Разработка состава и технологии биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ

14.04.01 - технология получения лекарств

ПОЛЕВАЯ ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА

Санкт-Петербург - 2013

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации на кафедре биотехнологии и в Федеральном государственном унитарном предприятии "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации.

Научный руководитель:

Яковлева Елена Павловна, доктор биологических наук, профессор.

Официальные оппоненты:

Шиков Александр Николаевич, доктор фармацевтических наук, заместитель директора ЗАО "Санкт-Петербургский институт фармации",

Басевич Анна Викторовна, кандидат фармацевтических наук, доцент, кафедры промышленной технологии лекарственных препаратов ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России.

Ведущая организация: ФГУП "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и Предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации (198320, г. Санкт-Петербург, г. Красное Село, улица Свободы, 52).

Защита состоится "26" марта 2013 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.088.01 при ГБОУ ВПО "Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14, лит. А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО "Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (197227, Санкт-Петербург, пр-т Испытателей, д.14).

Автореферат разослан "25" февраля 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Марченко Наталья Владимировна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Микробиота является важным экстракорпоральным органом человека, влияющим на все стороны его жизнедеятельности. При нарушении количественного и качественного состава нормальных микробиоценозов (дисбактериозе) одновременно происходят трофические и гормональные нарушения, изменяется иммунный статус организма. Состояния дисбактериоза лежат в основе возникновения и развития многих инфекционных и соматических заболеваний человека. Поэтому терапевтическая тактика лечения большинства заболеваний должна включать применение специальных препаратов, предназначенных для восстановления нормальных микробиоценозов.

Причин нарушения равновесия кишечной микрофлоры много, одной из них является прием антибактериальных препаратов, которые подавляют рост и развитие не только патогенных микроорганизмов, но и представителей нормофлоры. В этой связи исключительно важен поиск новых лекарственных препаратов для лечения инфекционных заболеваний путем элиминации из микробиоценозов патогенных штаммов и/или снижения уровня их патогенности без отрицательного воздействия на макроорганизм.

Основным способом коррекции дисбактериозов является прием пробиотических и пребиотических препаратов. Первые из них содержат живые микроорганизмы или вещества микробного происхождения, вторые - вещества немикробного происхождения, стимулирующие рост и повышающие пробиотический потенциал "полезных" представителей нормофлоры. Результат применения подобных препаратов обычно положительный, однако все происходящие изменения в микробиоценозе носят неконтролируемый характер.

В настоящее время к группе наиболее перспективных для регуляции равновесия кишечной микрофлоры относятся препараты на основе бактериальных метаболитов. Однако российский фармацевтический рынок ограничен всего двумя препаратами, которые производятся в ЕС: жидкий пробиотик "Хилак форте", содержащий молочную кислоту и продукты обмена веществ трех представителей нормальной микрофлоры и таблетированный синбиотик "Закофальк", содержащий масляную кислоту и инулин.

Отечественных лекарственных препаратов на основе бактериальных экзометаболитов, регулирующих нарушения состава микрофлоры кишечника и предназначенных для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, в настоящее время не существует.

Цель и задачи исследования. Целью работы является разработка состава и технологии биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов, предназначенных для подавления роста патогенных бактерий и снижения уровня их патогенности, для стимуляции роста и повышения пробиотического потенциала нормофлоры, а также разработка технологии производства комплексов в виде капель и раствора для приема внутрь.

В процессе выполнения работы были поставлены следующие основные задачи:

1. Исследовать состав и динамику низкомолекулярных карбоновых кислот и аминокислот:

а) в процессе роста штаммов E.coli М-17, VL613, №14, О 75 и S. enteritidis var.Issatchenko;

б) в процессе роста и инкубации штаммов молочнокислых бактерий Bifidobacterium bifidum 1 и Lactobacillus plantarum 8P-A3;

в) в процессе роста смешанных культур E.coli M-17 и E.coli О 75, M-17 и №14, M-17 и S. enteritidis.

2. Изучить действие экзометаболитов на рост E.coli М-17, VL613, №14, О 75 и S. enteritidis.

3. Разработать технологию биологически активных комплексов на основе экзометаболитов бактерий.

