60

Размещено на http://www.allbest.ru/

95

Система комплексного исследования признаков человека на основе результатов анализа элементного состава костной ткани

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Крымова Татьяна Георгиевна

МОСКВА - 2008

Работа выполнена в 111 Главном государственном центре судебно-медицинских и криминалистических экспертиз Министерства обороны Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессорВ.В. Колкутин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, ГУ ГНЦ РАМНБ.Е. Мовшев

доктор биологических наук, ФГУЗ ВЦЭРМ

им.А.М. Никифорова МЧС России Н.Н. Зыбина

доктор биологических наук, 16 ГЦСМиКЭ СКВОИ.В. Корниенко

Ведущая организация:

Военно-медицинская академия им.С.М. Кирова, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится "____"__________2008 г. в _____часов на заседании диссертационного совета Д 001.042.02 в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук (Москва, 125167, Новый Зыковский проезд, 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН.

Автореферат разослан "____" __________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета кандидат медицинских наук

Е.Е. Зыбунова

Общая характеристика работы

Апробация работы и внедрение результатов. О результатах работы было доложено в 2004 году на Научно-практической конференции, посвященной 60-летию образования органов судебно-медицинской экспертизы Вооруженных Сил Российской Федерации (Москва); в 2005 году на Научно-практической конференции судебно-медицинских экспертов, посвященной 60-летию образования государственных судебно-экспертных учреждений Министерства обороны Российской Федерации на территории Приволжко-Уральского военного округа (Самара); в 2005 году - на заседании межрегиональной ассоциации "Судебные медики Сибири" (Новосибирск); в 2007 году на семинаре 111 Главного государственного центра судебно-медицинских и криминалистических экспертиз МО РФ (Москва). Результаты работы внедрены в практику судебно-экспертных учреждений Министерства обороны Российской Федерации

Результаты исследования были использованы в научно-исследовательской работе "Исследование возможности создания системы идентификации личности на основе результатов анализа элементного состава костной ткани", а также при подготовке тактико-технического задания на опытно-конструкторскую работу (ОКР)"Создание программно-технического комплекса идентификации личности на основе результатов анализа элементного состава костной ткани" (Приложение X диссертации), работа включена в Гособоронзаказ 2006 года (на 2007-2010 г. г.) и выполняется в настоящее время.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 49 статей и 1 сборник трудов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 2-х томов; 1-й том включает: введение, четыре главы, заключение, список литературы из 511-и наименований, в том числе 177 иностранных авторов, содержит 266 страниц, в том числе 51 таблицу и 31 рисунок на 65-ти страницах; 2-й том включает 17 приложений, содержит 166 страниц, в том числе 33 таблицы и 9 рисунков на 109 страницах.

Материалы исследования

В качестве исследуемого материала в работе использовалась костная ткань трупов и зубы живых лиц.

1-я группа образцов: костная ткань, полученная в результате судебно-медицинского вскрытия трупов - по шесть фрагментов середины диафизов трубчатых костей (правое и левое бедро - ПБ, ЛБ; правая и левая голень - ПГ, ЛГ; правое и левое плечо - ПП, ЛП) от 94 трупов с известными медико-биологическими данными, из них: мужчин - 80, женщин - 14; возраст от 30 до 82 (до 50 лет - 37, старше 50 лет - 57); национальность: русские - 88, украинцы - 3, евреи - 2, цыгане - 1; регион проживания в последние 10 лет до смерти: г. Самара - 85, Астраханская область - 9. Всего исследовано 564 пробы.

2-я группа образцов: зубы живых лиц, удаленные у людей, проживающих в Хабаровском крае, Астраханской области, Калмыкии и г. Самара, представляющих три геохимические провинции (Астраханская область и Калмыкия образуют единую геохимическую провинцию). Всего 33 образца, в том числе: мужчин - 15, женщин - 17; образец № 9 (м) был представлен двумя зубами, удаленными из верхней и нижней челюсти мужчины с правой стороны; возраст от 18 до 69 лет; расовая принадлежность: европеоиды - 25; монголоиды - 7; этническая принадлежность: русские - 25; калмыки - 7; регион проживания в последние 10 лет жизни: Хабаровский край - 9; Астраханская область - 7; Калмыкия - 7; г. Самара - 9.

