Молекулярно-биологические маркеры в диагностике, патогенезе и прогнозе заболеваний щитовидной железы

Представлены данные по исследованию комбинированных показателей апоптоза и пролиферации у больных с заболеваниями ЩЖ. Так, обнаружено, что у больных аутоиммунными тиреоидитами повышено количество всех групп сочетанных клеток (р53/Ki-67, p53/CD95, bcl-2/Ki-67, bcl-2/CD95, CD95/Ki-67, р53/CD95L, CD95/CD95L, bcl-2/CD95L) в 3-25 раз по сравнению с группой пациентов с новообразованиями ЩЖ. Наибольшие различия выявлены в группе клеток bcl-2/ CD95, которые имели более чем 25-кратное их превышение у больных АИЗЩЖ по сравнению с пациентами с новообразованиями.

Количество сочетанных клеток у больных с новообразованиями было значительно снижено, а достоверные различия между группами больных АЩЖ и РЩЖ выявлены только лишь при анализе количества р53/CD95L-позитивных клеток. Незначительное достоверное превышение количества р53/CD95L-клеток в группе аденом ЩЖ по сравнению с РЩЖ позволяет использовать этот показатель в дополнительной диагностике раков и аденом ЩЖ. Достоверно сниженным в этой группе клеток оказался показатель плотности распределения белка р53 у больных РЩЖ в отличие от пациентов с аденомой ЩЖ. Еще одной характерной особенностью пациентов с новообразованиями ЩЖ явилось 4-7-кратное увеличение плотности CD95L-рецепторов на CD95/CD95L-позитивных клетках, при этом плотность CD95L-рецепторов на CD95/CD95L-клетках ткани аденомы ЩЖ была наиболее высокой, а плотность этих рецепторов в тканях рака ЩЖ была минимальной для новообразований ЩЖ.

Нами были рассчитаны диагностическая эффективность, пороговые значения у показателей количества клеток и плотности распределения общих рецепторов/белков по общим и сочетанным показателям апоптоза и пролиферации, которые имели достоверные различия между группами сравнения: группами больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными новообразованиями.

В дифференциальной диагностике рака и АИЗЩЖ наибольшую диагностическую информативность имели следующие показатели: количество CD95-позитивных клеток, количество CD95L-позитивных клеток, количество bcl-2dim-позитивных клеток, количество bcl-2bright-позитивных клеток и плотность распределения белка bcl-2bright в bcl-2 bright-позитивных клетках ЩЖ. Остальные показатели имеют хорошую диагностическую эффективность и могут быть рекомендованы как дополнительные маркеры дифференциальной диагностики РЩЖ и аутоиммунных тиреоидитов.

В дифференциальной диагностике аденом и аутоиммунных заболеваний ЩЖ высокие показатели достоверности, диагностической чувствительности и специфичности используемых методов выявили значения следующих показателей: количество CD95-позитивных клеток, количество CD95L-позитивных клеток и плотность распределения белка bcl-2 в bcl-2-позитивных клетках ЩЖ. Другие показатели, используемые в диагностике АЩЖ и аутоиммунного тиреоидита, показали очень хорошую, хорошую и удовлетворительную диагностическую эффективность.

Наибольшие сложности возникали в дифференциальной диагностике рака и аденом ЩЖ. Нами были выявлены показатели, которые имели высокую достоверность получаемых результатов, но не обладали столь же хорошей и отличной диагностической эффективностью. Это создает определенные трудности в дифференциальной диагностике данных нозологий и не позволяет с высокой степенью надежности использовать показатели апоптоза и пролиферации для этих целей, что способствует поиску новых диагностических маркеров.

Для данного вида диагностики мы рекомендуем использовать комбинированные показатели апоптоза и пролиферации по количеству клеток, применение которых с высокой достоверностью и отличными показателями чувствительности, специфичности и точности позволяет дифференцировать РЩЖ от аутоиммунного тиреоидита: bcl-2/Ki-67, bcl-2/CD95, p53/CD95L, CD95/CD95L, bcl-2/CD95L.

Содержание клеток с маркерами bcl-2/CD95 (рис. 2) было очень высоким в группе пациентов с АИЗЩЖ и достигало значений 47,2±1,82%; количество
bcl-2/CD95-клеток у больных РЩЖ и АЩЖ было на низком уровне и составило 1,19±0,59 и 1,87±0,57% соответственно. Различия между группами больных со злокачественными новообразованиями и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ были найдены по показателям количества bcl-2/CD95-клеток (р=0,0001). Между группами больных с аденомами и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ выявлены значимые различия по количеству bcl-2/CD95-клеток (р=0,0001) и показателю плотности экспрессии белка bcl-2 (р=0,019). Отмечены лишь незначительные достоверно значимые различия в 98,9% по величине плотности экспрессии bcl-2-белка на CD95/bcl-2-клетках у больных раком и аденомой ЩЖ.

Кроме пяти групп клеток в дифференциальной диагностике РЩЖ и аутоиммунного тиреоидита имеется достаточно большое количество показателей плотности экспрессии рецепторов в этих группах клеток, которые могут быть полезны как дополнительные дифференциально-диагностические маркеры с очень хорошими, хорошими и удовлетворительными показателями диагностической эффективности.

Рис. 2. Гистограммы показателей групп bcl-2/CD95-клеток с сочетаниями маркеров апоптоза в тканях щитовидной железы у больных с аутоиммунными (А), доброкачественными (Б) и злокачественными (В) заболеваниями

В дифференциальной диагностике аденом и аутоиммунных заболеваний ЩЖ наиболее значимыми показателями могут служить следующие сочетания клеток с фенотипами: р53/CD95, bcl-2/Ki-67, bcl-2/CD95, CD95/CD95L, bcl-2/CD95L, отличающиеся наивысшей диагностической эффективностью. Выявлены и другие показатели, отвечающие высоким параметрам диагностической эффективности, которые можно использовать в дифференциальной диагностике аденом и аутоиммунных тиреоидитов, например по параметрам плотности распределения рецепторов/белков в группах клеток с сочетанными маркерами апоптоза и пролиферации.

