Гистохимическое выявление Zn2+-инсулинового комплекса в В-клетках панкреатических островков

Размещено на http://www.allbest.ru/

Гистохимическое выявление Zn 2+-инсулинового комплекса в В-клетках панкреатических островков

Г.Г. Мейрамов, А.А. Кикимбаева, Ф.А. Миндубаева, Г.О. Жузбаева, Л.Г. Тургунова, А.Г. Мейрамова, О.Л. Коваленко, А.П. Андреева, А.А. Жузжасарова

В статье предложен метод гистохимического выявления в панкреатических B-клетках одновременно инсулина и ионов Zn2+, участвующих в его депонировании. Отмечено, что метод основан на окраске в замороженных срезах поджелудочной железы комплекса <йп2+-инсулин» дитизоном, окрашивающим комплекс в ярко-красный цвет. Определено, что интенсивность окраски может быть оценена количественно с помощью фотометрии. Доказано, что метод позволяет выявлять гистохимически как инсулин, так и содержание ионов Zn2+ в B-клетках. Авторами метод рекомендован для использования в виде прижизненной гистохимической реакции.

Известно, что цинку принадлежит важная роль в процессах депонирования инсулина в В-клетках кроликов, кошек, мышей, белых крыс, лошадей, собак, человека [1-4]. Синтезированный в В-клетках инсулин соединяется с имеющимся в В-гранулах цитоплазмы В-клеток цинком, образуя депо-форму. Цинк, выявленный методом электронной гистохимии [5], содержится только в В-гранулах, а в других органеллах В-клеток и в ее цитоплазме не обнаружен.

Разрушение В-клеток сопровождается параллельным снижением в их цитоплазме как инсулина, так и цинка. Резкое снижение содержания цинка в В-клетках происходит при тяжелых формах сахарного диабета. В подавляющем большинстве случаев наблюдается строгий параллелизм между содержанием в В-клетках ионов Zn2+ и инсулина.

Однако в отдельных, редких, искусственно созданных экспериментальных условиях, не связанных с наличием сахарного диабета, такой параллелизм может отсутствовать. В отсутствие диабета снижение содержания цинка в В-клетках может свидетельствовать о нарушении обмена цинка или о его временной мобилизации из В-клеток, например, при введении высоких доз сульфаниламидных сахароснижающих препаратов животным, что, в свою очередь, создает условия для нарушения процессов депонирования инсулина в клетках. То есть гистохимическими методами ионы в клетках при этом не выявляются ввиду их отсутствия, однако способность В-клеток синтезировать инсулин при этом не нарушается, нарушаются лишь процессы его депонирования, которые быстро восстанавливаются при прекращении действия причин, приводящих к мобилизации ионов Zn2+ из В -клеток.

Известен абсолютно специфичный флюоресцентный метод определения ионов Zn2+, однако химически он выявляет только ионы данного металла и не может служить критерием оценки содержания инсулина в цитоплазме клеток [6-8].

Существующие методы гистохимического выявления инсулина в В-клетках -- иммуно-гистохимический, иммунофлюоресцентный, альдегидфуксиновый, псевдоизоцианиновый, Виктория-4 [9-16], являясь специфичными или абсолютно специфичными в отношении инсулина, имеют 3 существенных недостатка, ограничивающих их применение. Реактивы и антисыворотки, необходимые для них, весьма дороги и выпускаются ограниченным числом западных фирм. Кроме того, химически они выявляют только инсулин, не являясь маркерами собственно ионов цинка. Наконец, перечисленные выше методы, оценивая содержание инсулина в В-клетках, не позволяют судить о способности клеток депонировать синтезированный гормон с помощью ионов Zn2+, поскольку его содержание ими не оценивается. инсулин панкреатический ион поджелудочный

Нами ставилась задача -- разработать способ гистохимического выявления инсулина и одновременно ионов Zn2+ в панкреатических В-клетках с тем, чтобы оказалось возможным оценивать не только содержание инсулина в В-клетках, но и одновременно ионов Zn2+. Это позволило бы дополнительно судить о способности клеток депонировать, а не только синтезировать инсулин.