4. На основе синтетических аналогов экзометаболитов разработать комплекс, подавляющий рост и понижающий уровень патогенности патогенного штамма E.coli О 75.

5. На основе синтетических аналогов экзометаболитов разработать биологически активный комплекс, стимулирующий рост пробиотического штамма E.coli VL613.

6. Провести микробиологические и молекулярно-биологические исследования активности комплексов бактериальных экзометаболитов.

7. Разработать технологию производства биологически активного комплекса для подавления роста патогенного штамма E.coli О 75 в виде капель для приема внутрь.

8. Предложить показатели качества комплекса бактериальных экзометаболитов для подавления роста и патогенности E.coli O75 в виде капель для приема внутрь и на основании полученных результатов разработать проект фармакопейной статьи предприятия.

9. Разработать технологию производства биологически активного комплекса для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613 в виде раствора для приема внутрь. Предложить показатели качества комплекса и на основании полученных результатов разработать проект технических условий.

Научная новизна:

· Впервые проведен комплексный анализ состава метаболитов, выделяемых бактериями семи штаммов: E.coli М-17, VL613, №14, О 75, S. enteritidis var.Issatchenko, B. bifidum 1, L. plantarum 8P-A3. Идентифицировано более 40 соединений.

· Исследована динамика внеклеточных карбоновых кислот и аминокислот в процессе культивирования E.coli М-17, VL613, №14, О 75, S. enteritidis var.Issatchenko, B. bifidum 1, L. plantarum 8P-A3. Установлено, что растущая культура активно обменивается экзометаболитами со средой, выделяя их на одних стадиях и поглощая на других, при этом концентрация экзометаболитов (карбоновых кислот) коррелирует со скоростью их роста.

· Проведен анализ изменений состава и динамики внеклеточных карбоновых кислот при выращивании смешанных культур E.coli М-17 и О 75, М-17 и №14, М-17 и S. enteritidis по сравнению с чистыми культурами. Установлено, что смешанные культуры значительно отличаются от чистых по динамике и концентрации карбоновых кислот.

· Показано, что экзометаболиты стимулируют, подавляют либо не оказывают влияния на рост культур E.coli М-17, VL613, №14, О 75, S. enteritidis var.Issatchenko.

· Впервые разработана технология биологически активных комплексов на основе синтетических аналогов экзометаболитов. Показано, что при получении комплексов может использоваться два подхода. Первый подход основан на анализе активности предварительно идентифицированных экзометаболитов и их сочетаний, второй подход - на использовании в качестве прототипа состава внеклеточной среды с требуемой активностью.

· Впервые на основе синтетических аналогов экзометаболитов бактерий разработан биологически активный комплекс, предназначенный для подавления роста патогенного штамма E.coli О 75 и обладающий антипатогенной активностью в отношении токсина гемолизина А;

· Зарегистрирована заявка на патент "Средство, ингибирующее жизнедеятельность бактерий Escherichia coli О 75 №5557" № 2012140940 от 26.09.2012.

· Показана возможность использования разработанных подходов для создания комплекса, предназначенного для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613, повышения его антагонистической активности и устойчивости к стрессовым факторам.

Практическая значимость:

1. Разработанные подходы позволяют создавать аналогичные комплексы для регуляции роста продуцентов биологически активных веществ; а также лекарственные препараты с антипатогенной активностью.

2. Разработана технология производства биологически активного комплекса для подавления роста и снижения уровня патогенности штамма E.coli О 75 в виде капель для приема внутрь, позволяющая добиться эффективного смешения восьми экзометаболитов в соотношении от 0,15 до 77 %. Предложены показатели качества и разработан проект фармакопейной статьи предприятия.

3. Материалы по составу и динамике экзометаболитов семи штаммов бактерий; подходы к конструированию биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии (СПХФА) при изучении дисциплины "Технология продуктов микробного синтеза" (акт внедрения от 14.12.2012).

4. На базе ООО "Биотроф" показана возможность включения в рацион животных совместно с биопрепаратом на основе штамма E.coli VL613 комплекса бактериальных экзометаболитов для стимуляции роста данного штамма. Совместное использование биопрепарата и комплекса в концентрации 10 мкг/голову позволило уменьшить дозировку биопрепарата в 4 раза. Кроме того, среднесуточный привес массы у животных, получавших совместно с биопрепаратом комплекс экзометаболитов, увеличился на 10 % по сравнению с приростом в контрольной группе (акт апробации от 09.01.2013г.).