Наибольшую сложность представляли дифференциальная диагностика рака и аденомы ЩЖ, а также выявление диагностических критериев, которые обладали высокой диагностической информативностью и позволяли дифференцировать рак и аденому ЩЖ.

Анализ полученных данных показал, что в диагностике этих двух схожих нозологий наибольшую диагностическую эффективность имели показатели количества p53/CD95L-клеток, а также плотности распределения белка р53 в группе p53/CD95L-клеток, но они не обладали отличной диагностической информативностью. Определены и другие показатели, в основном плотности распределения в комбинированных группах клеток рецепторов/белков, которые могли бы использоваться в дифференциальной диагностике рака и аденомы ЩЖ. Однако все эти показатели имели главным образом неудовлетворительную и удовлетворительную диагностическую эффективность, которая не может быть рекомендована в практику специалистам клинической лабораторной диагностики.

Проведенные исследования общих маркеров апоптоза и пролиферации у больных с папиллярным и фолликулярным РЩЖ показывают наличие значительных различий между этими вариантами РЩЖ.

Количество CD178+-клеток было повышено у пациентов с фолликулярным РЩЖ и составило 36,52±4,28%, при этом его плотность распространения была минимальной - 5,59±0,52. При папиллярном РЩЖ количество CD178+-клеток было минимальным (5,97±2,46%), почти в 6 раз отличалось от количества CD178+-клеток, выявленных при фолликулярном раке; при этом плотность экспрессии CD95L-рецепторов значительно повышалась на мембране исследуемых клеток ткани папиллярного РЩЖ и составила 24,79±9,53.

Выявлены и другие показатели белков, регулирующих в основном апоптоз, которые могут быть рекомендованы в дифференциальной диагностике папиллярного и фолликулярного варианта РЩЖ, однако они обладали меньшей, но вполне удовлетворительной диагностической информативностью.

Таким образом, фолликулярный вариант РЩЖ в основном характеризовался достоверно повышенным количеством клеток с рецептором CD178+ (CD95L, FAS-L).

Были исследованы количество клеток и показатели плотности распределения рецепторов/белков с использованием комбинированных показателей апоптоза и пролиферации у пациентов с фолликулярными и папиллярными вариантами РЩЖ.

Выявлено несколько групп клеток с комбинированными маркерами, которые были повышены, а в некоторых случаях значительно повышены у больных фолликулярными РЩЖ. Это группы клеток с фенотипами: р53/Ki-67, bcl-2/Ki-67, p53/CD95L, среди которых выделялась группа клеток с сочетанными маркерами bcl-2/CD95L, повышение которых было максимальным и отличалось более чем в 10 раз от этого показателя в группе больных папилллярным РЩЖ.

Большое значение следовало бы уделить некоторым стабильным показателям сочетанных маркеров апоптоза и пролиферации, в частности показателям плотности распределения белков/рецепторов в исследуемой суспензии клеток и на их поверхности; их различие более чем на 20-30% позволяло предполагать значительный вклад этих параметров в диагностику разных вариантов РЩЖ. Нами выявлены достаточно убедительные превышения в показателях плотности экспрессии: белков р53 в клетках с фенотипом р53/Ki-67, белков bcl-2 и рецепторов CD95 в клетках с фенотипом bcl-2/CD95, рецепторов CD95 и белка Ki-67 в клетках с фенотипом CD95/Ki-67, белков р53 и рецептора CD95L в клетках с фенотипом р53/CD95L, рецепторов CD95 в клетках с фенотипом CD95L/CD95 и белков bcl-2 и рецепторов CD95L в клетках с bcl-2/CD95L-фенотипом у больных папиллярным РЩЖ. Аналогичные изменения, выразившиеся в повышении плотности экспрессии белка bcl-2 в клетках с bcl-2/Ki-67-фенотипом, были нами зафиксированы у больных фолликулярным РЩЖ.

В работе представлены расчеты пороговых значений и оценена диагностическая эффективность общих и комбинированных показателей апоптоза и пролиферации, которые могут использоваться в дифференциальной диагностике папиллярного и фолликулярного РЩЖ.

В исследовании были проанализированы результаты общих параметров апоптоза и пролиферации в морфологически не измененных тканях ЩЖ («нормальных»), забранных из доли органа, где опухолевого процесса не было, в сравнении с тканями, взятыми из участков, пораженных папиллярным РЩЖ.

Минимальные различия «нормальных» и опухолевых тканей в ЩЖ, пораженной опухолевым процессом, а также практическое отсутствие достоверных различий по большему количеству исследуемых показателей, в основном характеризующих наиболее важные параметры апоптоза, могут считаться достаточными аргументами в пользу поддержки гипотезы о генетически детерминированном процессе в органе, в котором выявлен папиллярный РЩЖ. Различия, выявленные лишь в количестве клеток с рецептором CD95 и маркерами пролиферативной активности (Ki-67), не дают веских оснований дифференцировать эти ткани, взятые из одного органа.

Вне зависимости от того, в каком анатомическом участке ЩЖ морфологически выявлен рак, уже в морфологически не измененных участках нормальной ткани на внутриклеточном уровне отмечаются близкие к опухолевому процессу нарушения в механизмах апоптоза, снижении пролиферативной активности клеток.

При продолжении поиска закономерностей были проанализированы параметры комбинированных маркеров апоптоза и пролиферации в «нормальных» тканях и опухоли при папиллярном РЩЖ. Выявлено пять групп клеток, которые достоверно различались между собой по количественному составу: p53/Ki-67, p53/CD95, bcl-2/CD95, CD95/Ki-67, bcl-2/CD95L. В «нормальных» тканях ЩЖ количество клеток с выявленными фенотипами клеток было увеличено в 2-5 раз по сравнению с тканями, забранными из опухоли ЩЖ. Снижение количества клеток с комбинированными маркерами в опухолевых тканях могло быть косвенным свидетельством снижения полиморфизма клеток и характерным признаком бластомогенеза. Полученные различия по пяти фенотипически малочисленным группам клеток позволяют нам использовать их в дополнительной диагностике зоны поражения опухолевого процесса, что было практически невозможным при анализе основных маркеров, регулирующих апоптоз и описанных выше.

