Дифференцированный подход к ведению больных хроническим гломерулонефритом с учетом генетической предрасположенности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Дифференцированный подход к ведению больных хроническим гломерулонефритом с учетом генетической предрасположенности

14.00.09 - педиатрия

кандидата медицинских наук

Белянская Татьяна Владимировна

Москва, 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель: заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор Ильенко Лидия Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Цветкова Любовь Никифоровна

доктор медицинских наук, профессор Ботвиньев Олег Константинович

Ведущее учреждение: Федеральное государственное учреждение «Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « 11 » июня 2007 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета К 208.072.02 в ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г.Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ г.Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «18 апреля » 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Л.В. Сапелкина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Предупреждение прогрессирования хронических заболеваний почек и поиск современных методов терапии являются одной из наиболее актуальных задач детской нефрологии (Шилов Е.М., 1995; Тареева И.Е., 2000; Чиж А.С., 2004).

Для изучения роли наследственных факторов в развитии полигенных заболеваний часто используется подход, основанный на определении полиморфных маркеров генов-кандидатов (Гузов И.С., 2006; Носиков В.В., 2005). В качестве генов-кандидатов, продукты экспрессии которых могут определять скорость прогрессирования почечной недостаточности, рассматривают в первую очередь гены, кодирующие компоненты ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) и системы синтеза оксида азота (NO) эндотелием. Регулируя системную и внутрипочечную гемодинамику, а также стимулируя гипертрофию и гиперплазию мезангиальных клеток и синтез межклеточного матрикса, продукты экпрессии этих генов участвуют в развитии нефросклероза (Шахмалова М.Ш., 1996; Тареева И.Е., 2000; Минушкина О.С., 2002; Чиж А.С., 2004; Ruiz-Ortega M., 1997; Shiavello T., 2001; Peters, 2000).

Из генов-кандидатов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы наиболее изучен ген ангиотензинпревращающего фермента (ACE). Выявлен полиморфизм типа «вставка/отсутствие вставки - insert/delete - I/D” в 16 интроне (Wolf G., Mueller E., 1993; Yoshida H. 1996; Vasku A., Soucec M 1998). I/D полиморфизм ассоциирован с уровнем ангиотензинпревращающего фермента в плазме. В связи с этим было высказано предположение, что аллель D, у носителей которого наблюдается повышенный уровень АСЕ, является фактором риска артериальной гипертензии (Shunkert H., 1994; Ludwig E., 1995; Prisco D., 2000; Ruiz-Ortega M., 2001). Несомненна патогенетическая связь между заболеваниями почек и кардиоваскулярной патологией. Более того, своевременная диагностика и адекватное лечение последней играет первостепенную роль в снижении летальности нефрологических больных. В целом сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) могут быть как причиной, так и осложнением хронических заболеваний почек (Marre M., 1994; Gilles Pernod, 2004).

Результаты современных исследований демонстрируют повышение риска хронизации гломерулонефрита при высокой концентрации гомоцистеина в крови (Fadinger M., 1997; Guttormsen A.B., 1997; Liangoos O., Kreutz R., 1998; van Guldner C., 2001). В основе этого процесса лежит несколько механизмов: непосредственное токсическое воздействие гомоцистеина на эндотелий, активация гиперплазии гладкомышечного слоя сосудистой стенки. Гомоцистеин стимулирует агрегацию тромбоцитов, нарушает функцию тканевого активатора плазминогена, способствует связыванию липопротеина с фибрином, а также ингибирует функцию естественных антикоагулянтов, таких как антитромбин III и протеин С.

Повышению уровня гомоцистеина в крови способствует ряд факторов. Гипергомоцистеинемия может быть обусловлена генетическими дефектами ферментов, обеспечивающими процессы обмена гомоцистеина. К увеличению концентрации гомоцистеина в плазме крови ведет мутация гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), которая обусловливает дефект витамин В12-зависимого реметилирования гомоцистеина в метионин (Fowler B., 2001; van Guldener C., 2001; Fodinger M., 2001; Fu W., Dudman N., 2002). F.Cappuccio и соавт., 2002 г. получили данные о том, что уровень гомоцистеинемии выше у лиц с T/Т-генотипом по сравнению с C/С-генотипом, а также об этнических различиях уровня. У лиц, имеющих T/Т-генотип гена MTHFR, отмечаются не только высокий уровень гомоцистеина, но и повышение активности ренина плазмы (Liangos O., 1998; Hagen W., 2001; Wrone E.M., 2001).

В практическом и теоретическом отношении важно, что гипергомо-цистеинемия признана в качестве фактора риска как кардиальной патологии, так и маркером высокой вероятности развития и прогрессирования нефрита (Stein J , Mc Bride P., 1998, Sirrs S., 1999.; Isukahara H., 2000; Zou C., 2002).

Другим не менее значимым фактором, влияющим на риск развития нефросклероза, является повышение содержания в плазме крови ингибитора активатора плазминогена 1 типа (РАI-1), который являетсся основным компонентом фибринолитической системы (Sakwdey M., 1991; Steefanson, Lawrence D.A., 1996.; Rerolle I.P., 2000; Hamana K., 2002). При высокой концентрации PAI-1 в крови может увеличиваться риск развития сердечно-сосудистых заболеваний и нефросклеротического процесса (Barnes J.L., 1995; Oikawa T., Freeman M., 1997; Brown N.J., 2000).