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых "Фармация в XXI веке: эстафета поколений", посвященной 90-летию СПХФА (СПб, 2009), 6-й объединенной научной сессии и 2-ом Международном конгрессе по пробиотикам "Санкт-Петербург-Пробиотики-2009" (СПб, 2009), 12-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме "Санкт-Петербург-Гастро-2010" (СПб, 2010), 1-ой европейской студенческой конференции по микробной коммуникации "1^st European Student Conference on Microbial Communication" (Йена, Германия, 2010), 15-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2010), Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием "Молодая фармация - потенциал будущего" (СПб, 2010, 2011, 2012), 13-ом Славяно-балтийском научном форуме "Санкт-Петербург - Гастро - 2011" (СПб, 2011), Х-ом съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), 9-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (СПб, 2012).

Публикации. Основное содержание диссертации представлено в 18 публикациях, в том числе 5 статей в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованный ВАК РФ.

Связь задач исследования с планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России "Получении и изучение фармакологического действия биологически активных веществ (БАВ) с целью создания инновационных лекарственных средств" (№01201252027 государственной регистрации) и планом научно-исследовательских работ Гос. НИИ ОЧБ ФМБА России.

Основные положения, выносимые на защиту:

· Штаммоспецифичность качественного и количественного состава экзометаболитов, а также их действия на рост бактериальных культур.

· Технология биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов.

· Разработка состава и технологии биологически активного комплекса бактериальных экзометаболитов, предназначенного для подавления роста и экспрессии гена фактора патогенности патогенного штамма E.coli О 75.

· Разработка состава и технологии биологически активного комплекса бактериальных экзометаболитов для стимуляции роста и повышения пробиотического потенциала пробиотического штамма E.coli VL613.

· Технология производства и показатели качества комплексов в виде капель и раствора для приема внутрь.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста, включает 35 таблиц, иллюстрирована 26 рисунками и состоит из введения, обзора литературы по теме исследования и 5 глав экспериментальных исследований, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы, насчитывающего 142 источника, из них 70 на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении приведены актуальность, цель и задачи исследования, его научная и практическая значимость.

Глава 1. Обзор литературы

В обзоре литературы обсуждается концепция, согласно которой развивающаяся популяция микроорганизмов представляется как саморегулируемая система, функционирование которой определяется не только изменением внешних условий, но и влиянием продуцируемых ею метаболитов: специализированных регуляторов и продуктов энергетического или конструктивного метаболизма. Обсуждаются механизмы "чувства кворума" у бактерий и роль в них регуляторных метаболитов. Особое внимание уделено функциям неспециализированных экзометаболитов в развитии микробной популяции. Отдельная глава посвящена роли микрофлоры в жизнедеятельности человека. Освещается регуляторное и энергетическое действие производимых микробиоценозом метаболитов на организм хозяина. Заключительная часть посвящена современным данным о существующих лекарственных препаратах и перспективах создания новых средств на основе специализированных и неспециализированных бактериальных метаболитов.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В работе использовали штаммы бактерий из коллекции ФГУП "ГосНИИ ОЧБ" и СПбНИИВС ФМБА России: Escherichia coli M-17, К-12 VL613, О 75 №5557, №14, Bifidobacterium bifidum 1, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Salmonella enteritidis var.Issatchenko.

Периодическое культивирование энтеробактерий осуществляли на среде М-9 в колбах на качалке. Посевной материал выращивали на твердой среде LB и на жидкой среде М-9. Плотность засева составляла 0,2-0,3 ед. ОП ₄₆₀. Аналогичным образом выращивали смешанные культуры. Число и процентное соотношение бактерий в процессе культивирования определяли по высевам на диагностические среды. Культивирование L. plantarum осуществляли на среде Блаурокка без агара, на среде Блаурокка, разбавленной в 2 раза, и на среде МРС-1. B. bifidum 1 выращивали только на среде МРС-1.