С учетом наилучших показателей диагностической эффективности (по параметрам сходимости результатов, чувствительности, специфичности и точности) в дополнительной дифференциальной диагностике между «нормальной» и патологической тканями ЩЖ может применяться такой показатель, как количество клеток с фенотипом p53/CD95. Остальные четыре группы клеток показали хорошую диагностическую информативность и могут также быть рекомендованы для дифференциальной диагностики в следующем порядке по мере убывания эффективности диагностических показателей количества клеток с фенотипами: p53/CD95, p53/Ki-67, bcl-2/CD95L, bcl-2/CD95.

Были проанализированы показатели общих маркеров апоптоза и пролиферации в тканях у больных с АЩЖ. В процессе исследования выявлено, что у больных с доброкачественными новообразованиями имелись два типа АЩЖ, различающихся по фенотипу. Основным отличием от основной (аденомы I типа) группы АЩЖ в выявленной группе аденом II типа явилось наличие повышенного количества клеток с мембранным рецептором FAS-L. По нашим данным, частота встречаемости аденом II типа составила 24%. Повышенная экспрессия FAS-L в АЩЖ может служить фактором плохого прогноза опухоли, возможным ее быстрым ростом и перерождением из доброкачественного процесса в злокачественный. Поэтому выделение аденом с повышенной экспрессией в отдельную группу и изучение фенотипа этих новообразований представляет определенную научную и прогностическую ценность.

Анализ количества CD95L-клеток, содержащихся в суспензии, приготовленной из аденом ЩЖ, показал, что число CD178+-клеток было очень высоким
(рис. 3) у больных с аденомой II типа и составило 54,54±12,84%, статистически достоверно отличаясь (р=0,002) от этого показателя у больных с аденомой I типа, где этот показатель был равен 5,96±2,15%. Показатель плотности распределения рецептора CD95L имел тенденцию к 3-кратному снижению в аденомах II типа (3,82±0,46), а в группе пациентов с основным типом АЩЖ это значение было равно 9,86±5,69.

В диагностике аденом разных типов могли помочь и показатели количества клеток с белком р53 и плотности распределения белка р53 в исследуемой группе р53-позитивных клеток. Значимыми оказались показатели количества р53-клеток, которые были наиболее высокими (93,74±4,98%) в аденомах II типа, достоверно отличаясь (р=0,002) от этого показателя в аденомах I типа (64,72±15,2%). Значение плотности экспрессии белка р53 в этой группе клеток было наибольшим (13,56±3,08) в аденомах II типа, статистически отличаясь (р=0,002) от этого показателя (4,79±2,09) в аденомах I типа.

Заслуживают внимания данные, полученные при анализе общего количества р53dim-клеток: наибольшее количество клеток отмечено в аденомах I типа -38,73±16,22%, в аденомах II типа - 8,5±2,67% (р=0,002) (см. рис. 4). Плотность распределения белка р53 в р53dim-позитивных клетках изучаемых групп больных была достоверно большей в аденомах II типа (1,77±0,07), статистически достоверно отличаясь (р=0,005) от значения этого же показателя (1,55±0,08) в аденомах I типа.

Подобные достоверные различия (р=0,002) выявлены и при сравнении количества р53bright-клеток (см. рис. 3). Количество р53bright-клеток было значительно повышено у больных с аденомой II типа - 83,25±9,8%, в то время как у больных аденомой I типа количество р53bright-клеток было намного ниже - 21,82±19,84%. Обнаружены также статистически значимые различия (р=0,011) в величинах плотностей распределения белка р53 в р53bright-клетках у больных аденомой I типа (10,93±2,21) в сравнении с аденомами II типа (14,84±1,34).

Рис. 3. Гистограммы общего количества клеток с маркерами, регулирующими апоптоз CD95L, р53, р53dim, р53bright, bcl-2, bcl-23dim, bcl-2bright у больных с разными типами аденомы щитовидной железы: А - аденома I типа; Б - аденома II типа

Выявлено статистически значимое (р=0,002) более чем 40-кратное повышение количества клеток, экспрессирующих маркер Ki-67, в группе пациентов с аденомой II типа - до 60,12±18,1% по сравнению с аденомой I типа, где этот показатель составил 1,45±0,77%. В то же время не было получено достоверных различий (р=0,131) между группами больных с аденомами двух типов по показателю плотности распределения белка Ki-67 в исследуемых клетках. Высокий показатель плотности распределения белка Ki-67 обнаружен в аденомах II типа (4,83±0,73) против 3,26±3,68 в аденомах I типа.

Обнаружено различие в показателях количества bcl-2-клеток в аденомах разных типов. Так, число bcl-2-клеток в аденомах II типа было значительно достоверно выше (р=0,002) (95,47±4,2%) по сравнению с аденомами I типа (71,47±10,36%). Обнаружены статистически значимые различия (р=0,002) по величинам плотности распределения белка bcl-2 в bcl-2-позитивных клетках между аденомами II типа (16,22±2,23) и I типа (4,51±1,65).

Показатели количества bcl-2dim-клеток (см. рис. 3) также достоверно (р=0,002) повышены (48,47±12,83%) в аденомах I типа и значительно снижены в аденомах II типа (5,24±3,32%). Величина плотности распределения bcl-2-белка в исследуемой группе bcl-2dim-клеток была повышена в аденомах II типа и составила 1,73±0,06, достоверно отличаясь (р=0,006) от этого показателя при аденомах II типа, где он был достоверно ниже и составил 1,51±0,1.

Иная динамика отмечена при сравнительном анализе показателей количества bcl-2bright-клеток в группах сравнения (см.рис. 3). Количество bcl-2bright-клеток было значительно достоверно (р=0,002) выше в аденомах II типа (89,85±8,44%), чем в аденомах I типа (18,12±15,29%). Не выявлены достоверные различия (р=0,059) между показателями плотности экспрессии белка bcl-2 в группе bcl-2bright-позитивных клеток в аденомах II типа (16,67±0,93) и I типа (13,66±2,79).

