Статеві відмінності h2s-ініційованої вазодилятації аорти за умов ппергомоцистеїнемії

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 546.221.1: 577.112.386: 611.13

Вінницький національний медичний університет імені М. І. Пирогова (м. Вінниця)

Статеві відмінності h2s-ініційованого вазодилятації аорти за умов ппергомоцистеїнемії

Мельник А. В., Заічко Н. В.

anderneting@gmail.com

Резюме

гіпергомоцистеїнемія вазодилятація аорта гомоцистеїн

УДК: 546.221.1: 577.112.386: 611.13

Статеві відмінності н^-ініційованої вазодилятації аорти за умов ппергомоцистеїнемії

Мельник А. В., Заічко Н. В.

Досліджено вплив гіпергомоцистеїнемії (ГГЦ) на ініційовану гідроген сульфідом (H₂S) вазодилятацію аорти у самців та самок щурів. Встановлено, що у самців чутливість аорти до И₂3-індукованої вазодилятації вірогідно менша, ніж у самок. Введення тіолактону гомоцистеїну (100 мг/кг 28 діб інтрагастрально) викликає достовірне зменшення И₂3-індукованої вазодилятації аорти у щурів обох статей, причому у самців вказані зміни були більш виразними. На тлі ГГЦ відмічається поглиблення статевих відмінностей чутливості аорти до вазодилятуючої дії H₂S.

Ключові слова: гомоцистеїн, гідроген сульфід, аорта, вазодилятація.

Резюме

УДК: 546.221.1: 577.112.386: 611.13

Половые различия неинициированной вазодилятации аорты при гипергомоцистеинемии²

Мельник А. В., Заичко Н. В.

Исследовано влияние гипергомоцистеинемии (ГГЦ) на инициированную гидроген сульфидом (H₂S) вазодилятацию аорты у самцов и самок крыс. Установлено, что у самцов чувствительность аорты к И^-индуцированной вазодилятации достоверно меньше, чем у самок. Введение тиолактона гомоцистеина (100 мг/кг 28 суток интрагастрально) вызывает достоверное уменьшение И^-индуцированной вазодилятации аорты у крыс обоего пола, причем у самцов указанные изменения были более выраженными. На фоне ГГЦ отмечается усиление половых различий чувствительности аорты к вазодилятирующему действию H₂S.

Ключевые слова: гомоцистеин, гидроген сульфид, аорта, вазодилятация.

Abstract

UDC: 546.221.1: 577.112.386: 611.13

Sex differences of h₂s-initiated aorta vasodilatation in conditions of hyperhomocysteinemia

Melnyk A. V., Zaichko N. V.

Hyperhomocysteinemia is a recognized independent risk factor for vascular diseases and is implicated in pathological vascular remodeling, activation of systemic inflammation, thrombogenesis, and so on. Among the pathophysiological mechanisms of endotheliotoxic action of high concentrations of homocysteine there are hypomethylation, oxidative stress, homocysteinylation of proteins, endoplasmatic-reticular stress etc.

It is known, that the regulation of vascular tone is significantly different in individuals of different sex, for the most part it is determined by the different biological effects of testosterone and estrogen. However, the sexual features of hyperhomocysteinemia influence on vascular tone remain unexplored.

The aim of the study is to evaluate the influence of hyperhomocysteinemia on H₂S-initiated vasodilation of aorta in male and female rats.

The experiments were performed on 40 white laboratory rats of both sexes weighing 220-280 g. The model of hyperhomocysteinemia was created by introducing of thiolactone D, L-homocysteine (Sigma, USA) intraperitoneally at a dose of 100 mg/kg on 1% starch solution, 1 time a day during 28 days. Registration of contractility of thoracic aorta circular fragments was performed in a model system in vitro.

First, we evaluated H₂S-stimulated relaxation of aortic rings in male and female rats. It turned out that in the males H₂S concentrations of 1 цМ, 10 цМ, 100 цМ and 1000 цМ caused a dose-dependent relaxation of circular fragments of aorta, respectively by 5,93±0,58%; 10,9±0,69%; 29,6±1,23% and 57.0±1,10%. At the same time, females have a relaxation of the aortic rings in these concentrations of H₂S was greater and was accordingly 6,39±0,24%; 12,7±0,65%; 34,7±1,49% (р<0,05) and 61.5±0,54% (р<0,05). Under these conditions ЕС₅₀ H₂S in aorta in males was 94,1±4,28 цМ and in females was by 21,5% (р<0,05) less and was 73,9±4,35 цМ.