Рост энтеробактерий контролировали по оптической плотности (UV-mini, Shimadzu) на длине волны 460 нм. Определение числа КОЕ L. plantarum и B. bifidum проводили путем подсчета числа колоний в пробирках при последовательных десятикратных разведениях.

Анализ низкомолекулярных карбоновых кислот проводили методом ВЭЖХ на колонке Supelcogel H 2504,6 мм (Sigma-Aldrich) в H₃PO₄ 0,1 % с ацетонитрилом 5 % (скорость потока 0,3 мл/мин, температуры 25^оС и 55^оС). Для анализа аминокислот использовали метод ВЭЖХ их дабсильных производных на колонке Luna 5u C18(2) 2504,6 мм (Phenomenex) (скорость потока 1,8 мл/мин, температура 45^оС) в ступенчатом градиенте ацетонитрила. Для проведения ГХ-МС метаболитов получали их силильные производные, разделение осуществляли на Shimadzu GCMS-QP2010 Plus в режиме программирования температуры.

Биологическую активность внеклеточной среды (ВС), индивидуальных экзометаболитов и их комплексов исследовали при выращивании в колбах на качалке, в пробирках и на агаризованной среде. О биологическом действии ВС, экзометаболитов или их комплексов судили из сравнения мутности в опытных и контрольных пробирках и по относительному приросту биомассы (ОПБ) за время (t) роста культур: ОПБ_t = (D^оп_t-D^oп_о)/(D^к_t-D^к_о), где D^оп_t и D^к_t - оптические плотности соответственно опытной и контрольной культуры через t часов после внесения добавки, D^oп_о и D^к_о - оптические плотности в момент внесения добавки. При выращивании бактерий на агаризованной среде действие экзометаболитов оценивали по значению индексов площади (ИП): ИП= [S(опыт)-S(контроль)]/S(контроль); где S(контроль) и S(опыт) - средние площади колоний на среде без добавки (контроль) и с добавлением экзометаболитов или их комплексов, мм ².

При изучении гемолитической активности E.coli О 75 в колбах на качалке комплекс для подавления роста E.coli О 75 (0,58мг/мл) вносили при достижении ОП ₄₆₀ культуры 0,8-1 ед. ОП ₄₆₀. Через 2-4 часа после внесения комплекса отбирали пробы среды, центрифугировали, супернатант смешивали со средой LB и эритроцитами в соотношении 1:1:2. Смесь инкубировали 1 час при 37^оС. Количество высвободившегося гемоглобина измеряли спектрофотометрически на длине волны 576 нм. Амплификацию фрагмента гена hlyA (NC_007946.1) проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами. Реакционную смесь для ПЦР готовили по стандартной методике. ПЦР проводили в программируемом термостате ТП 4-ПЦР-01-"Терцик", используя программу: 1 цикл: 95 ^оС - 5 мин; 30 циклов: 94 ^оС - 15 сек, 57,4 ^оС - 30 сек, 72 ^оС - 30 сек; 1 цикл: 72 ^оС - 1 мин. Учет результатов осуществляли с помощью электрофореза по стандартной методике. Оценку уровня экспрессии гена hlyA проводили с использованием ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией. Выделение тотальной РНК, ее очистку и обратную транскрипцию осуществляли с помощью специальных наборов реактивов по прилагаемым методикам. Для проведения ПЦР в реальном времени в пробирке готовили реакционную смесь с Таq-ДНК-полимеразой и интеркалирующим красителем Eva Green (Biotium, США). Амплификацию осуществляли в амплификаторе IQ5 (Bio-Rad, США). Оценку уровня экспрессии гена hlyA осуществляли с помощью программы REST 2009 (Qiagen, США). Подготовку к секвенированию кДНК осуществляли по методике, прилагаемой к набору реактивов BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (App. Biosystems, США). Для анализа нуклеотидной последовательности кДНК использовали ABI Prizm 3500 Genetic Analyzer (App. Biosystems). бактериальный экзометаболит пробиотически технология

Влияние комплекса на антагонистическую активность E.coli VL613 изучали методами "инициация роста" и отсроченного антагонизма. При изучении устойчивости E.coli VL613 к стрессовым факторам культуру предварительно инкубировали с растворами комплексов 0,2-50 мкг/мл. Затем подвергали термошоку (52^оС, 15 минут), сублимационному высушиванию или действию желчи (20 %). Титр выживших клеток определяли по результатам высевов на плотную среду LB.