Таким образом, исследование общих маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию в группе клеток у больных с АЩЖ, позволило выделить фенотипически отличный вариант АЩЖ (аденома II типа) и изучить распределение числа клеток и плотности рецепторов/белков в двух типах аденом.

Выявленная группа аденом II типа обладала отличительными фенотипическими особенностями, выраженными в повышенном, а иногда и в значительно повышенном количестве клеток с маркерами CD95L, p53, p53dim, p53bright, Ki-67, bcl-2, bcl-2dim, bcl-2bright, что предполагало наличие агрессивной пролиферативной активности, повышенного участия клеток в механизмах апоптоза и, по всей видимости, неблагоприятного прогноза развития опухолей с возможностью перерождения доброкачественного процесса в злокачественный, например в фолликулярный РЩЖ, обладающий сходными фенотипическими особенностями.

Выявленное значительное повышение количества FAS-L в аденомах II типа может быть также плохим прогностическим признаком при проведении химиотерапии, так как считается, что в некоторых типах опухолевых клеток цитостатики индуцируют апоптоз, усиливая экспрессию лигандов и рецепторов семейства TNF. Следовательно, резистентность к сигналам рецепторов смерти наделяет опухолевые клетки химиорезистентным фенотипом.

Изучены диагностическая информативность и пороговые значения показателей маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, в дифференциальной диагностике аденом I и II типа.

Выявлены критические значения по всем исследуемым параметрам белков/рецепторов: CD95L, p53, p53dim, p53bright, Ki-67, bcl-2, bcl-2dim, bcl-2bright, регулирующих апоптоз и пролиферацию, с очень хорошими и отличными параметрами диагностической эффективности значений количества клеток ЩЖ и большинства показателей плотности распределения рецепторов и белков в/на клетках ЩЖ.

Проведены исследования количества клеток и плотности распределения рецепторов/белков сочетанных маркеров апоптоза и пролиферации в аденомах ЩЖ разных типов.

Проведены исследования количества клеток и плотности распределения рецепторов/белков в сочетании нескольких маркеров, регулирующих апоптоз и пролиферацию, в АЩЖ разных типов, что позволило выявить четыре группы клеток с фенотипами p53/Ki-67, bcl-2/Ki-67, CD95/Ki-67, bcl-2/CD95L, которые достоверно отличали АЩЖ II типа от АЩЖ I типа. Однако лишь в двух группах клеток превышение было настолько значительным, что позволяло использовать эти показатели в диагностике с наибольшей достоверностью.

Превышение в 58 раз количества клеток с фенотипом p53/Ki-67 и в 23 раза клеток с фенотипом bcl-2/CD95L в аденомах ЩЖ II типа бесспорно делает использование этих показателей диагностически и практически эффективными в сравнении с аналогичными показателями в АЩЖ I типа (рис. 4).

Рис. 4. Гистограммы количества p53/Ki-67- и bcl-2/CD95L-клеток в различных типах аденом щитовидной железы: А - аденома I типа; Б - аденома II типа

Еще одной отличительной особенностью аденом II типа следует считать характе-ристики повышенной плотности экспрессии практически всех белков/рецепторов на диагностически важных фенотипически определенных группах клеток в сравнении с этими же показателями плотности в тканях АЩЖ I типа. Лишь в одном случае не соблюдалось характерологическое соответствие повышенной плотности экспрессии рецепторов (белков) повышенному количеству комбинированных (сочетанных) групп клеток в аденоме II типа, выразившееся в 3-кратном достоверном снижении показателя плотности экспрессии рецептора CD95L на клетках с фенотипом CD95/CD95L в сравнении с АЩЖ I типа.

Были проанализированы расчеты критических показателей и значений диагностической эффективности для проведения дифференциальной диагностики аденом I и II типа по показателям групп клеток и плотности распределения белков/рецепторов с использованием общих и сочетанных маркеров апоптоза и пролиферации. Выявлено, что отличную диагностическую эффективность по показателям чувствительности, специфичности и точности оценки метода в 99,9% показали группы клеток с фенотипами p53/Ki-67, bcl-2/Ki-67 и bcl-2/CD95L и некоторыми показателями плотности распределения белков/рецепторов в других группах клеток.

Сравнительная характеристика общих показателей, регулирующих апоптоз и пролиферацию в «нормальных» тканях и АЩЖ, выявила незначительные достоверные отличия в основном на мембранных рецепторах (CD95, CD95L), принимающих участие в апоптозе, а также в перераспределении количества клеток с белком р53, выразившемся в снижении количества клеток р53dim и повышении p53bright-позитивных клеток.

Так, количество клеток с рецепторами CD95 у больных с аденомами ЩЖ в 3,3 раза превышало аналогичное число CD95-позитивных клеток в морфологически не измененных тканях ЩЖ, забранных из другой доли пораженного аденомой органа. Количество клеток с фенотипом CD95L в аденоматозной ткани ЩЖ превышало этот показатель в гистологически не измененных тканях на 75%. Отмечено, что при сравнимом уровне общего количества клеток с фенотипом р53+ в исследуемых тканях ЩЖ количество клеток р53dim достоверно снижалось в тканях с АЩЖ на 87%, а количество клеток с фенотипом p53bright в 2,8 раза достоверно резко возрастало. Такое перераспределение было характерным для АЩЖ и свидетельствовало о готовности и повышенной активности мембранных рецепторов и внутриклеточных апоптозных белков к запуску в трансформированных клетках естественного механизма программируемой клеточной гибели. Следует заметить, что в тканях АЩЖ отмечалось повышенное образование прежде всего апоптозных рецепторов и белков и практически отсутствовал достоверный рост антиапоптозных белков.

Сравнительный анализ групп клеток и плотности распределения рецепторов/белков в/на клетках с сочетаниями маркеров апоптоза и пролиферации у пациентов, оперированных по поводу АЩЖ, в «нормальных» и патологических тканях выявил наличие четырех групп клеток с фенотипами р53/Ki-67, bcl-2/CD95, CD95/CD95L, bcl-2/CD95L.