Медико-биологические данные для каждого образца 1-й и 2-й групп заносились на специально разработанные автором бланки - "карты признаков", включали: результаты судебно-медицинского вскрытия трупов (1-я группа), данные анамнеза жизни, стоматологического анамнеза (2-я группа) и описания медико-биологических признаков.

3-я группа образцов: фрагменты верхней трети диафиза большеберцовой кости практически без губчатого вещества из могильников различных сроков захоронения, отбиравшиеся с различных территорий бывшего Советского Союза и представляющие различные природно-климатические зоны, расовые типы и этнические группы (материалы базовых коллекций института Археологии Российской Академии наук и Московского государственного университета). В том числе: мужчин - 375, женщин - 258, пол не определен - 15; возраст 10-15лет - 9; 16-19 лет - 3; 20-29 лет - 165; 30-39 лет - 37; 40-49 лет - 279; 50-55 лет - 79; более 55лет - 76 человек. Всего 648 образцов. В работе использовались архивные данные о концентрациях элементов в субфассильной костной ткани из этих коллекций.

Методы исследования

Элементный анализ образцов 1-й группы (свежая костная ткань) проводился методом лазерной масс-спектрометрии (ЛМС) во ВНИИИМТ МЗ РФ (отдел токсикологических испытаний и исследования материалов и изделий медицинской техники) на лазерном масс-спектрометре, с двойной фокусировкой излучения ЭМАЛ-2. При этом использовалась известная методика безэталонного анализа биологических проб (нативных образцов), высушенных до постоянной массы (Беняев Н. Е, Макеев Е.В., Лаппо В.Г., Крымова Т.Г., 2002). Регистрация спектров осуществлялась на фотопластинки типа ILFORD, расшифровка - с применением системы, сочетающей компьютер, денситометр и программу обработки.

Элементный анализ образцов 2-й группы (зубы живых лиц) проводился методом масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией проб в индуктивно связанной плазме (ICP MS) в Институте Минералогии, геохимии и кристаллохимии редких элементов (ИНГРЭ) на приборе ELAN 6100 DRC, производство фирмы Perkin Elmer. Для исследования была адаптирована методика, применяемая при анализе горных пород на содержание редких и редкоземельных элементов в кислотных растворах (Костицын Ю.А., Крымова Т.Г., 2004). Процедуры расшифровки спектров и определения содержаний полностью автоматизированы.

Изотопный анализ образцов 2-й группы проводился методом термо-ионизационной масс-спектрометрии с мультиколлектором (TIMS-MC) в лаборатории изотопной геохимии и геохронологии Института Геохимии и аналитической химии им.В.И. Вернадского (ГЕОХИ) РАН. Прибор - масс-спектрометр TIMS-MC фирмы Finnigan предназначен для анализа из твердой фазы. Поэтому основной проблемой разработки методики изотопного анализа было выделение исследуемых элементов в чистом виде в количестве от 0,1 до 0,5 мкг. Для получения образцов из кислотных вытяжек зубов применялись методики ионно-обменной колоночной хроматографии (Костицын Ю.А., Крымова Т.Г., 2004). Процедура определения изотопных соотношений полностью автоматизирована.

Элементный анализа образцов 3-й группы (субфассильная костная ткань) проводился методом атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС) в лаборатории атомной абсорбции МГУ старшим научным сотрудником группы физической антропологии Института археологии РАН, М.В. Добровольской. Прибор - атомно-абсорбционный спектрометр фирмы Hitachy 180-80. Для исследования была адаптирована методика, основанная на кислотном разложении сухих образцов кости человека по схеме, принятой в практике анализа неорганической составляющей почв (Аринушкина Е.В., 1970).

Для выполнения задач исследования нами были изучены также данные о концентрациях элементов в костной ткани и зубах из литературных источников по антропологии, археологии, токсикологии и судебной медицине, официальные материалы, регламентирующие проведение экспертизы идентификации личности; отечественные и зарубежные материалы, обобщающие опыт идентификации погибших в случаях массовой гибели людей в результате техногенных катастроф, вооруженных конфликтов, террористических актов; материалы отчетов 111 ГГЦСМиКЭ МО РФ, 124 ЦЛ МКИ МО РФ, отчетов по НИР, проводившихся в период с 1996 по 2002 г. г. для решения задач идентификации погибших, находившихся в 124 ЦЛМКИ МО РФ; отечественные и зарубежные материалы, характеризующие применение информационных технологий в решении задач идентификации личности; литературные источники (археологические) по реконструкции антропологических признаков и условий проживания людей, представленных костными останками, давностью захоронения от 100 до 4000 лет; литературные источники и технические материалы, характеризующие различные методы элементного анализа, виды аналитического оборудования и применение его для исследования концентраций химических элементов в небиологических и биологических образцах (с большой органической составляющей); литературные источники по применению методов математической обработки и статистических исследований данных; научно-исследовательские и диссертационные работы, касающиеся рассматриваемой проблемы.