Качественный анализ состава капель и раствора для приема внутрь проводили с использованием ТСХ (аминокислоты) на пластинах DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 в двух направлениях (н-бутанол:аммиак 1:1 и н-бутанол:уксусная кислота:вода 5:3:5), и качественных реакций на анионы кислот карбоновых. Прозрачность, рН, микробиологическую чистоту и электропроводность определяли в соответствии с ГФ XII. Специфическую активность определяли биологическим методом по способности стимулировать рост тест-штаммов в тесте "инициация роста" и при периодическом культивировании. Количественное содержание солей карбоновых кислот и аминокислот определяли методом ВЭЖХ. Сроки годности были определены в соответствии с ГФ XII. Все данные обрабатывали статистически, используя соответствующие (параметрические и непараметрические) критерии достоверности.

Глава 3. Биологические свойства экзометаболитов бактерий

3.1 Состав экзометаболитов, выделяемых пятью штаммами бактерий семейства Enterobacteriacea, B. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3

Методом ВЭЖХ во внеклеточной среде (ВС) энтеробактерий были идентифицированы кислоты: уксусная и муравьиная (все штаммы), молочная (E.coli) и янтарная (E.coli VL613). Штаммы бактерий различались по концентрации накапливаемых кислот: наибольшее количество уксусной выделял штамм E.coli VL613 (10,6 мМ), муравьиной - E.coli №14 (2,8 мМ), молочной - пробиотические E.coli M-17 и VL613 (1,9 мМ). Состав накапливаемых аминокислот также различался от штамма к штамму, причем пробиотические бактерии выделяли аминокислот больше (E.coli VL613-0,41 мМ), чем патогенные (E.coli №14 и S.enteritidis - 0,12 мМ).

Дополнительные сведения о составе ВС были получены методом ГХ-МС, который позволил идентифицировать более 20 соединений, в том числе в-аланин и кислоты: 4-оксибензойную, 2-изопропиляблочную, цитрамалевую, которые участвуют в процессе коммуникативной связи микрофлоры и макроорганизма. Наибольшее число экзометаболитов удалось идентифицировать у патогенного штамма E.coli №14, а наименьшее - у пробиотического М-17. Метод ГХ-МС подтвердил, что состав экзометаболитов является штаммоспецифическим и может служить своеобразным "паспортом" бактерий.

В среде B. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3 были идентифицированы три кислоты: уксусная (ацетат), молочная (лактат) и лимонная (цитрат), причем их концентрации зависели от состава среды и в 10-80 раз превышали соответствующие концентрации у энтеробактерий. Особенностью B.bifidum 1 являлось повышенное выделение ацетата (60 мМ), а L. plantarum 8P-A3 - лактата (157 мМ).

3.2 Динамика экзометаболитов в процессе роста чистых культур бактерий

Одним из проявлений биологических функций экзометаболитов является их динамика в процессе развития популяции. Если бы наличие экзометаболитов в среде являлось следствием их перепроизводства клетками, то следовало ожидать, что концентрации карбоновых кислот и аминокислот будут монотонно увеличиваться в процессе роста численности популяции. Однако в действительности оказалось, что концентрации метаболитов постоянно изменялись, причем эти изменения обычно происходили с характерными для каждого штамма особенностями. На рис. 1 (а) видно, что сравнительно монотонно изменялась концентрация только одной кислоты - уксусной.

Рисунок 1 - Динамика карбоновых кислот

На рисунках в некоторых случаях размер планок погрешностей не превышает размера маркеров.

Кислоты: а) уксусная, б) муравьиная, в) молочная, г) янтарная.