Полиморфизм гена ингибитора активатора плазминогена 1 типа PAI-1 определяет различия в транскрипции гена; при наличии аллеля 5G отмечаются более низкие концентрации PAI-1 в плазме крови. Существует связь между уровнем PAI-1 в плазме крови, разными вариантами полиморфизма PAI-1 и риском развития склеротических процессов в тканях почек. Более того, было обнаружено, что генетические варианты 4G\4G гена PAI-1 модулируют активацию PAI-1 антигена под влиянием ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (Xu Y., 1996; Wang A.Y., 2001; Приходина А.С. и др., 2005).

Диагностика и адекватная коррекция этих состояний чрезвычайно важна для прогнозирования течения и исхода хронического гломерулонефрита, уменьшения факторов риска развития нефросклероза. И ставит на повестку дня вопрос о возможности управления факторами риска прогрессирования нефросклероза.

Цель исследования. Изучить диагностическую и прогностическую значимость полиморфных маркеров генов кандидатов у детей больных хроническим гломерулонефритом.

Исходя из поставленной цели, были разработаны следующие задачи.

Задачи исследования:

1. Установить наличие или отсутствие ассоциации полиморфных маркеров I/D гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE), 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена, С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолатредуктазы с генетической предрасположенностью к возникновению хронического гломерулонефрита.

2. Выявить взаимосвязь между клиническими особенностями, морфологическими вариантами течения хронического гломерулонефрита у детей и генотипами полиморфных маркеров I/D гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE), 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена, С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолатредуктазы.

3. Исследовать прогностическую значимость генотипов полиморфных маркеров I/D гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE), 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена, С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолатредуктазы в отношении развития хронического гломерулонефрита.

Определить концентрацию гомоцистеина в сыворотке крови у пациентов с хроническим гломерулонефритом.

4. Оценить эффективность дифференцированной терапии ингибиторами АПФ у больных хроническим гломерулонефритом в зависимости от генотипа полиморфных маркеров I/D гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE), 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты проведенного исследования используются в практической работе в НЦЗД РАМН, НУЦ КДЦ и отделение нефрологии ДГКБ им. Н.Ф.Филатова, а также в педагогическом процессе на кафедре госпитальной педиатрии Московского факультета РГМУ (зав.каф.- проф .Л.И. Ильенко).

Публикации. По теме диссертации опубликовано восемь научных работ, содержащих основные положения данного исследования.

Апробация работы. Материалы работы доложены на VI съезде научного общества нефрологов России 14-17 ноября 2005 г., V Российском конгрессе по детской нефрологии 19-21 сентября 2006 г., на заседании кафедры госпитальной педиатрии Московского факультета с курсом ТМЛ ФУВ РГМУ 16 ноября 2006 года.

Объем и структура исследований. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста, включает 53 таблицы, 32 рисунка, 4 диаграммы. Состоит из введения, обзора литературы, трех глав: объема и методов исследования собственных исследований; обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список литературы содержит 205 источников, из них 26 отечественных и 179 зарубежных работ.

База проведения исследований. Настоящая работа была выполнена в отделении о нефрологии ДГКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова (зав. нефролог. отделением - Бояджан М.Б.), КДЦ НУЦ им. Н.Ф. Филатова (зав. отделением - д.м.н. Николаев С.Н.), Научного центра здоровья детей РАМН (зав. отделением - профессор, д.м.н. Цыгин А.Н.). Генетическое тестирование пациентов с ХГН и контрольной группы было проведено в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государс-твенного Научного Центра «ГосНИИГенетика»( директор - чл.-корр. РАН, проф. В.Г. Дебабов, зав. лабораторией - проф. В.В.Носиков). Морфологическое исследование ткани почки, полученной с помощью чрезкожной биопсии, проводилось на кафедре патологической анатомии (зав. кафедрой - академик РАН и РАМН, проф. М.А Пальцев) ММА им. И.М. Сеченова - проф. В.А. Варшавским и к.м.н. Е.П. Проскурневой.

Краткое содержание работы

Обследовано 200 человек: основную группу составили 120 больных ХГН и контрольную группу - 80 человек без заболеваний почек и АГ.

В основную группу вошли 67 мальчиков и 53 девочки в возрасте от 0,5 до 17 лет (средний возраст - 10,91?4,53 лет). Детей в возрасте до 3 лет было 37 человек, от 4 до 6 лет - 19 человек, от 7 до 10 лет - 21 человек, а старше 11 лет -43 человека (табл.1).

Оценка клинических особенностей ХГН проводилась ретроспективно на основании данных анамнеза и по архивным материалам. Она включала изуче-ние особенностей дебюта заболевания, его клинических и морфологических вариантов, а также анализ течения ХГН.

Клинические синдромы в дебюте гломерулонефрита проанализированы у всех пациентов. У большинства больных заболевание манифестировало изолированным нефротическим синдромом - в 50 % случаях - 60 детей (протеинурия более 50мг/кг/24ч у детей в сочетании со снижением уровня альбумина менее 3,5 г/дл). Второе место занимал изолированный мочевой синдром (умеренные изменения наблюдались только в мочевом осадке в виде умеренной протеинурией и/или гематурией различной степени выраженности без гипоальбуминемии) - 28% (34 ребенка). На третьем месте - нефритический синдром (умеренные отеки, гипертензия острого периода, в анализах мочи преобладают гематурия в сочетании с умеренной протеинурией, биохимические показатели активности процесса невысокие) - 22 % (26 человек).