Показатель количества р53/Ki-67-клеток был увеличен на 77% при одновременно повышенной в 2,3 раза экспрессии белка р53 в р53/Ki-67-позитивных клетках в тканях АЩЖ. Наиболее значительным ростом (в 3,5 раза) был отмечен уровень количества клеток с фенотипом bcl-2/CD95 в аденоматозной ткани ЩЖ. Почти в 2 раза выявлено увеличение количества клеток с фенотипами CD95/CD95L, bcl-2/CD95L в тканях АЩЖ по сравнению с «нормальной» морфологически не измененной тканью.

Была изучена диагностическая эффективность при дифференциальной диагностике «нормальной» и патологической ткани ЩЖ у больных с аденомами.

Наиболее значимыми среди изученных показателей по критериям диагностической информативности являются показатели общего количества клеток с фенотипами CD95+, р53dim+; среди сочетанных маркеров - группа клеток с фенотипом bcl-2/CD95L (чувствительность - 83,3%, специфичность - 99,9%, точность метода - 91,6%).

Нами изучались также процессы инвазии и метастазирования злокачественных и доброкачественных новообразований по некоторым компонентам системы фибринолиза.

Изучены урокиназные и тканевые протеазы и их ингибитор у больных раками ЩЖ в зависимости от стадии заболевания и вовлеченности в процесс лимфатических узлов. Величина активатора плазминогена урокиназного типа увеличивалась по мере развития злокачественного процесса, начиная со II стадии заболевания и по мере вовлеченности в процесс лимфатических узлов. Отмечалось также линейное повышение активатора плазминогена тканевого типа у больных РЩЖ во II и IV стадии заболевания, при этом динамики по вовлеченности в процесс лимфатических узлов показателей тканевой протеазы выявлено не было. В результате исследования значений ингибитора плазминогена 1-го типа выявлено, что наиболее высокое значение этого показателя было обнаружено в III стадии заболевания РЩЖ и при вовлечении в процесс лимфатических узлов. Все это могло свидетельствовать о влиянии повышенной концентрации PAI-1 на подавление активности онкосупрессора р53 и торможение процессов апоптоза.

В патогенезе развития и прогнозе злокачественных и доброкачественных новообразований ЩЖ в подтверждение генетически детерминированной гипотезы развития опухолевого процесса в организме, наверное, главную роль играют поломки в генетическом аппарате клеток.

Нами исследованы мутации гена р53 в целях изучения степени его влияния на нарушения процессов пролиферации и апоптоза в тиреоцитах. Выявлено, что мутации гена встречаются у больных с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ в 7,15% случаев, с доброкачественными новообразованиями - в 9,09% случаев и со злокачественными новообразованиями - в 19,2% случаев. Общий процент выявления мутации гена р53 у исследуемых больных с заболеваниями ЩЖ составил 10,9.

Изучена частота встречаемости мутации гена р53 в тканях, взятых из разных участков ЩЖ при доброкачественных и злокачественных новообразованиях. Так, у больных с папиллярными раками ЩЖ выявлено в 12,5% случаев наличие мутации гена р53 в нормальной морфологически не измененной ткани ЩЖ. А у больных с доброкачественными новообразованиями выявлен один образец «нормальной» ткани, где была обнаружена мутация гена р53, которая встретилась в том же образце, где была выявлена мутация гена р53 в АЩЖ.

В заключение хочется отметить, что выполнено обширное комплексное исследование иммунной системы, цитокинов и молекул адгезии, FAS-L на иммунокомпетентных клетках в крови, а также определены общие и сочетанные показатели апоптоза и пролиферации в тканях ЩЖ, компонентов системы фибринолиза, проведены исследования генетического дефекта гена р53 в аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваниях ЩЖ.

Проведенные исследования позволили расширить наши познания о процессах в иммунной системе, в механизмах пролиферации и апоптоза тиреоцитов для более полного понимания патогенеза и прогноза развития прежде всего опухолевого и аутоиммунного процесса, а также использования в диагностической практике новых молекулярно-биологических маркеров.

Заключение

щитовидный железа рак пролиферативный

ВЫВОДЫ.

1. Комплексный анализ некоторых параметров иммунной системы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы позволяет установить, что у разных групп пациентов имели место свои нарушения показателей иммунитета, выражавшиеся у больных с аутоиммунными расстройствами развитием аутоиммунного состояния с наличием повышенных концентраций антител к тиреопероксидазе (микросомальной фракции) и тиреоглобулину, а у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями - иммунодефицитного состояния.

2. Результаты исследования цитокинов, хемокина и молекул межклеточной адгезии, соотношений цитокинов у больных с аутоиммунными заболеваниями, доброкачественными и злокачественными новообразованиями позволяют использовать их в дополнительной дифференциальной диагностике этих нозологических форм.

3. Исследование экспрессии FAS-L-рецепторов на иммунокомпетентных клетках основных хелперных и эффекторных субпопуляциях лимфоцитов у больных со злокачественными новообразованиями щитовидной железы выявили наличие повышенного количества лимфоцитов с FAS-L, а также установили присутствие повышенного (в 100-70 раз) количества клеток с FAS-L на основных (хелперных, эффекторных) субпопуляциях лимфоцитов, что является косвенным признаком противоопухолевой активности иммунной системы.

4. При анализе основных и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации в тканях щитовидной железы у больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными новообразованиями выявлены фенотипические показатели пролиферативной активности, характерных особенностей, содержания рецепторного и белкового аппарата, принимающего участие в регуляции апоптоза в клетках исследуемых тканей, количественный состав клеток и плотности экспрессии этих маркеров.

5. Проведенные исследования фенотипа клеток в тканях щитовидной железы у больных с ненаследственными формами рака (папиллярный, фолликулярный) щитовидной железы выявили характерные различия в фенотипах общих и сочетанных показателей и на их основе позволили классифицировать исследуемые варианты рака щитовидной железы. Так, в дополнительной дифференциальной диагностике фолликулярного и папиллярного вариантов рака определяющее значение имеет показатель количества клеток с CD95L, который при значениях более 20,64% с достоверностью (р=0,002) и диагностической эффективностью в 99,9% свидетельствовал о наличии фолликулярного рака щитовидной железы.