Hyperhomocysteinemia is accompanied by a reliable decrease in H₂S-induced relaxation of aorta in male and female rats. In males relaxation of aortic rings under the indicated concentration of H₂S was less by 24,5; 35,2; 63,2 and 29,3% (р<0,05), and of ЕС₅₀ H₂S in aorta more by 32,8% (р<0,05) than in the control group. At the same time, in females hyperhomocysteinemia caused less pronounced changes of H₂S-induced relaxation: reduction of relaxation of circumferential aortic fragments in these concentrations of H₂S was 12,8; 16,5; 14,7 and 9,4% (р<0,05), and increase of ЕС₅₀ H₂S in aorta 21,1% (р<0,05) compared to the control group.

Clarification of molecular mechanisms of sex differences in the regulation of vascular tone under conditions of hyperhomocysteinemia will allow to develop approaches for effective correction of the vascular pathology associated with impaired metabolism of sulfur-containing amino acids in individuals of different sexes.

It is established that in males the sensitivity of aorta to H₂S-induced vasodilatation is significantly lower than in females. Introduction to thiolactone homocysteine (100 mg/kg during 28 days, intragastrically) causes significant decrease in H₂S-induced vasodilatation of aorta in rats of both sexes, and in males these changes were more expressive. On the background of hyperhomocysteinemia there are sex differences in sensitivity of aorta to vasodilatory action of H₂S.

Keywords: homocysteine, hydrogen sulfide, aorta, vasodilatation.

Робота виконується в рамках планової НДР кафедри біологічної та загальної хімії Вінницького національного медичного університету імені М. І. Пирогова «Вплив екзогенних та ендогенних чинників на обмін гідрогенсульфіду та асоційованих з ним метаболічних процесів в нормі та при патології» (№ державної реєстрації 0113U006461).

Гіпергомоцистеїнемія є загальновизнаним незалежним фактором ризику судинних захворювань та причетна до патологічного ремоделювання судин, активації системного запалення, тромбоутворення, тощо [1,8]. Серед патофізіологічних механізмів ендотеліотоксичної дії високих концентрацій гомоцистеїну виділяють гіпометилування, оксидативний стрес, гомоцистеїнування протеїнів, ендоплазматично-ретикулярний стрес та ін. [8].

Відомо, регуляція судинного тонусу істотно відрізняється у особин різної статі, що по більшій мірі визначається різними біологічними ефектами тестостерону та естрогенів [9]. Так, естрогени посилюють утворення вазодилятаторів, зокрема простациклінів, але гальмують продукцію констрикторних молекул ендотеліну-1, лейкотрієнів, катехоламінів. Однак, статеві особливості впливу гіпергомоцистеїнемії на тонус судинної стінки залишаються невивченими.

Мета дослідження оцінити вплив гіпергомоцистеїнемії на скоротливість кільцевих фрагментів аорти у самців та самок щурів.

Об'єкт і методи дослідження. Досліди проведені на 40 білих лабораторних щурах обох статей масою 220-280 г Тварини перебували в стандартних умовах з природнім світловим режимом день/ніч, воду і корм отримували ad libitum. Тварин годували

напівсинтетичною крохмально-казеїновою дієтою із збалансованим вмістом всіх макрота мікронутрієнтів. Дослідження проведено за загальними етичними принципами експериментів на тваринах згідно Першого національного конгресу України з біоетики (Київ, 2001) та «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1986).

Модель гіпергомоцистеїнемії створювали шляхом введення тіолактону D, L-гомоцистеїну (Sigma, США) внутрішньошлунково в дозі 100 мг/кг маси на 1% розчині крохмалю 1 раз на добу протягом 28 діб [5]. Знеживлювали тварин методом декапітації під пропофоловим наркозом («Fresenius Kabi» 60 мг/кг внутрішньочеревинно).

Вміст H₂S в аорті визначали за методикою [3]. Рівень гомоцистеїну в сироватці крові визначали за набором «Homocysteine EIA» (Axis-Shield, Англія).