Таблица 1. Общие сведения об обследованных пациентах

Количество наблюдавшихся пациентов	Распределение обследованных в зависимости от характера патологии	Количество проведенных исследований
Показатель	Кол-во детей	Характер заболевания	Кол-во детей	Методы исследований	Кол-во детей
Возраст дебюта заболевания		Формы ХГН		Измерение АД	120
От 0 до 3 лет	38	МИНС	48	Клинический анализ мочи	120
От 4 до 6 лет	19	МезПГН	44	Клинический анализ крови	112
От 7 до 10 лет	21	МПГН	10	Определение суточной протеинурии	120
От 11 до 15 лет	42	ФСГС	18	Биохимический анализ крови	120
Итого	120	Итого	120	УЗИ почек	120
Клин. с-мы в дебюте заболевания		Пациенты с ХПН		Рентген грудной клетки	36
Нефротический синдром	60
Изолированный мочевой синдром	34	НСМИ	1
Гематурический синдром		МезПГН	8	Клиренс эндогенного креатинина
		МПГН	2
Итого	120	ФСГС	3	Нефробиопсия	74
Клинические синдромы в момент обследования в стационаре		Итого	14	Генетическоетестирование
Нефротическая форма	67	Всего	134
Смешанная форма	39			ЭКГ	98
Гематурическая форма	14			Эхо-кг	43
Итого	120			Консультация окулиста	45
Хроническая почечная недостаточность	14			Консультация невропатолога	34
Синдром артериальной гипертензии	56			Консультация генетика	31
Гематурия в дебюте заболевания				Итого	1267
Макрогематурия.	8
Гематурия до 200 в п/зр	11
Микрогематурия 41	41
Итого	60
Всего	490

Повышение уровня креатинина крови (>110 мг/л) в дебюте гломерулонефрита имело место у 14 (11,6 %) пациентов (7 девочек и 7 мальчиков) из 120, у 4 из них это было расценено как проявление активности заболевания. Одному ребенку проведена пересадка почки. Средний возраст пациентов с почечной недостаточностью составлял 11,88?5,08 лет.

Синдром артериальной гипертензии встречался у 46,6% - 56 больных. При проведении анализа степени выраженности АГ обнаружено, что выраженная артериальная гипертензия отмечалась у 40 пациентов (71,4%), у 16 - умеренная артериальная гипертензия (28,57%).

Гематурия в начале гломерулонефрита наблюдалась у 60 (50,0%) больных из 120. Среди них у 8 (13,3%) отмечались эпизоды макрогематурии, 11(18,3%) детей имели гематурию до 200 в поле зрения и 41(68,3%) - микрогематурию.

Анализ клинических форм гломерулонефрита на момент первого обследования пациентов с ХГН показал, что нефротическая форма была выявлена у 67 пациентов(55,83%), смешанная форма у 39 детей с ГН(32,5%), гематурическая форма у 14 пациентов (11,6%).

Чрескожная пункционная биопсия почки с гистологическим, иммунофлюоресцентным и электронно-микроскопическим исследованием биоптатов была произведена у 74 пациентов с ХГН (61,6%). Средний возраст больных на момент биопсии был 5,03?3,95 лет.

Показанием для проведения биопсии почек являлось: абсолютная стероидрезистентность, дебют заболевания в подростковом возрасте, длительно персистирующая протеинурия или гематурия. Как показал опыт многих нефрологических школ, диагноз НСМИ у детей 1-14лет ставят в типичных случаях по характерным клинико-лабораторным, функциональным данным, быстрому положительному ответу на стероидную терапию, не прибегая к биопсии (Усов И.Р., 1987, Папаян А.В., 1989, Habib R., 1979, Barrat, 1993). Аналогичной тактики придерживались мы в своем исследовании. Однако двум больным была проведена нефробиопсия, учитывая длительную стероидрезистентность.

Основываясь на клинико-анамнестических данных, а также результатам проведенной нефробиопсии были выделены следующие формы гломерулонефрита: наибольшую группу составили пациенты с нефротическим синдромом с минимальными изменениями, что составило 48 человек, второе место составили дети с МезПГН - 44 ребенка, третье место - фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) - 18 пациентов, четвертое - мембранопролиферативный гломерулонефрит - 10 детей.

При анализе течения ХГН учитывали следующие факторы: выраженность АГ на протяжении заболевания, персистирование ПУ нефротического уровня в течение 6 и более месяцев. А также сочетание АГ и длительно персистирующей ПУ, уровень креатинина и мочевины, клиренс эндогенного креатинина, длительность гормональной терапии, изменение азотовыделительной функции почек, которая оценивалась по уровню креатинина в крови и мочевины.

Иммуносупрессивная терапия проводилась у 92 пациентов и в зависимости от тяжести заболевания включала: прием преднизолона внутрь и/или в виде «пульс»-терапии; цитостатиков - циклофосфана (внутрь или в виде «пульс»-терапии), азатиоприна - в качестве монотерапии или в сочетании с приемом глюкокортикостероидов, а также циклоспорина А.