Предлагаемый способ количественной оценки содержания депонированного инсулина в окрашенных на инсулин В-клетках панкреатических островков поджелудочной железы основан на формировании окрашенного в красный цвет комплекса <^п2+-дитизон», выявляемого в панкреатических островках срезов ткани поджелудочной железы с помощью темнополевой микроскопии путем окраски В-клеток двумя путями: 1) введением раствора дифенилтиокарбазона (дитизона) животным внутривенно с последующей микроскопией препаратов замороженной поджелудочной железы; 2) окраской парафиновых или замороженных срезов поджелудочной железы раствором дитизона. Методом спектрального анализа подтверждено, что образующиеся в В-клетках ярко-красные гранулы химически являются комплексом <^п2+-дитизон» и имеют тот же спектр поглощения, равный 580 нм, что и синтезированный химическим путем дитизонат цинка [17]. Поскольку ионы Zn2+ в В-клетках находятся в связанном с инсулином состоянии, образуя депоформу гормона, данный метод одновременно позволяет судить и о содержании инсулина в клетках. Удаление дитизоната цинка из В-клеток сопровождается и удалением инсулина, связанного с цинком в виде депоформы, о чем свидетельствует полное отсутствие инсулина в В-клетке, выявляемое высокоспецифичными гистохимическими методами [17].

Материалы и методы исследования

В опытах использованы 14 беспородных кроликов массой 2480-3060 г. Животным внутривенно вводился водно-аммиачный раствор дитизона («MERCK», ФРГ), приготовленный следующим образом: 200 мг дитизона вносится в колбу с притертой пробкой, содержащую 25 мл дистиллированной воды, добавляется 0,2 мл 25 %-ного раствора аммиака, затем смесь встряхивается в течение 10 мин на водяной бане при температуре +70оС. После этого раствор охлаждался и медленно вводился внутривенно из расчета 45-50 мг/кг. Точная концентрация устанавливалась путем вычета нерастворившегося порошка дитизона, оставшегося на фильтре после его высушивания. Извлеченная поджелудочная железа замораживалась в криостате, после чего замороженные срезы толщиной 4-5 мкм исследовались в темном поле микроскопа.

Результаты исследования

В поле зрения видны островки, содержащие обильную ярко-красную зернистость, особенно плотно располагающуюся вокруг стенок кровеносных сосудов, т.е. там, где концентрируется наибольшее количество депонированного инсулина, тогда как в В-клетках поджелудочной железы животных с экспериментальным диабетом зернистость полностью отсутствовала, как и ионы Zn2+, по сравнению с резко положительной реакцией на цинк в препаратах интактных животных. Данная зернистость является комплексом «дитизон», что подтверждено результатами спектрального анализа [17].

Интенсивность окраски можно оценить количественно путем фотометрии, с получением количественных данных в относительных единицах [15].

Этим же раствором можно окрашивать срезы замороженной ткани поджелудочной железы, не вводя его внутривенно, а нанося на срез на 2 минуты, после чего раствор дитизона смывается со среза дистиллированной водой. Однако качественные результаты такой окраски всегда уступают результатам, полученным способом, описанным выше: гистотопография комплекса в этом случае выявляется хуже.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью данного гистохимического метода в панкреатических В-клетках можно выявлять инсулин в комплексе с ионами Zn2+, что позволяет судить как о содержании инсулина в клетке, так и, по содержанию ионов Zn2+, о способности ее к депонированию гормона. Локализация ионов Zn2+ в цитоплазме В-клеток в точности повторяет расположение инсулина [3,15,17]. Практически всегда наблюдается строгий параллелизм между содержанием депонированного инсулина и ионов Zn2+, и лишь в двух случаях он может нарушаться. Это наблюдается, если ионы Zn2+ искусственно вымываются из В-клеток либо если они связаны с введенными извне хелаторами -- производными дитиокарбаминовой кислоты. В этих крайне редко встречающихся случаях параллелизм нарушается, т.е. инсулин в клетке сохраняется, но реакция на цинк бывает отрицательной в результате его отсутствия или его конкурентного связывания с солями дитиокарбаминовой кислоты, которая, не снижая количества ионов Zn2+ в В-клетках, не дает возможности выявления его с помощью маркеров на цинк.