Реєстрацію скоротливості кільцевих фрагментів грудної аорти проводили в модельній системі in vitro. Ізольовані фрагменти стінок аорти завширшки 2-3 мм вміщували в тефлонову камеру, розтягували на сталевих гачках та витримували протягом 60 хв. в ізометричному режимі під постійним навантаженням 0.015-0.02 Н, суперфузуючи стандартним оксигенованим буферним розчином Кребса з постійною швидкістю 2.5-3.0 мл/хв [2]. Тонічне скорочення препаратів викликали з використанням аплікацій гіперкалієвого розчину Кребса (концентрація KCl 80 мМ) протягом 30 хв. Ендотелійзалежну вазодилятацію оцінювали за ступенем ізометричного розслаблення досліджуваних фрагментів судин під впливом ацетилхоліну (10⁶М), попередньо скорочених розчином а₁-агоніста адренорецепторів фенілефрином (10^-6М). Для оцінки Н^-стимульованого розслаблення ізольовані фрагменти аорти, передскороченої фенілефрином (10^-6М), перфузували розчинами, що містили одночасно фенілефрин (10^-6М) та Н^ в різних концентраціях (10^-3-10^-6М), протягом 15 хв. кожний з наступною реєстрацією змін ізометричного напруження. Реєстрацію скорочувальної активності проводили із застосуванням механотронного датчика та багатофункціонального аналогово-цифрового перетворювача USB-600-8/6009 («National Instruments», США), з'єднаного з персональним комп'ютером.

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програми SPSS Statistica 17.0. Характер розподілу визначали за допомогою критерію Колмогорова-Смірнова. Достовірність різниці між показниками оцінювали за параметричним t-критерієм Стьюдента (при нормальному розподілі) та непараметричним U-критерієм Манна-Уітні (при невідповідності нормальному розподілу). Для визначення зв'язків між показниками проводили кореляційний аналіз за Пірсоном. Вірогідними вважали дані при р<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення. Показано (табл.), що 28-денне застосування тіолактону гомоцистеїну супроводжується збільшенням рівня гомоцистеїну в сироватці крові та зменшення вмісту гідроген сульфіду в аорті у самців відповідно на 111 та 31,4% (р<0,05), а у самок на 82,4 та 20,0% (р<0,05), порівняно з контролем. За цих умов поглиблювались статеві відмінності рівнів гомоцистеїну в сироватці крові та гідроген сульфіду в аорті. Так, у самців в групі контролю вміст гомоцистеїну в сироватці крові був більшим, а рівень гідроген сульфіду в аорті меншим на 18,9 та 27% (р<0,05), ніж у самок, в той час як у самців з гіпергомоцистеїнемією на 29,9 та 48,2% (р<0,05), відповідно.

Таблиця. Вплив гіпергомоцистеїнемії на рівень гомоцистеїну в сироватці та вміст H₂S в аорті щурів обох статей (M±m, n=10)

Примітки:

1. * статистично достовірна відмінність (p<0,05) відносно відповідної групи контролю;

2. ° статистично достовірна відмінність (p<0,05) між самцями та самками в межах групи.

Далі ми оцінили H^-стимульоване розслаблення кілець аорти у самців та самок щурів та його зміни за умов ГГЦ (рис. 1). Виявилось, що у самців H₂S в концентраціях 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ та 1000 мкМ викликав дозозалежне розслаблення кільцевих фрагментів аорти відповідно на 5,93±0,58%; 10,9±0,69%; 29,6±1,23% та 57,0±1,10%. В той же час у самок розслаблення кілець аорти за цих концентрацій H₂S було більшим і становило відповідно 6,39±0,24%; 12,7±0,65%; 34,7±1,49% (р<0,05) та 61,5±0,54% (р<0,05), крива «доза-ефект» зміщувалась ліворуч, відносно такої у самців. За цих умов

Рис. 1. Дозозалежність И^-стимульованого розслаблення кільцевих фрагментів аорти у самців та самок щурів.

Примітка. На цьому та наступному рисунку по осі абсцис десятковий логарифм концентрації H₂S (М) у перфузійному розчині, по осі ординат нормована інтенсивність розслаблення кільцевих фрагментів аорти під впливом зростаючих концентрацій H₂S. За 100% прийнятий рівень Н₂Б-стимульованого розслаблення фрагментів аорти, який по амплітуді відповідає максимальному значенню фенілефрин-індукованого передскорочення. Наведені усереднені дані 4 дослідів і значення похибок середнього.