Эффективность иммуносупрессивной терапии оценивали через 6-12 месяцев после начала лечения по следующим критериям:

для больных с НС - исчезновение НС или частичное уменьшение признаков НС с полным восстановлением или сохранением функции почек, а также снижение ПУ до 1-3 г/сут;

для больных с активным ХГН без НС - снижение ПУ не менее чем на 50% с сохранением или восстановлением функции почек.

В качестве популяционного контроля при проведении генетического тестирования использовали 80 человек (44 мужчин и 36 женщин) без хронических заболеваний почек и АГ.

Методы исследования:

Общеклиническое обследование больных включало: тщательное изучение анамнеза заболевания, клинический анализ крови с подсчетом тромбоцитов, общий анализ мочи с микроскопией мочевого осадка, определение суточной протеинурии, исследование биохимических показателей крови - общего белка, альбумина, креатинина, мочевой кислоты, глюкозы, холестерина и триглицеридов, общего и прямого билирубина, трансаминаз, электролитов; скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина (проба Реберга-Тареева) и суточной экскреции мочевой кислоты, а также рентгенографию органов грудной полости, ультразвуковое исследование почек, электро- и эхокардиографическое исследования (эхокардиография проведена только у части больных), консультации невропатолога, окулиста и, при необходимости, других специалистов. гломерулонефрит дети генотип ангиотензинпревращающий

АД измеряли в утренние часы, в положении больного сидя (после периода адаптации не менее 15 минут для достижения им состояния относительного покоя) не менее 3 раз, с расчетом среднего значения систолического АД (САД) и диастолического АД (ДАД). Под артериальной гипертензией (АГ) у детей понимали стойкое повышение артериального давления (АД) выше 95-го перцентиля для конкретного возраста и пола ребенка.

При определении морфологического варианта ХГН использовали классификацию В.В. Серова (1977 г.).

Для изучения генетической предрасположенности к возникновению ХГН исследовали ассоциацию полиморфного маркера (аллеля и генотипа) с фенотипом (клинически выраженной патологией).

Под ассоциацией понимали достоверно различающуюся частоту встречаемости исследуемых полиморфных маркеров у больных и у здоровых лиц одной и той же популяции. Идентификацию аллелей полиморфных маркеров проводили методом полимеразной цепной реакции с последующим расщеплением ДНК в 2 % агарозном геле.

Для определения гомоцистеина в сыворотке крови была применена модификация методики электрохимической детекции гомоцистеина с использованием отечественных компонентов, производимых фирмами «БИОХРОМ» и «ЭЛСИКО».

При статистической обработке данных для протяженных переменных рассчитывали среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (?). Для расчета статистической значимости различий частотных показателей использовали критерий ?² по Пирсону. Достоверными считались различия при р < 0,05; 0,05 ? р < 0,1 рассматривали как тенденцию к различию.

Для выявления и оценки связей между исследуемыми показателями, применялся непараметрический анализ ANOVA. О силе и направленности связи судили по величине и знаку коэффициента регрессии R. Достоверными считали корреляции с p<0,05.

Почечную выживаемость оценивали моментным методом Каплана-Мейера с учетом времени от начала заболевания (соответствует моменту появления мочевого синдрома) до исхода. В качестве исхода рассматривали увеличение концентрации сывороточного креатинина выше возрастной нормы и снижение клиренса креатинина ниже 60 мл/мин (по формуле Шварца).

Для оценки влияния одного или нескольких факторов на прогноз проводили соответственно монофакторный анализ с помощью регрессионной модели Кокса.

Результаты собственных исследований и их обсуждение:

Результаты генотипирования по локусам I/D гена АСЕ, С677Т и A1298C гена MTHFR, 4G/5G гена PAI-1 представлены в таблице 2.

Таблица 2. Частота аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов ACE, MTHFR и PAI-1 у больных ХГН и в контрольной группе

		Контрольная группа (N = 80)	Больные ХГН (N = 120)	р
		%	%
ACE	Аллель I	50	50	нд
	Аллель D	50	50	нд
	Генотип II	27,5	21,6	нд
	Генотип ID	45	56,6	нд
	Генотип DD	27,5	21,6	нд
MTHFR	Аллель C	70	70,4	нд
	Аллель T	30	29,58	нд
	Генотип CC	51,25	46,6	нд
	Генотип CT	37,5	47,5	нд
	Генотип TT	11,25	5,83	нд
MTHFR	Аллель A	62,5	55	нд
	Аллель C	37,5	45	нд
	Генотип AA	32,5	22,5	нд
	Генотип AC	60	65	нд
	Генотип CC	7,5	12,5	нд
PAI-1	Аллель 4G	59,35	59,3	нд
	Аллель 5G	40,65	40,62	нд
	Генотип 4G4G	36,25	36,6	нд
	Генотип 4G5G	46,25	39,1	нд
	Генотип 5G5G	17,5	24,1	нд

При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов ACE, MTHFR и PAI-1 в контрольной группе и среди больных ХГН статистически достоверных различий выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данных полиморфных маркеров с генетической предрасположенностью к возникновению ХГН.