Другая кислота - муравьиная, как правило, появлялась во ВС через 3-4 часа после засева, то есть при некотором ухудшении аэрации. Однако в среде E.coli VL613 она появлялась раньше (рис. 1 б), что свидетельствовало об особой устойчивости к кислороду центрального фермента пути образования формиата - пируват-формиат-лиазы. Лактат в процессе роста E.coli О 75 постепенно накапливался и потреблялся при замедлении темпов роста, а E.coli №14 поглощала лактат дважды: на фазе ускоренного роста и в начале стационарной фазы (рис. 1 в). Кислоту янтарную выделял только штамм E.coli VL613 (рис. 1 г). Это, наряду с ранним появлением формиата, подтверждает его склонность к анаэробному метаболизму.

Циклы выделения и поглощения метаболитов энтеробактериями были еще более выражены в случае аминокислот. Непосредственно после внесения посевного материала все штаммы выделяли лейцин и изолейцин. Кроме того, характерным признаком патогенных бактерий являлось выделение валина и фенилаланина, а пробиотических М-17 и VL613 - серусодержащих аминокислот: метионина и цистеина (рис. 2).

Рисунок 2 - Динамика аминокислот, выделяющихся при культивировании E.coli М-17

Некоторые аминокислоты появлялись в среде в первой половине роста (через 1-2 часа после засева), затем их концентрация резко повышалась и практически сразу падала. Вторая половина роста также характеризовалась пиковыми изменениями концентраций аминокислот. Пиковое выделение аминокислот могло происходить дважды (например, два пика тирозина и треонина для E.coli М-17 на рисунке 2 а), б).

Характер роста B. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3 существенно отличался от роста энтеробактерий. У этих штаммов динамику карбоновых кислот исследовали не только в процессе роста (24-48 часов), но и в течение последующей инкубации культур продолжительностью до 168 часов. Как правило, в течение первых 6 часов роста бактерии потребляли кислоты, изначально содержащиеся в посевном материале, что свидетельствовало о важности присутствия этих соединений в его составе, после чего начинали их активно выделять. После исчерпания питательного субстрата, культуры переходили на стадию голодания, при этом их численность могла монотонно уменьшаться либо периодически возрастать и падать. Такие изменения выживаемости сопровождались колебаниями концентраций кислот.

3.3 Динамика экзометаболитов в процессе роста смешанных культур бактерий

Смешанная культура пробиотического (E.coli М-17) и патогенного (E.coli О 75) штаммов выделяла меньше кислот (уксусной и муравьиной), чем чистые культуры. Количество и динамика кислоты молочной зависели от итога конкуренции двух штаммов (рис. 3 г).

Рисунок 3 - Динамика карбоновых кислот, выделяющихся в процессе культивирования чистых (сплошная кривая) и смешанных (пунктирная кривая) культур E.coli М-17 и О 75: а) - кривые роста ОП ₄₆₀, кислоты: б) - уксусная, в) - муравьиная, г) - молочная

При вытеснении патогенного штамма ее концентрация увеличивалась вплоть до конца культивирования, и в конечном итоге была более чем в 2 раза выше, чем в чистых культурах. Если происходило вытеснение E.coli М-17, то уровень лактата оставался практически таким же, как и в чистых культурах. Для смешанных культур E.coli М-17 и №14, М-17 и S.enteritidis наблюдались аналогичные закономерности. Сравнительный анализ изменения концентрации молочной кислоты и численного соотношения штаммов в смешанной культуре показал, что процесс выделения лактата отражает их "конкурентную борьбу". Таким образом, динамика кислот существенно зависела от присутствия в среде штамма-антагониста, что подтверждает их особую роль во взаимодействии бактерий.

3.4 Биологическая активность экзометаболитов

Изучение активности аминокислот и солей карбоновых кислот (СКК) показало, что они по-разному действовали на рост штаммов: стимулировали его (например, глутаминовая к-та и натрия сукцинат), ингибировали (например, серин, цистеин), либо не оказывали существенного влияния (например, натрия формиат, лизин). Действие одних и тех же метаболитов различалось от штамма к штамму. Например, метионин стимулировал рост пробиотического штамма М-17, но ингибировал рост патогена О 75. Это позволяет рассматривать экзометаболиты как универсальные факторы антагонизма бактерий: выделяя их в окружающую среду, они стимулируют свой рост и тормозят рост конкурентов. Рост пробиотических бактерий ингибировали аспарагиновая к-та, аргинин и глицин. Выделяя эти метаболиты, патогенные бактерии могут подавлять рост "полезных" штаммов. Таким образом, экзометаболиты могут принимать участие в регуляции экологических взаимоотношений микроорганизмов, способствовать поддержанию симбиотических отношений или, напротив, вытеснению штамма-конкурента. Действие СКК существенно зависело от их концентрации. Например, натрия ацетат в низких концентрациях стимулировал рост E.coli М-17, с увеличением концентрации его стимулирующее действие сначала уменьшалось, а затем переходило в ингибирующее.