Результаты элементного и изотопного анализа вводились в электронную базу данных, содержащую медико-биологические признаки исследуемых индивидов.

элементный состав костная ткань идентификация

Статистическая обработка результатов проводилась на PC-совместимом компьютере в операционной системе Windows 2000/XP/2003 с использованием пакетов программ “Statistica for Windows" (StatSoft) версии 5.0 и 6.0, программного обеспечения MS Excel 98 (Microsoft).

Объектами статистических исследований были следующие базы данных:

численные значения концентраций 16-ти химических элементов (F, Na, Mg, Al, Si, P, S, Cl, K, Ca, Fe, Cu, Zn Sr, Pb, а также суммарная концентрация легких элементов (H+C+N+O)) по 6 проб от 94 трупов, полученные методом ЛМС;

численные значения концентраций 45-ти химических элементов (Na, Mg, Al, K, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Rb, Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Cd, Cs, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Hf, Ta, W, Tl, Pb, Bi, Th, U) и 7-и изотопных соотношений (⁸⁷Sr/⁸⁶Sr; ⁸⁴Sr/⁸⁶Sr; ¹⁴³Nd/¹⁴⁴Nd; ²⁰⁶Pb/²⁰⁴Pb; ²⁰⁷Pb/²⁰⁴Pb; ²⁰⁸Pb/²⁰⁴Pb) для 33 человек, проживающих в Хабаровском крае, Астраханской области, Калмыкии и г. Самара, полученные, соответственно, методами ICP MS и TIMS-MC.

численные значения концентраций 8 химических элементов (Ca, Zn, Cu, Mn, Fe, Pb, Sr и Ni) для 439 скелетированных останков из археологических захоронений, полученные методом ААС. Для всего массива данных (648 объектов) определялись средние значения, дисперсии.

Для образцов, исследованных методами ЛМС и ААС, по всей базе данных выполнялся анализа отдельных значений на "выбросы" (контроль резко выделяющихся значений концентраций) и оценки факторов, влияющих на "анормальность" распределения концентраций элементов, он включал:

1) Расчеты средних значений концентраций для всей выборки по каждой кости (ПБ, ЛБ, ПГ, ЛГ, ПП, ЛП) - _ПБ, _ЛБ, _ПГ, _ЛГ, _ПП, _ЛП;

2) Расчеты значений дисперсий (среднее квадратичное отклонение) для каждой кости (ПБ, ЛБ, ПГ, ЛГ, ПП, ЛП) - _ПБ, _ЛБ, _ПГ, _ЛГ, _ПП, _ЛП.

3) Определение границы допустимости результатов исходя из 3. Эти границы составляют - 3 + 3 (для ПБ: _ПБ - 3_{ПБ ПБ} + 3_ПБ; для ЛБ: _ЛБ - 3_{ЛБ ЛБ} + 3_ЛБ; для ПГ:

_ПГ - 3_{ПГ ПГ} + 3_ПГ; и т.д.).

4) Применялось правило коррекции значений по всей базе данных при аномальных "выбросах". Если значение концентрации для данного человека и данной кости находится в пределах - + , то оно сохраняется. Если значение концентрации выходит за пределы соответствующих интервалов, то оно заменяется средним для кости. Эта процедуры проводится по всей базе данных.

5) После такой коррекции аномальных выбросов определялось среднее значение концентрации по шести костям (ПБ, ЛБ, ПГ, ЛГ, ПП, ЛП). Это среднее значение использовалось при проведении дискриминантного и нейросетевого анализа.

Осуществлялась проверка на однородность (один и тот же вид) и нормальность распределения численных значений концентраций для всех костей по каждому элементу, рассчитывались средние значения, ошибки средних значений, асимметрия (скошенность распределения), и эксцесс (островершинность).

Для установления конкретного вида связей использовались методы дискриминантного и факторного анализа, для элементов по преобразованным данным были построены дискриминантные функции и выявлены связи между признаками и элементным составом костной ткани. Для выявления связей между концентрациями отдельных элементов были построены корреляционные матрицы, получены коэффициенты корреляции, построены матрицы факторных нагрузок и выявлены связи между концентрациями отдельных элементов.