Анализ клинических особенностей ХГН, скорости прогрессирования почечной недостаточности и эффективности терапии ингибиторами АПФ проводили в группах больных, выделенных в зависимости от генотипов исследуемых полиморфных маркеров:

для гена ACE - группы II, ID и DD;

для гена PAI-1 - группы 4G/4G,4G/5G,5G/5G;

для гена MTHFR - группа CC,CT,TT-С677Т и группа AA,AC,CC-А1298С.

Принимая во внимание имеющиеся в литературе данные об ассоциации определенных аллелей генов АСЕ, MTHFR, PAI-1 с заболеваниями почек, мы объединили в отдельную группу носителей так называемых «неблагоприятных» аллелей - аллеля D гена ACE, аллеля 4G гена PAI-1, аллеля Т гена MTHFR(C677T) и аллеля С гена MTHFR(А1298С). В результате были выделены 2 комбинированные группы.

В первую группу (группа D+4G+T+C) включены носители сочетания аллеля D (генотипы ID или DD), аллеля 4G (генотипы 4G/4G или 4G/5G) и аллеля T (генотипы TT или CT) и аллеля С(генотипы СА или СС).

Во вторую группу вошли носители оставшихся сочетаний генотипов.

Известно, что сочетание носительства двух гетерозиготных генотипов СТ и АС гена MTHFR увеличивает риск развития гипергомоцистеинемии.

Характеристика клинических особенностей ХГН в зависимости от генотипа полиморфных маркеров генов ACE, PAI-1 и MTHFR. Высокая частота гетерозиготного генотипа ID гена АСЕ отмечалась в группе больных ХГН, дебют заболевания которых произошел в возрасте от 1 до 3 лет (?^{2 =} 5,16, р=0,02). В то время как поздний дебют заболевания (школьный возраст - от 7 до 10 лет) был ассоциирован с генотипом СС(А1298С) MTHFR(?^{2 =} 4,16, р=0,04).

Следует отметить, что пациенты, у которых был выявлен нефротический синдром в момент первого обследования в клинике чаще имели генотип ID гена ACE (?^{2 =}3,83, р=0,03), аллель 5G ( ч2=5,03,p=0,02) или генотип 5G5G гена PAI-1( ч2=4,64,p=0,03). Гематурическая форма ХГН была ассоциирована с генотипом 4G4G (?^{2 =}3,89, р=0,048) и аллелем 4G (?^{2 =}5,29, р=0,02) гена PAI-1.

Таким образом, наличие 5G5G генотипа PAI-1 определяет риск развития НС даже у детей, дебютировавших изолированным мочевым синдромом.

В то время как наличие 4G4G генотипа гена PAI-1 определяет более благоприятное течение ХГН в виде гематурической формы.

При изучении групп больных с рецидивирующим течением ХГН выявлена ассоциация с аллелем 5G (р=0,04) и генотипом 5G5G (р=0,05) гена PAI-1.

Аллель D гена АСЕ (р=0,02) чаще встречалась у пациентов со стероидзависимой формой ХГН. А генотип CT гена MTHFR был ассоциирован с стероидзависимой (р=0,004) и стероидчувствительной формой ХГН (р=0,01).

Высокая частота гетерозиготного генотипа ID гена АСЕ отмечалась в группе больных ХГН, с началом заболевания от 1 до 3 лет (?^{2 =} 5,16, р=0,02). В то время как поздний дебют заболевания (школьный возраст - от 7 до 10 лет) ассоциирован с генотипом СС (А1298С) MTHFR (?^{2 =} 4,16, р=0,04).

Характеристика морфлогических вариантов ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов ACE, PAI-1 и MTHFR. Чрескожная пункционная биопсия почки была произведена у 74 пациентов с ХГН (61,6%).

Одним из ключевых звеньев поддержания равновесия между факторами вазоконстрикции и вазодилятации является ангиотензин-превращаюший фермент (АСЕ). Его участие в регуляции сосудистого тонуса реализуется через синтез ангиотезиногена-II.

Нами выявлено, что генотип ID достоверно чаще встречался среди пациентов с НСМИ, что позволило нам предположить влияние ID генотипа на развитие данной формы заболевания (табл. 3).

Таблица 3. Частота морфологических вариантов ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров гена АСЕ

	Генотипы гена АСЕ
	АллельI	Аллель D	Генотип II	Генотип ID	Генотип DD
НСМИ	44,79	55,2	12,5*	64,58**	22,9
ФСГС	47,2	52,7	22,2	50	27,7
МезПГН	44,3	55,68	29,54	52,7	18,18
МПГН	55	45	30	50	20
Контр.гр.	50	50	27,5	45	27,5

*-Р=0,04,ч 2 = 4,02 у пациентов с НСМИ

**р=0,03 , ч 2 =4,56 у пациентов с НСМИ

Роль активации системы коагуляции в патогенезе гломерулонефрита и его исходе достаточно известна. Однако системная и локальная гиперкоагуляция может быть обусловлена различными факторами. Если при, так называемых, пролиферативных нефритах (мезангиопролиферативный, мембранопролиферативный) тригерным фактором гиперкоагуляции является дисфункция эндотелия, то при болезни с «минимальными изменениями» (НСМИ) и фокальносегментарном гломерулосклерозе (ФСГС) активация коагуляции связана, прежде всего, с потерей профибринолитических белков. В нашем исследовании выявлена ассоциация аллеля 4G и генотипа 4G4G с МезПГН, а аллеля 5G и генотипа 5G5G с НСМИ и ФСГС. Такое распределение генотипов в разных группах мы можем объяснить различной ролью дисфункции эндотелия в патогенезе пролиферативных и непролиферативных гломерулонефритов (табл. 4).

