Зафиксированное уменьшение масс семенников экспериментальных животных, подвергшихся отравлению соволом также свидетельствует о выраженном гонадотоксическом действии полихлорбифенилов и катаболической направленности сдвигов метаболизма в тестикулярной ткани.

Рисунок 5. Скорость инкорпорации [2-¹⁴С]-гистидина и [2-¹⁴С]-аланина в белки семенников самцов крыс при воздействии совола (% от контроля)

В условиях воздействия токсикантов одной из существенных причин повреждения и гибели клеток является развивающаяся недостаточность энергообеспечения, связанная, с одной стороны, с повышенным расходом энергии (работа систем детоксикации, активация транспортных АТФаз для компенсации шунтовых потоков ионов в поврежденных участках биомембран и др.), и недостаточным синтезом макроэргов в клетке с другой (повреждение мембран, ферментов биологического окисления, в том числе дыхательной цепи митохондрий, нарушение окислительного фосфорилирования).

Исследования по определению содержания АТФ в гомогенате семенников крыс, подвергшихся экспериментальной интоксикации соволом, продемонстрировали существенное снижение тканевой концентрации макроэрга (рис. 6). Учитывая важнейшую роль АТФ в обмене веществ, не будет преувеличением утверждение о том, что значительная часть метаболических сдвигов при отравлении ПХБ прямо или опосредованно связана с недостаточностью макроэрга.

Необходимым звеном энергетического метаболизма митохондрий является ферментный комплекс биологического окисления и тканевого дыхания, осуществляющий окисление различных энергетических субстратов. В его состав входят ферменты окислительного декарбоксилирования пирувата, цикла трикарбоновых кислот и дыхательной цепи, локализованные в матриксе и в плоскости внутренней мембраны митохондрий. Важным показателем интегральной работы всего энзиматического ансамбля может являться скорость утилизации энергетических субстратов. Исходя из этого, мы сочли необходимым охарактеризовать окислительную активность митохондрий семенников. Экспериментальные данные свидетельствуют о разнонаправленных сдвигах поглощения митохондриями энергетических субстратов под влиянием различных режимов интоксикации ПХБ.

Рисунок 6. Содержание АТФ и интенсивность окисления энергетических субстратов в тестикулярной ткани крыс, подвергшихся отравлению соволом

Окисление -кетоглутарата и, особенно, пирувата под действием совола замедлялось, указывая на уязвимость пируватдегидрогеназного комплекса к действию токсиканта и, возможно, наличие метаболического блока на этом уровне, либо на начальных этапах цикла Кребса.

Несколько иная ситуация наблюдалась на ФАД-зависимом участке цикла трикарбоновых кислот. На 30-й день поступления токсиканта наблюдалась тенденция к увеличению по сравнению с контролем интенсивности выделения меченого углекислого газа из инкубационной среды, содержащей сукцинат. Некоторая активация окисления сукцината митохондриями может иметь целью энергообеспечение активирующихся детоксикационных (микросомальное окисление и конъюгация) и пластических процессов в клетках. При отравлении ксенобиотиком относительная активация сопряженного окисления янтарной кислоты может также отражать достаточную сохранность звена II дыхательной цепи и мембраностабилизирующую активность сукцината. Резюмируя изложенные сведения, можно предположить, что в этих условиях происходит «переключение» митохондриальных энергопродуцирующих систем с окисления НАД-зависимых субстратов на преимущественное потребление сукцината, использование которого характеризуется более высокими скоростями поставки макроэргов. Подобные изменения представляют собой универсальный механизм, обеспечивающий энергетические потребности тканей в условиях воздействия любого раздражителя [Кондрашова М.Н., 1996].

Однако, увеличение суточной дозы токсиканта приводило к однозначному угнетению поглощения всех использовавшихся энергетических субстратов, наиболее выраженному в отношении пирувата. Такой эффект, по-видимому, обусловлен значительным повреждением мембран митохондрий и их ферментных ансамблей как самим поллютантом и его метаболитами, так и в результате действия продуктов липопероксидации.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженном повреждающем воздействии полихлорбифенилов на энергетическую систему тестикулярной ткани экспериментальных животных, что в сочетании с другими патохимическими сдвигами может вносить серьезный вклад в патогенез нарушения мужской фертильности в условиях экологического неблагополучия.