Рис. 2. Вплив ГГЦ на дозозалежність И₂в-стимульованого розслаблення кільцевих фрагментів аорти у самців (А) та самок (Б) щурів.

ЕС₅₀ H₂S в аорті у самців становила 94,1±4,28 мкМ, а у самок була на 21,5% (р<0,05) меншою і становила 73,9±4,35 мкМ.

ГГЦ супроводжується вірогідним зменшенням H₂S-стимульованого розслаблення аорти у самців та самок щурів (рис. 2). У самців розслаблення кілець аорти за вказаних концентрацій H₂S було меншим на 24,5; 35,2; 63,2 та 29,3% (р<0,05), а ЕС₅₀ H₂S в аорті більшою на 32,8% (р<0,05), ніж в контролі. В той же час у самок ГГЦ викликала менш виразні зміни H₂Sіндукованої релаксації: зменшення розслаблення кільцевих фрагментів аорти за цих концентрацій H₂S становило 12,8; 16,5; 14,7 та 9,4% (р<0,05), а збільшення ЕС₅₀ H₂S в аорті 21,1% (р<0,05), порівняно з контролем. За умов ГГЦ поглиблюються статеві відмінності H₂S-стимульованої вазодилятації аорти. Так, в групі контролю у самців ЕС₅₀ H₂S в аорті була вищою на 27,3% (р<0,05). а в групі ГГЦ на 39,7% (р<0,05), ніж у самок.

Кореляційний аналіз показав, що рівні гомоцистеїну в крові та H₂S в аорті є важливими чинниками, які детермінують статеві відмінності H₂S-стимульованої вазодилятації аорти та їх поглиблення на тлі ГГЦ. В контрольній групі тварин між ЕС₅₀ H₂S в аорті та рівнем гомоцистеїну в крові виникають статистично достовірні прямі зв'язки (r=0,66 та 0,64 відповідно у самців та самок, р<0,05), а з вмістом H₂S в аорті обернені кореляції (r=-0,70 та -0,68 відповідно у самців та самок, р<0,05). В той же час, на тлі ГГЦ відмічається вірогідне посилення асоціативних зв'язків ЕС₅₀ H₂S в аорті з рівнем гомоцистеїну в крові (r=0,70 та 0,66 відповідно у самців та самок, р<0,05), а також з вмістом H₂S в аорті (r=-0,75 та -0,71 відповідно у самців та самок, р<0,05).

Проведені дослідження засвідчили, що у самців чутливість аорти до H₂S-стимульованого розслаблення є вірогідно меншою, ніж у самок. ГГЦ чинить депримуючий вплив на H₂S-індуковану релаксацію аорти у щурів обох статей, причому у самців вказані зміни більш виразні. За цих умов відмічається поглибленням статевих відмінностей чутливості аорти до дії H₂S. Кореляційний аналіз надав докази того, щопевну роль у виникненні статевого диморфізму H₂Sстимульованого розслаблення кілець аорти відіграє різний рівень гомоцистеїну в крові та H₂S в аорті у самців та самок.

Виникає питання щодо механізмів, інтегрованих у формування статевих відмінностей різної чутливості аорти до дії H₂S та їх поглиблення на тлі ГГЦ. Як відомо, основною молекулярною мішенню через яку реалізується вазодилятуюча дія H₂S в аорті є К_АТф-канали [10,11]. Одним із шляхів регуляції К_АТфканалів є їх окисна модифікація [11]. Між тим, активність процесів вільнорадикального окиснення є вірогідно більшою у особин чоловічої статі [4]. Тому, не виключено, що статеві відмінності процесів пероксидації є однією із причин різної чутливості аорти до вазодилятуючої дії H₂S у самців та самок.

Очевидно, певну роль у формуванні сексспецифічної чутливості аорти до H₂S-індукованої вазодилятації та її поглиблення на тлі ГГЦ відіграє різний рівень гомоцистеїну в крові та гідроген сульфіду в аорті у самців та самок щурів. Відомо, що гомоцистеїн може ініціювати генерацію вільних радикалів, тоді як гідроген сульфід є антиоксидантом [6,7,8]. Поряд з цим, у самців рівень гомоцистеїну в крові є вірогідно більшим, а гідроген сульфіду в міокарді меншим, ніж у самок, що є ймовірною причиною більшої активності вільнорадикального окиснення та меншої чутливості аорти до дії H₂S у особин чоловічої статі. На тлі ГГЦ суттєво збільшуються відмінності вмісту гомоцистеїну та гідроген сульфіду між самцями та самками, що є одним із чинників поглиблення статевого диморфізму H₂S-індукованої вазодилятації аорти.