Таблица 4. Частота морфологических вариантов ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров гена PAI-1

	Генотипы гена PAI-1
	Аллель4G	Аллель 5G	Генотип 4G4G	Генотип 4G5G	Генотип 5G5G
НСМИ	41,8	58,14#	19,76	44,2**	36,04##
ФСГС	36,1	63,8*	16,6	38,8	44,4**
МезПГН	77,2©	22,7	61,3©©	31,8	6,8
МПГН	60	40	30	60	10
Контр.гр.	59,35	40,65	36,25	46,25	17,5

# аллель 5G (c² =6,69; р=0,01) НСМИ

# # генотип 5G5G (c² =7,21; р=0,007) у больных НСМИ

*Аллель5G (c² =6,43; р=0,01) ФСГС

** генотипа 5G5G (c² =5,38; р=0,02) у больных ФСГС

© аллели 4G (c² =8,07; р=0,004)

©© генотипа 4G4G (c² =5,38; р=0,007) у больных МезПГН

Установлена высокая степень ассоциации между развитием НСМИ и генотипами СТ гена MTHFR (табл. 5).

Таблица 5. Частота морфологических вариантов ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров гена MTHFR(C677T)

	Генотипы гена МТHFR
	Аллель C	Аллель T	Генотип CC	Генотип CT	Генотип TT
НСМИ	67,7	32,9	37,5	60,4*	2,08
ФСГС	72,2	27,7	50	44,4	5,5
МезПГН	72,2	27,2	54,54	36,36	9,09
МПГН	70	30	50	40	10
Контр.гр.	70	30	51,25	37,5	11,25

СТ генотип р=0,01, c² =6,34 у пациентов с НСМИ.

Таблица 6. Частота морфологических вариантов ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров гена MTHFR(A1298C)

	Генотипы гена МТHFR
	Аллель A	Аллель C	Генотип AA	Генотип AC	Генотип CC
НСМИ	40,6	59,37*	29,1	60,4	10,4
ФСГС	52,7	47,2	22,2	61,1	16,6
МезПГН	53,4	46,5	15,9©	75	9,09
МПГН	45	55	20	50	30#
Контр.гр.	62,5	37,5	32,5	60	7,5

* аллелем С( р=0,0007, c^{2 =} 11,51) у пациентов с НСМИ

© Генотип АА (p=0,04, c²=4,00) у пациентов с МезПГН

# Генотип СС (р=0,02,c²=5,00) у пациентов МПГН

Проведенные исследования свидетельствуют, что установлена высокая степень корреляции между развитием ФСГС и аллелем 5G и генотипом 5G5G гена PAI-1(p=0,01 и p=0,02); развитием МезПГН и аллелем 4G и генотипом 4G4G PAI-1 (p=0,004 и р=0,007); развитием МПГН и генотипом СС (А1298С) MTHFR(р=0,02,c²=5,00).

Для формирования НСМИ наиболее характерно сочетание генотипов ID АСЕ (p=0,03); аллеля 5G и генотипа 5G5G PAI-1 (p=0,01 и р=0,007); аллеля С(А1298С) и генотипа СТ (С677Т) MTHFR (p=0,0007 и р=0,01). Таблица 3,4,5,6.

Клиническая картина больных с почечной недостаточностью. Среди обследованных детей у 14 (11,6 %) пациентов было диагностировано нарушение функции почек (7 мальчиков и 7 девочек). Причем скорость прогрессирования процесса у мальчиков была выше (4,71+4,04 лет), чем у девочек (6,6+5,09лет) (р>0,05). Средний уровень креатинина составил 147,1+90,09 ммоль/л, клиренс креатинина - 60,4+20,83 мл/мин. Следует отметить, что наиболее частым морфологическим вариантом был МезПГН (50,7%).

Необходимо подчеркнуть, что у больных с генотипом DD сроки наступления почечной недостаточности несколько сокращались по сравнению с больными - носителями других генотипов (4,96?4,57 vs 7,13?3,84). Причем более выражены эти изменения были у девочек (6,9?4,95 vs 4,96?3,82).

При проведении анализа Каплан-Мейера в двух сформированных группах носителей «неблагоприятных» генотипов DD гена АСЕ и 4G4G гена PAI-1, мы получили достоверно выраженное прогрессирование заболевания у детей - носителей двух «неблагоприятных» генотипов одновременно (ч²=.9,1;р=0,008) (схема 1).

Схема 1

С помощью монофакторного анализа почечной выживаемости (регрессионная модель Кокса) были выделены факторы, обладающие неблагоприятным прогностическим значением. Ими оказались

- носительство генотипа 4G4G (р=0,027),

- комбинации аллелей D+4G (р=0,01),

- возраст начала заболевания старше 9 лет (р=0,029)

- длительно (более 6 месяцев) сохраняющаяся ПУ нефротического уровня(р=0,001) (табл. 7).