Для визуализации полученных результатов при исследовании пола и возраста использовалась программа, позволяющая свертывать многомерное пространство в двумерное при сохранении относительных расстояний между векторами измерений - карта Саммона.

В целях классификации объектов по полу, возрасту и росту с использованием концентраций 16 химических элементов применялась, кроме того, нейросетевая классифицирующая система на основе многослойной нейронной сети, разработанная И.Е. Шепелевым (Институт нейрокибернетики им.А.Б. Когана, г. Ростов-на-Дону).

Исследование территории происхождения (геохимический аспект) проводилось с применением двумерных диаграмм концентраций элементов, отношений элементов и изотопов, аналогичных тем, которые приняты для исследования горных пород. Это позволило сравнить распространенность элементов и изотопов, выявленных в зубной ткани с распространенностью их в горных породах соответствующих регионов.

Определение возможности дифференциации отдельных территорий проводилось в виде численного эксперимента с использованием дискриминантного анализа при различных наборах элементов и изотопных отношений.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование концентраций элементов в костной ткани

Исследование костной ткани методом ЛМС.

Методом ЛМС в образцах костной ткани (кортикальный слой кости) были определены содержания таких химических элементов как F, Na, Mg, Al, Si, P, S, Cl, K, Ca, Fe, Cu, Zn Sr, Pb, а также суммарная концентрация легких элементов (H+C+N+O). Диапазоны концентраций элементов, выявленных в костной ткани, по всем образцам представлены в таблице 1. Колебания величин концентраций показаны в последней колонке этой таблицы.

1) Ca, P и суммарная концентрация легких элементов (H, C, O, N), составляют основу кортикальной ткани. Содержание этих элементов в образцах хорошо согласуется с литературными данными (Ca: 35-39 % в кортикальном слое, P: 14 % и H+C+O+N: 54 % - в скелете) и может изменяться в 1,5 - 3 раза.

Содержание макроэлементов F, Na, Mg, S, Cl, K, Sr, колеблется в пределах одного порядка, в основном, в 10-20 раз, причем верхние границы концентраций находятся на уровне единиц или десятых долей масс. %, а нижние границы - на уровне десятых или сотых долей масс. %.

Содержание микроэлементов (Al, Si, Fe, Cu, Zn и Pb) в кортикальной ткани может колебаться в пределах 1-2-х порядков, при этом, верхние границы концентраций находятся на уровне сотых, а нижние границы - на уровне тысячных и десятитысячных долей масс. %.

Колебания концентраций химических элементов в костной ткани могут объясняться многими причинами. Прежде всего, они зависят от биологических свойств объектов исследования (пол, возраст, длина тела, территория проживания, заболевания, другие признаки трупа) и проявляются в виде нормального физиологического разброса содержаний элементов в кости. За пределами физиологического разброса колебания концентраций химических элементов зависят от метода анализа, отдельных стадий аналитического цикла и ошибок измерения.

2) Нижние уровни содержания элементов в костной ткани достаточно точно коррелируют с данными литературы. Верхние границы концентраций элементов в костной ткани (таблица 2), превышают концентрации, приведенные в литературных источниках в 5-100 раз, что может быть связано, во-первых, с тем, что литературные данные получены методами ААС и ЭСА. Занижение результатов при использовании этих методов, возникает из-за потерь элементов при пробоподготовке и анализе.

Таблица 1 - Диапазоны концентраций элементов в кортикальной ткани, выявленные по всем исследованным образцам методом ЛМС ("свежая" костная ткань)

Таблица 2 - Содержание элементов в костной ткани, полученные методом ЛМС (верхняя граница концентраций) и приведенные в литературных источниках (мкг/г)

Во-вторых, - более высокие концентрации элементов могут быть связаны со свойствами самой кортикальной ткани, наиболее жесткой и твердой части кости, почти в 2 раза более плотной, чем скелет.

3) Обобщение данных, полученных методом ЛМС, позволяет показать нижние границы и диапазоны определения элементов (таблица 3) в костной ткани. Эти диапазоны шире, чем приведенные в литературных источниках, прежде всего, из-за смещения верхней границы в сторону больших концентраций. Однако следует отметить, что в настоящее время не только результаты отдельных работ, но и усредненные по разным работам результаты демонстрируют значительную вариабельность в содержаниях элементов в костной ткани (Чупятова Т.С., 1994; Беняев Н.Е. с соавт., 2004). Вариация может достигать 3-х порядков величины.