Висновки

У самців чутливість аорти до H₂S-індукованої вазодилятації вірогідно менша, ніж у самок: ЕС50 H2S в аорті у самок на 21,5% менша, порівняно з самцями (р<0,05).

ГГЦ супроводжується депримуючою дією на H₂S-індуковану вазодилятацію аорти у щурів обох статей, однак більш виразні зміни виникають у самців: збільшення ЕС₅₀ H₂S в аорті у самців становить 32,8%, а у самок 21,1%, відносно контролю (р<0,05).

Перспективи подальших досліджень. дозволить розробити підходи до ефективної корекції

Уточнення молекулярних механізмів статевихсудинної патології, асоційованої з порушенням відмінностей регуляції судинного тонусу за умов ГГЦобміну сірковмісних амінокислот, у осіб різної статі.

Література

1. Андрушко І.І. Біохімічні порушення в крові, міокарді і судинній стінці в умовах експериментальної гіпергомоцистеїнемії, їх патогенетичне значення та можливості фармакологічної корекції / І.І. Андрушко, А.П. Король, ТВ. Талаєва // Кровообіг та гемостаз. 2011. № 3-4. С. 52-58.

2. Ткаченко М.М. Вікові особливості змін скорочувальних судинних реакцій і вміст вільних радикалів кисню та метаболітів оксиду азоту у мишей лінії BALB/c за умов перебування у зоні відчуження / М.М. Ткаченко, В.Ф. Сагач, О.В. Базілюк // Фізіолог. журн. 2005. Т 51, № 3. С. 32-41.

3. Carvedilol induces endogenous hydrogen sulfide tissue concentration changes in various mouse organs / B. Wiliaski, J. Wiliaski, E. Somogyi [et al.] // Folia Biol (Krakow). 2011. Vol. 59, № 3-4. Р 151-155.

4. Effect of gender and sex hormones on vascular oxidative stress / A.A. Miller, T.M. De Silva, K.A. Jackman, C.G. Sobey // Clin Exp Pharmacol Physiol. 2007. Vol. 34, № 10. P 1037-1043.

5. Homocysteine thiolactone-induced hyperhomocysteinemia does not alter concentrations of cholesterol and SREBP-2 target gene mRNAS in rats / G.I. Stangl, K. Weisse, C. Dinger [et al.] // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2007. Vol. 232, № 1. Р 81-87.

6. Kimura H. Hydrogen sulfide is a signaling molecule and a cytoprotectant / H. Kimura, N. Shibuya, Y Kimura // Antioxid Redox Signal. 2012. Т 17, № 1. P 45-57.

7. Kimura Y Hydrogen sulphide increases glutathione production and suppresses oxidative stress in mitochondria / Y Kimura, YI. Goto, H. Kimura // Antioxidants and Redox Signaling. 2010. Т 12, № 1. Р 1-13.

8. Lai W.K. Homocysteine-Induced Endothelial Dysfunction / W.K. Lai, M.Y Kan // Ann Nutr Metab. 2015. Vol. 67, № 1. Р 1-12.

9. Non-genomic vascular actions of female sex hormones: physiological implications and signalling pathways / S.W. Leung, H. Teoh, W. Keung [et al.] // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2007. Vol. 34 (8). P 822-826.

10. Role of Hydrogen Sulfide and Sulfur-Containing Amino Acids in Regulation of Tone of Smooth Muscles of the Vascular Wall in Rats / A.V. Mel'nik, N.I. Voloshchouk, N.O. Pentyuk, K.O. Zaichko // Neurophysiology. 2010. Vol. 42, № 2. Р 126-131.

11. Tang G. Interaction of hydrogen sulfide with ion channels / G. Tang, L. Wu, R. Wang // Clin Exp Pharmacol Physiol. 2010. Т 37, № 7. P 753-763.

Рецензент проф. Непорада К. С.

Стаття надійшла 09.02.2017 року

Размещено на Allbest.ru