Таблица 7. Монофакторный анализ влияния клинических факторов на почечную выживаемость у больных ХГН (регрессионная модель Кокса)

Фактор	Влияние фактора на выживаемость, (р)
Наличие аллеля D гена ACE	0
Наличие аллеля Т и С гена MTHFR	0
Наличие генотипа 4G4G гена PAI-1	? (0,027)
Наличие комбинации аллелей D+4G	? (0,010)
Мужской пол	0
Возраст начала заболевания	? (0,029)
Наличие АГ на момент первого обследования	0
Уровень протеинурии в дебюте заболевания	0
Персистирование ПУ в течение 6 и более месяцев	? (0,001)
Отсутствие АГ на протяжении ХГН	0

0 - показатель не влияет на выживаемость; Ї - показатель ухудшает выживаемость; ­ - показатель улучшает выживаемость

Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, PAI-1 с эффективностью терапии ингибиторами АПФ. Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов ACE, PAI-1 с эффективностью терапии ингибиторами АПФ проводилось у 53 больных ХГН. Среди них было 26 мальчиков и 27 девочек. Средний возраст больных составил 11,28? 4,7 лет, давность заболевания - 4,76±3,85 лет.

Чрезкожная пункционная биопсия почки была выполнена у 31 пациента. Морфологические варианты гломерулонефрита (ГН) распределялись следующим образом: мезангиопролиферативный ГН был выявлен у 16 (30,18%) больных, минимальные изменения - у 20 (37,73 %), фокально-сегментарный гломерулосклероз - у 13 (24,52 %), МПГН-4 (7,54 %).

Пациентам была назначена терапия эналаприлом в дозе 0,04-0,8 мг/кг с целью коррекции артериальной гипертензии; с антипротеинурической целью доза ингибиторов АПФ составляла 0,04-0,11мг/кг.

Исследования, включавшие измерение АД , а также определение уровня суточной ПУ, креатинина, альбумина, калия, натрия, мочевой кислоты в крови, гемоглобина, экскреции мочевой кислоты проводили до назначения ингибиторов АПФ и затем в динамике через 1, 3, и 6 месяцев от начала лечения.

При сравнении исходных значений АД у носителей генотипа DD наблюдались более высокие цифры АД по сравнению с носителями генотипа ID и II, но данные различия не были статистически значимыми. У больных в группах 4G4G,4G5G,5G5G (ген PAI-1) достоверного снижения АД не отмечалось.

Антипротеинурический эффект на терапию ингибиторами АПФ был достигнут к 3 месяцу лечения во всех группах, однако статистически значимого снижения ПУ у пациентов, разделенных в соответствии с генотипами гена АСЕ, получено не было. У больных, выделенных в группы в соответствии с генотипами гена PAI-1, исходные значения ПУ не отличались. На фоне терапии ингибиторами АПФ у пациентов с генотипом 4G4G наблюдались разнонаправленные изменения ПУ, в то время как у больных с генотипом 4G5G отмечалось четкое достоверное снижение ПУ.

Гомоцистеинемия у пациентов с ХГН. Определение концентрации гомоцистеина проводилось у 18 больных НСМИ, трем из них (двое детей с стероидзависимой формой и один ребенок с острым течением стероидчувствительного НСМИ) обследование проводилось в активный период заболевания. Гипергомоцистеинемия (22,96+6,5) была зафиксирована у всех детей по сравнению с контрольной группой (7,8+1,78) (р=0,005) (график 1).

График 1

Принято считать, что при сочетанном носительстве гетерозиготных генотипов обоих полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена MTHFR повышается риск развития гипергомоцистеинемии как и при наличии гомозиготного генотипа ТТ C677T. Сформировав две группы, в первую из которых входили дети с сочетанным носительством гетерозиготных генотипов, а во вторую - с отсутствием такового и, проведя анализ влияния полиморфных маркеров гена MTHFR на концентрацию гомоцистеина в сыворотке крови, мы не выявили ассоциации между уровнем гомоцистеина и данными генотипами (график 2).

График 2

Выводы

Доказано, что у больных хроническим гломерулонефритом отсутствует ассоциация полиморфных маркеров I|D гена АСЕ, 4G5G гена PAI-1, С677Т и А1298С гена MTHFR c генетической предрасположенностью к возникновению ХГН. Однако выявлена ассоциация данных полиморфных локусов с факторами неблагоприятного течения ХГН, которая дает возможность определить особенности течения и прогноз хронического гломерулонефрита.

Выявлены ассоциативные связи между развитием рецидивирующего течения заболевания ГН и генотипом 5G/5G гена PAI-1(р=0,05), стероидзависимой формой ХГН и аллелем D гена АСЕ (p=0,02) и генотипом СТ гена MTHFR-С677Т(р=0,004).

Генотип 5G5G гена PAI-1 определяет риск развития НС. Пациенты с 4G4G генотипом гена PAI-1 имеют более благоприятное течение ХГН в виде гематурической формы.

Выявлены достоверные связи

-Установлена высокая степень ассоциации между развитием ФСГС и аллелью 5G и генотипом 5G5G гена PAI-1(p=0,01 и p=0,02).

- Развитием МезПГН и аллелью 4G и генотипом 4G4G PAI-1 (p=0,004 и р=0,007).