6. Выявлена группа аденом (аденомы II типа), значительно отличающихся по своим фенотипическим характеристикам, которая характеризовалась повышенным содержанием в суспензии клеток ткани ЩЖ маркеров пролиферации Ki-67 и рецепторов с CD95L, имела более выраженные изменения по количественному составу клеток с р53 и bcl-2-белками в р53, р53bright, bcl-2, bcl-2bright-позитивных клетках и повышенной плотности распределения этих белков в р53bright, bcl-2bright-клетках, а также большого количества клеток с сочетанными маркерами p53/Ki-67, bcl-2/Ki-67, CD95/Ki-67, bcl-2/CD95L. Все это может свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе развития заболевания. В диагностическом плане для выявления аденом II типа нужно использовать показатели количества клеток p53/Ki-67, при значениях которых более 30,89% с достоверностью (р=0,002) и диагностической эффективностью в 99,9% выявляются аденомы II типа.

7. Сравнительные исследования общих и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации в морфологически не измененных и опухолевых тканях у больных с аденомами и раками щитовидной железы, взятых из одной железы, выявили наличие минимальных различий у больных со злокачественными новообразованиями и более выраженных изменений у больных с доброкачественными новообразованиями. Все это свидетельствовало о развитии на молекулярном (клеточном и внутриклеточном) уровне уже начавшихся процессов опухолевой трансформации в визуально и микроскопически не измененных тканях пораженной новообразованием щитовидной железы.

8. Уровень активатора плазминогена урокиназного типа (uPA) прогрессивно возрастает с увеличением стадии заболевания, размера опухоли и наличия регионарных метастазов. Не обнаружено четкой взаимосвязи содержания uPA, tPA и PAI-1 в злокачественных опухолях щитовидной железы со степенью дифференцировки и типом роста опухолевого процесса.

9. Выявлена частота мутации р53 у больных папиллярным раком ЩЖ -20,83%, аденомой - 9,1%, аутоиммунными тиреоидитами - 7,1%. Такая частота позволяет предложить выполнять раннее скрининговое исследование на предмет выявления данной мутации для возможности начать противораковые мероприятия на ранних этапах развития патологического процесса в щитовидной железе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Для улучшения дифференциальной диагностики аутоиммунных, доброкачественных и злокачественных заболеваний щитовидной железы должны учитываться особенности нарушения иммунной системы, показателей цитокинов и иных параметров, характеризующих состояние иммунитета.

2. В результате исследования цитокинов, хемокина, молекул адгезии разработаны соотношения (индексы) цитокинов; для них совместно с показателями цитокинов рассчитаны пороговые значения и приведены показатели диагностической эффективности, которые могут использоваться в дифференциальной диагностике практически здоровых пациентов и больных с аутоиммунными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями. Полученные пороговые значения индексов цитокинов рекомендуются для использования в дополнительной диагностике исследуемых нозологий.

3. С высокой диагностической эффективностью рекомендуется использовать в дифференциальной диагностике злокачественных и аутоиммунных заболеваний показатели ИЛ-10 (значения более 13,94 пг/мл), sE-selectin (значения более 45,12 пг/мл), MCP-1 (значения более 170,58 пг/мл), индекс г-ИНФ/ИЛ-10 (значения менее 32,74), доброкачественных и аутоиммунных заболеваний -показатели ИЛ-6 (значения менее 18,57 пг/мл), sICAM-1 (значения более 304,48 пг/мл), ИЛ-10 (значения более 15,94 пг/мл), индексы ИЛ-6/г-ИНФ (значения менее 256,07), г-ИНФ/ИЛ-4 (значения более 10,09), г-ИНФ/ИЛ-10 (значения менее 48,18), злокачественных и доброкачественных новообразований - показатели ИЛ-6 (значения более 18,16 пг/мл), sE-selectin (значения более 56,39 пг/мл), индекс ИЛ-6/г-ИНФ (значения более 421,32).

4. Для улучшения диагностической эффективности разработана логистическая регрессивная модель диагностики рака щитовидной железы у больных с новообразованиями (доброкачественными и злокачественными) ЩЖ, основанная на совместном использовании показателей ИЛ-6, sE-seleсtin и индекса ИЛ-6/г-ИНФ, обладающая более высокой достоверностью и точностью в отношении дифференцированных ненаследственных форм раков щитовидной железы.

5. Рассчитаны пороговые значения для общих и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации, которые могут быть использованы в дифференциальной диагностике этих патологий. Предложено их использовать в диагностической практике «нормальной» ткани ЩЖ, ткани больных аутоиммуными, доброкачественными и злокачественными заболеваниями щитовидной железы и в дифференциальной диагностике ткани исследуемых патологий ЩЖ, а также при мониторинге терапии и в перспективе для иных видов «таргетной» лекарственной терапии, в механизме действия которых мишенями являются пролиферативные и апоптозные белки.

6. Исследованные фенотипические особенности рецепторного и белкового аппарата, участвующего в регуляции апоптоза, в суспензии клеток при папиллярных и фолликулярных раках щитовидной железы, позволяют использовать полученные пороговые значения в дополнительной дифференциальной диагностике на доклиническом этапе обследования пациента.

7. Оценка белков и рецепторов, участвующих в регуляции апоптоза и пролиферации, методом проточной цитометрии в группе больных АЩЖ позволяет диагностировать аденомы, фенотипически отличные от основного типа аденом, - АЩЖ II типа. Выявленные особенности аденомы II типа характеризуют неблагоприятный прогноз развития патологического процесса и требуют последующего изучения вопроса о разработке новых подходов к терапии пациентов с данной фенотипической формой аденомы ЩЖ.