4) Методом ЛМС можно определять такие медико-биологические признаки, для диагностики которых является достаточным количественный анализ элементов, находящихся в костной ткани в диапазонах концентраций, приведенных в таблице 3. Сопоставимость концентраций обеспечивается на основе использования методики одновременного определение F, Na, Mg, Al, Si, P, S, Cl, K, Ca, Fe, Cu, Zn Sr, Pb, и суммы легких элементов (H+C+N+O).

Таблица 3 Нижние границы и диапазоны определения элементов, выявленные методом ЛМС в свежей костной ткани.

Исследование субфассильной костной ткани методом ААС.

Методом ААС в образцах субфассильной костной ткани были определены содержания Ca, Zn, Cu, Mn, Fe, Pb, Sr и Ni. В таблице 4 приведены диапазоны концентраций элементов, выявленные по всем образцам. В последней колонке этой таблицы представлены величины колебаний концентраций в костной ткани.

1) Концентрации Сa в субфоссильной (археологической) костной ткани (давностью захоронения 100 - 2000 лет), определенные методом ААС, находятся на уровне 21-35 %, довольно хорошо согласуются с литературными данными (38,3±0,4; 35-39 %; 20 %), нашими результатами, полученными методом ЛМС (25-40 %) и колеблются в 1,7 раза, что сопоставимо с данными для свежей кости.

Концентрации микроэлементов Fe, Cu, Zn, Ni, Mn в кортикальной ткани субфоссильной кости с достаточной точностью совпадают с литературными данными, нашими результатами с применением метода ЛМС (для Fe, Cu, Zn) и колеблются в 10-100 раз, что также сопоставимо с данными для свежей кости.

Уровень содержания Sr в субфоссильной костной ткани составляет 10-100 мкг/г, что соответствует литературным данными (Sr: 15; 3-104; 50-100; 17-56), но на 1-2 порядка ниже, чем определенный методом ЛМС в костной ткани индивидов, проживающих в г. Самара (100-2000 мкг/г). При этом содержание элемента в обоих случаях колеблется в пределах одного порядка. Это наблюдение может быть связано с местными экологическими условиями большого промышленного города, загрязнением окружающей среды и накоплением костной тканью стронция, поступающего из нее.

Содержания Pb в субфоссильной кости находится на уровне 0,1-30 мкг/г. Это согласуются с литературными данными (Pb: 6,6; 2,1-74; 8,3-23; 4,8-17), но отличается от содержания в свежей кости: 1-66 мкг/г. Обращает на себя внимание, что нижняя граница концентраций Pb в археологической кости на порядок ниже, чем в свежей, при этом интервалы их концентраций перекрываются. Различия содержаний Pb составляют 660 раз, это связано с ухудшением экологических условий проживания современного человека, а также человека, жившего сто лет назад, по сравнению с условиями жизни людей, живших 2000 лет назад. Современный уровень содержания Pb в костной ткани человека - один из наиболее высоких за последние 2000 лет. Для субфоссильных костей характерным является содержание свинца ~0,1мкг/г в костях примерно у 50 % исследованных.

Таблица 4 - Диапазоны концентраций элементов в кортикальной ткани, выявленные по всем исследованным образцам методом ААС (субфассильная кость).

Таблица 5 Нижние границы и диапазоны определения элементов, выявленные методом ААС в субфассильной костной ткани.

2) Данные п.1. показывают, что субфоссильная кость хорошей сохранности может служить источником сведений о прижизненных концентрациях или соотношениях концентраций элементов в костной ткани современного человека. В таблице 5 представлены нижние границы и диапазоны определения элементов в субфассильной костной ткани.

3) Методом ААС можно определять такие медико-биологические признаки, для диагностики которых является достаточным количественный анализ элементов, находящихся в костной ткани в диапазоне концентраций указанных таблице 5.

Исследование концентраций элементов в зубной ткани

Методом ICP MS в образцах зубов были определены содержания таких элементов как Li, Be, Na, Mg, Al, K, Ca, Sc, Ti, V, Cr,Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Se, Rb, Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Rh, Pd, Ag, Cd, Sn, Sb, Te, Cs, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Hf, Ta, W, Re, Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb, Bi, Th, U всего 62 элемента.