-Для формирования НСМИ наиболее характерным сочетанием генотипов ID АСЕ (p=0,03); аллеля 5G и генотипа 5G5G PAI-1 (p=0,01 и р=0,007); аллеля С(А1298С) и генотипа СТ (С677Т) MTHFR (p=0,0007 и р=0,01).

Обнаружено, что генотип 4G4G и комбинация аллелей D АСЕ + 4G РАI-1 являются прогностически неблагоприятными факторами развития ХГН (p=0,027 и p=0,01). Не выявлена ассоциация между уровнем гомоцистеина и носительством полиморфных маркеров.

Проведенный анализ показал, что антипротеинурический ответ на терапию ингибиторами АПФ максимально выражен в группе пациентов с генотипом 4G5G PAI-1. Четкой ассоциации исследуемых полиморфных маркеров генов ACE и PAI-1 со степенью выраженности антигипертензивного эффекта ингибиторов АПФ не обнаружено; лучший ответ на терапию получен у гетерозигот ID ACE и 4G5G PAI-1.

Практические рекомендации

1. В амбулаторно-поликлинических условиях у детей, составляющих группу риска по возможному развитию нефрита, рекомендуется проводить скрининг исследование для определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови. При выявлении гипергомоцистеинемии, в дальнейшем направлять пациентов на консультацию к нефрологу в специализированные учреждения.

2. На основании проведенного исследования, в качестве оценки прогноза заболевания целесообразно использовать исследование полиморфных маркеров I/D гена ACE, 4G5G гена PAI-1 и СT(C677T) и АC(A1298C) гена MTHFR в нефрологических отделениях стационаров.

3. Дополнительным критерием к назначению ингибиторов АПФ может служить комбинация «неблагоприятных» аллелей - аллеля D гена ACE и аллеля 4G гена PAI-1.

4. У пациентов с генотипом 4G5G PAI-1 при хроническом гломерулонефрите, даже при отсутствии АГ, показано назначение блокаторов АПФ с антипротеинурической целью.

5. При выявлении повышенного содержания гомоцистеина в сыворотке крови (свыше16мкмоль/л) всем пациентам с хроническим гломерулонефритом необходимо проведение специфической коррекционной терапии с целью профилактики нефросклероза - фолиевой кислоты, витамина В6, витамин В12.

Список сокращений

АСЕ - ген ангиотензинпревращающего фермента

А - Гартериальная гипертония

ГН - гломерулонефрит

НСМИ - нефротический синдром с минимальными изменениями

МПГН - мембранопролиферативный гломерулонефрит

МезПГН - мезангиопролиферативный гломерулонефрит

НС - нефротический синдром

ПУ - протеинурия

РАСС - ренин-ангиотензин-альдостероновая система

ФСГС - фокально-сегментарный гломерулосклероз

ХГН - хронический гломерулонефрит

ХПН - хроническая почечная недостаточность

H - cyгомоцистеинемия

MTHFR - метилтетрагидрофолатредуктаза

PAI-1 - ингибитор активатора плазминогена-1

АГ - артериальная гипертензия

Анг-II - ангиотензин II

АД - артериальное давление

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Белянская Т.В., Петросян.Э.К., Ильенко Л.И. Полиморфизм гена PAI-1 у детей с хроническим гломерулонефритом // Материалы четвертого Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 25-27 октября 2005 г.). С.179, 180.

2. Белянская Т.В., Петросян Э.К., Ильенко Л.И., Бабунова Н.Б., Бровкин А.Н. Генетический полиморфизм метилнтетрагидрофолатредуктазы у больных хроническим гломерулонефритом // Материалы четвертого Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 25-27 октября 2005 г.). С. 180.

3. Белянская Т.В., Петросян Э.К., Цыгин А.Н., Ильенко Л.И., Шестаков А.Е., Носиков В.В. Гипергомоцистеинемия у детей с хроническим гломерулонефритом // Материалы пятого Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, октябрь 2006 г.). С. 254.

4. Белянская Т.В., Петросян Э.К., Чудаковад Д.А., Ильенко Л.И., Шестаков А.Е. «Полиморфизм гена PAI-1 как маркер активности эндотелия у детей с разными формами гломерулонефрита // Материалы V Российского конгресса по детской нефрологии (Воронеж, 19-21 сентября 2006 г.). С. 34, 35.

5. Петросян Э.К, Белянская Т.В, Горашко Н.М. Полиморфизм гена ангиотензин-превращающего фермента у детей с нефротическим синдромом // Материалы VI съезда научного общества нефрологов России (Москва, 14-17 ноября 2005 г.). С. 40, 41.

6. Петросян Э.К., Белянская Т.В., Цыгин А.Н., Ильенко Л.И., Шестаков А.Е. Полиморфизм гена белка апоптоза MDM-2 у детей со стероидчувствительным и стероидрезистентным нефротическим синдромом // Материалы V Российского конгресса по детской нефрологии (Воронеж, 19-21 сентября 2006 г.). С. 172-174.

7. Петросян Э.К., Белянская Т.В., Цыгин А.Н., Ильенко Л.И., Шестаков А.Е., Носиков В.В. Полиморфный маркер 4G\5G гена PAI-1 у детей с хроническим гломерулонефритом // Нефрология. 2006 г. Т. 10. № 4. С. 56-61.

Размещено на Allbest.ru