8. Наличие, по данным общих и сочетанных показателей апоптоза и пролиферации, у больных раком щитовидной железы в морфологически и патологически визуально не измененной ткани щитовидной железы практически похожих фенотипических изменений с тканями, где этот процесс визуализируется морфологами, позволяет рекомендовать онкологам выполнять операции по полному удалению органа и отказаться от использования таких органосохраняющих (паллиативных) оперативных вмешательств, как гемитомия, секторальная резекция щитовидной железы.

9. В целях дополнительной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований рекомендуется использовать в практике пороговых значений показатели активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибиторы.

10. Своевременное проведение скрининговых исследований на выявление мутаций в гене р53 в ненаследственных раках щитовидной железы позволяет на более ранних стадиях выявлять начало опухолевого процесса и своевременно начинать проведение терапии, что в конечном итоге будет положительно отражаться на более благоприятном прогнозе заболевания.

Литература

1. Казаков С.П. ДНК-диагностика в клинической лабораторной практике. Харьков: Аналитика, 1999. 25 с.

2. Владимиров В.Г., Карпищенко А.И., Скворцов С.В., Казаков С.П., Шарова Л.А., Трофимов Д.Ю., Мальков И.Г. Молекулярно-биологические методы исследований в клинической лабораторной практике // В кн.: Медицинские лабораторные технологии - программы и алгоритмы / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб, 1999. Т. 2. С. 579-602.

3. Казаков С.П., Скворцов С.В., Изгородин А.С., Лешкина Г.В., Кушлинский Н.Е. Биохимические и иммунологические показатели в оценке аутоиммунных и гормональных нарушений у больных злокачественными и доброкачественными новообразованиями щитовидной железы // Клин. лаб. диагн. 2000. № 9. С. 4.

4. Скворцов С.В., Казаков С.П. Полимеразная цепная реакция в клинико-диагностической практике многопрофильных лечебных учреждений: Методические рекомендации. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2000. 50 с.

5. Кушлинский Н.Е., Казанцева И.А., Герштейн Е.С., Харитиди Т.Ю., Лякина Л.Т., Богатырев О.П., Казаков С.П., Смирнов В.В., Карпищенков В.И., Калинин А.П. Сравнительный анализ уровня активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибитора при заболеваниях щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2000. С. 61-62.

6. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С., Казанцева И.А., Харитиди Т.Ю., Казаков С.П., Лякина Л.Т., Богатырев О.П., Калинин А.П. Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибитор (PAI-1) в цитозольной фракции при заболеваниях щитовидной железы // Вестн. АМН. 2001. № 5. С. 32-34.

7. Казаков С.П., Харидити Т.Ю., Кибалко Е.И., Казанцева И.А., Кушлинский Н.Е. Динамика изменения количества сериновых протеаз и их ингибитора при злокачественных новообразованиях щитовидной железы // Матер. юбил. науч.-практ. конф.: Современная специализированная амбулаторно-поликлиническая помощь в Московском регионе. М.: 9 Поликлиника Московского гарнизона МВО МО РФ, 2001. С. 60-62.

8. Казаков С.П., Харидити Т.Ю., Казанцева И.А., Кушлинский Н.Е. Сериновые протеазы при доброкачественных и неонкологических заболеваниях щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Клиническая и экономическая эффективность современных медицинских технологий, методов диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2001. С.107.

9. Харитиди Т.Ю., Казанцева И.А., Герштейн Е.С., Казаков С.П., Смирнов В.В., Карпищенко А.И., Калинин А.П., Кушлинский Н.Е. Активаторы плазминогена урокиназ-ного (uPA) и тканевого (tPA) типа и их ингибитор (PAI-1) при заболеваниях щитовид-ной железы // Матер. всерос. науч. конф.: Биохимия - медицине. СПб., 2002. С. 93-94.

10. Владимиров В.Г., Карпищенко А.И., Скворцов С.В., Казаков С.П., Шарова Л.А., Трофимов Д.Ю., Мальков И.Г. Молекулярно-биологические методы исследова-ний в клинической лабораторной практике // В кн.: Медицинские лабораторные техноло-гии - программы и алгоритмы / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб, 2002. Т. 2. С. 533-555.

11. Казаков С.П., Харидити Т.Ю. Динамика уровней ингибитора и активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа при новообразованиях щитовидной железы // Матер. юбил. науч.-практ. конф.: Актуальные вопросы клинической и военно-морской медицины. Московская область, г. Железнодорожный, п/о Купавна: 32 ЦВМКГ, 2003. С. 92-94.

12. Казаков С.П., Харидити Т.Ю., Кушлинский Н.Е. Изменение уровней ингибитора и активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа при злокачественных и доброкачественных опухолях щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2003. С. 183-184.

13. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Оценка некоторых иммунологических и био-химических показателей у больных с онкологическими и аутоиммунными заболевани-ями щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2003. С. 181-183.

14. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Частота мутаций гена р53 в тканях солидных опухолей при злокачественных и доброкачественных новообразованиях щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Комбинированная и сочетанная патология: проблемы диагностики и лечения. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2003. С. 180-181.

15. Казаков С.П., Скворцов С.В., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Динамика цитокинов у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Матер. 3-го съезда онкологов СНГ. Минск, 2004. Ч. 2. С. 28.

16. Казаков С.П., Федосюк А.М., Анфилов С.В., Коржиков А.В., Лапшин И.М., Кушлинский Н.Е. Изучение экспрессии маркеров CD95, p53, bcl-2 и Ki-67 у больных аутоиммунной патологией и новообразованиями щитовидной железы // Мед. иммунол. 2004. № 3-5. С. 296-297.

17. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Исследование сочетанных параметров апоптоза и пролиферации в тканях щитовидной железы у больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями // Мед. иммунол. 2004. № 3-5. С. 362-363.

18. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Исследования комбинационных параметров пролиферации и апоптоза в тканях больных с новообразованиями щитовидной железы // Клин. лаб. диагн. 2004. № 9. С. 8.

19. Казаков С.П., Скворцов С.В., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Oценка иммуно-логической реактивности больных с онкологическими и аутоиммунными заболевания-ми щитовидной железы // Матер. 3-го съезда онкологов СНГ. Минск, 2004. Ч. 2. С. 27,28.

20. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е. Оценка маркеров FAS-системы, пролиферации и апоптоза у больных аутоиммунными и онкологическими заболеваниями щитовидной железы // Клин. лаб. диагн. 2004. № 9. С. 8-9.

21. Шебанкова В.Н., Казаков С.П., Сухоруков А.Л., Скворцов С.В., Кушлинский Н.Е. Сравнительная характеритика интерлейкинов IL-1-в, IL-6, IL-10 и TNF-б у больных с новообразованиями и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Мед. иммунол. 2004. № 3-5. С. 371.

22. Казаков С.П., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А., Джабаров А.К., Кушлинский Н.Е. Сравнительный анализ содержания интерлейкинов (ИЛ-1-в, ИЛ-6, ИЛ-10) в плазме крови больных аутоиммунным тиреоидитом, аденомой и раком щитовидной железы // Матер. 3-го Всерос. тиреоидол. конгр.: Диагностика и лечение узлового зоба. М., 2004. С. 152-153.

23. Kazakov S.Р., Кushlinsky N. Ye. Сytokin`s level IL-1в, IL-6, IL-10 and TNF- from patients with autoimmune and oncology thyroid diseases // «Cytokines in Cancer and Immunity» - Tenth Joint Meeting of the International Cytokine Society (ICS) and the International Society for Interferon and Cytokine Research (ISICR). San Juan, Puerto Rico. October 21-25, 2004. P. 322.

24. Казаков С.П., Скворцов С.В., Шебанкова В.Н., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Динамика интерлейкинов IL-1в, IL-6, IL-10 и TNF- у больных с онкологической и аутоиммунной патологией щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Актуальные проблемы клинической онкологии. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2005. С. 33-34.

25. Казаков С.П., Серяков А.П., Харидити Т.Ю., Кушлинский Н.Е. Изменение уровней ингибитора и активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа при злокачественных и доброкачественных опухолях щитовидной железы // Матер. VI Всерос. съезда онкол.: Современные технологии в онкологии. Ростов-на-Дону, 2005. Т. 2. С. 39-40.

26. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А. Иммунологическая реактивность больных раком и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Матер. XII Российского нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2005. С. 130-131.

27. Казаков С.П., Серяков А.П., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Мутации гена р53 в тканях щитовидной железы при злокачественных и доброкачественных новообразованиях // Матер. VI Всерос. съезда онкол.: Современные технологии в онкологии. Ростов-на-Дону, 2005. Т. 2. С. 38-39.

28. Казаков С.П., Анфилов С.В., Лапшин И.М., Федосюк А.М., Кушлинский Н.Е. Сочетанные параметры апаптоза и пролиферации в тканях щитовидной железы у больных с онкопатологией // Матер. науч.-практ. конф.: Актуальные проблемы клинической онкологии. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2005. С. 31-33.

29. Казаков С.П., Серяков А.П., Сухоруков А.Л., Кушлинский Н.Е. Уровень цитокинов у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Матер. VI Всерос. съезда онкол.: Современные технологии в онкологии. Ростов-на-Дону, 2005. Т. 2. С. 40-41.

30. Казаков С.П., Федосюк А.М., Анфилов С.В., Лапшин И.М., Кушлинский Н.Е. Экспрессия маркеров CD95, p53, bcl-2 и Ki-67 у больных с аутоиммунной и онкологической патологией щитовидной железы // Матер. науч.-практ. конф.: Актуальные проблемы клинической онкологии. М.: ГВКГ им. Н.Н. Бурденко, 2005. С. 34-35.

31. Казаков С.П., Кушлинский Н.Е., Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А. Экспрессия некоторых маркеров апоптоза и пролиферации при раке и аденоме щитовид-ной железы // Матер. XII Российского нац. конгр.: Человек и лекарство. М., 2005. С. 130.

32. Kazakov S.Р., Кushlinsky N.Ye. Main parametrs expression of apoptosis and prolifiration in oncology thyroid diseases // First Joint Meeting of European National Societies of Immunology Under the auspices of EFIS and 16th European Congress of Immunology - ECI - September 6-9, 2006. Paris, France. P. 547.

33. Kazakov S.Р., Кushlinsky N.Ye. The investigation of CD 95, p53, bcl-2 and Ki-67 markers in autoimmune thyroid pathology patients // First Joint Meeting of European National Societies of Immunology Under the auspices of EFIS and 16th European Congress of Immunology - ECI - September 6-9, 2006. Paris, France. P. 547.

34. Kazakov S.Р., Кushlinsky N.Ye. Some well-known parametrs expression of apoptosis in thyroid cancer // 17th IFCC - FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 60th National Congress of the Netherlands Society for Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (NVKC), 3-7 June 2007, Amsterdam / Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2007. Vol. 45 (special Suppl.). Р. S326.

35. Kazakov S.Р., Кushlinsky N. Ye. Аpoptosis and proliferation markers in thyroid tissue of oncology patients // IFCC - WorldLab Fortaleza 2008, 28 Sep-2 Oct 2008, Brasil / Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2008. Vol. 46 (special Suppl.). Р. S404-405.

36. Казаков С.П. Исследование динамики цитокинов, молекул адгезии и их соотношения в диагностике аутоиммунных заболеваний, злокачественных и доброкачественных новообразований щитовидной железы // Мед. иммунол. 2009. № 4-5. С. 367-368.

37. Казаков С.П., Заботина Т.Н., Кушлинский Н.Е. Роль тканевых маркеров апоптоза и пролиферации в дополнительной дифференциальной диагностике папиллярного и фолликулярного рака щитовидной железы // Военно-медицинский журнал. 2010. № 7. С. 48-50.

38. Казаков С.П., Заботина Т.Н., Короткова О.В., Джабаров А.К, Казанцева И.А., Кушлинский Н.Е. Сравнительный анализ клеток с комбинированными маркерами апоптоза и пролиферации в образцах тканей щитовидной железы при раках, аденомах и аутоиммунных заболеваниях // Бюл. экспер. биол. и мед. 2010. Том. 150, № 10. С. 427-432.

Размещено на Allbest.ru