Результаты экспериментального исследования скорости окисления основного энергетического субстрата тканей - глюкозы свидетельствуют об усилении катаболизма [1-¹⁴С]-глюкозы при 30 дневной интоксикации и замедлении ее метаболизма в условии более продолжительного воздействия ПХБ. Ведущим метаболическим путем отщепления первого атома углерода в тканях служит гексозомонофосфатный путь окисления, являющийся в цитоплазме клеток основным источником восстановленных НАДФН и пентозофосфатов. Исходя из полученных данных, представлялось целесообразным определить активность Г-6-Ф дегидрогеназы и уровень НАДФН в семенниках крыс, подвергнутых воздействию ПХБ, а также в печени, как основном органе детоксикации.

Полученные данные выявили органоспецифические особенности реакции тканей на воздействие ПХБ (рис. 7). Если 30-дневное отравление соволом сопровождалось повышением уровня НАДФН как в печени, так и в тестикулах, то с увеличением длительности интоксикации зарегистрировано статистически значимое уменьшение концентрации кофактора в семенниках при относительной сохранности его содержания в печеночной ткани. В то же время, в печени, но не семенниках экспериментальных животных, получавших 10 мг·сут·кг^-1 токсиканта в течение одного месяца, наблюдалась кратковременная индукция активности Г-6-Ф ДГ. Восстановленные формы НАДФ при действии ПХБ могут интенсивно вовлекаться в процессы детоксикации как на уровне активации микросомальных монооксигеназ, так и на уровне второй фазы биотрансформации ксенобиотиков для восстановления глутатиона, как одного из важнейших факторов резистентности к воздействию на клетки негативных факторов [Тиунов Л.А., 1988; Кулинский В.И., 1990, Куценко А.С, 2004].

Рисунок 7. Содержание НАДФН и активность Г-6-Ф ДГ в семенниках и печени крыс, подвергшихся интоксикации ПХБ (% от контроля)

Способность к оплодотворению зависит также от функционально-метаболического статуса акцессорных репродуктивных органов, принимающих непосредственное участие в формировании микросреды для половых клеток. Для оценки функциональной активности придаточных половых желез используются различные биохимические маркеры, такие как цитрат, цинк, ГГТ, кислая фосфатаза, фруктоза, простагландины, свободный L-карнитин, глицерофосфохолин, нейтральная б-гликозидаза и др. [Руководство ВОЗ, 2001]. Доказано, что активность кислой фосфатазы служит достоверным показателем функции предстательной железы. Основным маркером функции семенных пузырьков принято считать содержание фруктозы в семенной жидкости или тканях. Наиболее чувствительным и специфичным показателем функции эпидидимиса является нейтральная б-гликозидаза, снижение уровня активности которой указывает на имеющуюся патологию придатка. Количественное определение фруктозы в семенных пузырьках показало заметное падение ее концентрации у животных групп 3, 5, 6 на 19,6%, 36% и 45,3% от значений интактных самцов соответственно (рис. 8).

Активность нейтральной гликозидазы в эпидидимисе крыс при подострой интоксикации ПХБ в течение месяца в обеих дозах оставалась практически неизменной. При более продолжительном воздействии ксенобиотика наблюдалось ее угнетение на 28,5% при ежесуточном поступлении совола в дозе 5 мг·сут·кг^-1 и на 44,3% при увеличении дозы до 10 мг·сут·кг^-1.

Отравление бифенилами в дозе 10 мг·сут·кг^-1 в течение одного месяца и 60-и дней сопровождалось также уменьшением активности кислой фосфатазы в ткани вентрального отдела предстательной железы экспериментальных животных до 75,3% и 50,2% от уровня контроля, соответственно. Кроме того, в простате крыс группы 3 обнаружено заметное угнетение фосфатазы, составившее 72,3% от контрольных значений. Вышеизложенные результаты позволяют прийти к заключению, что отравление полихлорбифенилами оказывает выраженное негативное влияние на метаболический статус ткани акцессорных половых органов самцов экспериментальных животных, что, возможно, является следствием, как ослабления андрогенной стимуляции, так и прямого токсического действия ПХБ. В литературе имеются сообщения об их накоплении в органах репродуктивной системы с высоким содержанием липидов, в том числе в ткани эпидидимиса. [Andric S.A., 2000; Абдуллина А.З., 2009].