Литература

1. Okamoto K. Experimental pathology of diabetes mellitus // Tohoku Journal of Exper. Medicine. -- 1975. -- 61. -- Suppl. 1-2. -- P. 1-61.

2. Meyramov G.G., Meyramova A.G. Zn as Cause of Diabetes Induced by Chelators and as Cause of its Prevention // DIABETES. The Journal of American Diabetes Association, USA. -- 2002. -- 51. -- № 6. -- P. 591-592.

3. Lapin W.I., Meyramov G.G., Korchin W.I., Satosin Table of contents of zinc and insulin in B-cells of small islands of Langergans at an experimental alloxanic diabetes // Of Patholog. Phisiol. experim.therap. -- 1973. -- № 4. -- P. 36-39.

4. Okamoto K. Experimental pathology of diabetes mellitus // Diabetes Mellitus: Theory and Practice. -- New York. -- 1970.256-264.

5. Okamoto K., Kawanishi H. Submicroscopic histochemical demonstration of intracellular reactive zinc in B-cells of pancreatic islets // Endocrinol. Jap. -- 1966. -- 13. -- № 3. -- P. 305-318.

6. BozhevolnovЕ.А., Serebrjakova G. V.8-п-tozilaminokhinolinovy luminescent reagent on zinc and cadmium // The Chemical reagents and preparations. -- Мoscow, 1961. -- 36-12.

7. Meyramov G.G., Meyramova R.G. The High Specifical Histochemical Method Revealing of Zn-ions in B-cells of Isolated Pancreatic islets // DIABETES. The Journal of American Diabetes Association. -- 1991. -- 40. -- Suppl. 1. -- P. 65.

8. Meyramov G.G., Meyramova A.G. 8-PTSQ as Fluorescent Reagent for Reve aling of Zn-ions in B-cells and as Diabetogenic Chelator //ACTA DIABETOLOGICA. The European Diabetes Journal. -- 2003. -- -- 2003. -- Vol. 40. -- № 1. --57.

9. Kvistberg D., Lester G., Lasarov A. Staining of Insulin with Aldehydefuchsin // Journal Histochem and Cytochem. -- 1966. --Vol. -- P. 609-611.

10. Meyramov G.G., Niedderer H. The Histofunctional Method Appreciating of Functional State of Isolated Pancreatic B-cells in the Tissue of Culture // Diabetes Research. and Clinical Practice. The Journal of International Diabetes Federation. Amsterdam-New York, -- Vol. 5. -- P. 228.

11. Wohlrab F., Dorsche H., Krautschick I., Schmidt S. On the specifity of the Insulin staining by Victoria Blue 4R // Histo-chem J. -- 1985. -- 17. -- P. 515-518.

12. Meyramova A.G., Kikimbaeva A.A., Meyramov G.G. Victoria 4 Method Staining of Insulin in B-cells of Isolated Pancreatic Islets // ACTA DIABETOLOGICA. The European Diabetes Journal. <<SPRINGER». -- 2003. -- 40. -- № 4. -- P. 208.

13. Schiebler T.H., Schiessler S. Uber den Nachweis von Insulin mit den metachromatisch reagie- renden Pseudoisocyaninen // Histochemie. -- 1959. -- 1. -- S. 445-465.

14. Coalson R.E. Pseudoisocyanin staining of insulin and specifity of emperical islet cell stain // Stain Technol. -- 1966. -- № 2.

15. 121-129.

16. Meyramov G.G., Iusupbekova G.T., Meyramova R.G. Gistoflyuorimetrical method of determination of maintenance of insulin in pancreatic B-cells // Of Problem of endocrinology. -- 1987. -- № 5. -- 49-51.

17. Meyramov G.G., Kikimbaeva A.A., Meyramova A.G. Fluorescent Histochemical method Staining of Insulin in B-cells of Isolated Pancreatic islets by Diethylpseudoisocyanine Chloride // ACTA DIABETOLOGICA. The European Diabetes Journal. -- 2005. -- Vol. 42. -- № 1. -- P. 66.

18. LasarisYa.A., MeyramovG.G.К выяснению роли блокирования цинка в патогенезе дитизонового диабета // OfProblemofendocrinology. -- 1974. --Vol. -- № 5. -- P. 90-94.

Размещено на Allbest.ru