В целом штаммоспецифичность действия экзометаболитов и особенности их динамики подтверждают то, что они являются не только конечными продуктами метаболизма или автолиза, а выполняют важные регуляторные функции в жизнедеятельности бактериальной популяции.

Глава 4. Разработка технологии биологически активных комплексов на основе бактериальных экзометаболитов

При разработке комплексов на основе бактериальных экзометаболитов использовали два подхода. Разработку комплекса с использованием первого подхода (скрининга активности) начинали с исследования активности индивидуальных метаболитов, выделяемых различными штаммами. Затем изучали действие сочетаний метаболитов, отбирали наиболее перспективные из них и на их основе формировали модельные комплексы. Принципиальным отличием второго подхода (выбор прототипа) являлось то, что разработку комплекса начинали с исследования активности образцов ВС, полученных на различных стадиях культивирования. Затем выбирали образец с максимальной активностью (прототип) и на основе анализа его состава разрабатывали модельный комплекс.

4.1 Разработка технологии комплекса для подавления роста патогенного штамма E.coli О 75 на основе скрининга биологической активности индивидуальных экзометаболитов

Скрининг активности аминокислот и СКК проводили при выращивании E.coli О 75 на твердой и жидкой средах. По характеру действия экзометаболиты были разделены на стимуляторы (например, натрия ацетат, изолейцин, глутаминовая к-та), ингибиторы роста (аланин и валин и др.) и нейтральные по действию соединения. Действие аминокислот и СКК существенно зависело от их концентрации. Так, при увеличении концентрации стимулирующая активность могла меняться на ингибирующую (например, метионин), или наоборот (аспарагин). В парных сочетаниях метаболиты действовали на рост E.coli О 75 иначе, чем индивидуальные соединения. Так два ингибитора в паре оказывали стимулирующее действие (например, лизин и пролин), а сочетания двух стимуляторов, обладали большим стимулирующим эффектом, чем каждая из аминокислот в отдельности (например, аспарагиновая кислота и метионин).

Скрининг активности экзометаболитов позволил выявить наиболее активные ингибиторы роста патогенного штамма E.coli О 75: аланин, метионин, серин, цистеин, валин, глицин, натрия формиат, лактат и ацетат (последний не ингибировал рост, но обладал способностью усиливать действие ингибиторов). На первом этапе разработки был составлен комплекс, включающий серин, метионин и аланин, его добавление в среду в процессе периодического культивирования в концентрации 0,2 мМ значительно ингибировало рост. Добавление к трем аминокислотам цистеина повышало ингибирующее действие. Затем к четырем аминокислотам добавляли пятую (валин, глицин или лейцин), наиболее активным оказался комплекс с глицином. Целью заключительного этапа разработки являлось повышение ингибирующего эффекта комплекса путем добавления к нему СКК: натрия ацетата, лактата и формиата. Включение в состав одной или двух СКК незначительно влияло на активность комплекса, однако добавление всех трех СКК повышало ингибирующий эффект. Таким образом, в результате скрининга активности экзометаболитов был разработан комплекс экзометаболитов для подавления роста патогенного штамма E.coli О 75.

4.2 Биологическая активность комплекса для подавления роста E.coli O75

Разработанный комплекс ингибировал рост только штамма E.coli О 75 и практически не влиял на рост остальных близкородственных штаммов (рис. 5).

Рисунок 5 - Действие комплекса на рост E.coli О75, М-17, VL613, №14 и S.enteritidis при периодическом культивировании

За 1 принят показатель относительного прироста биомассы (ОПБ) без добавления комплекса.

При периодическом культивировании смешанной культуры E.coli О 75 и М-17 патогенный штамм вытеснял пробиотический уже через 3 часа после засева (рис. 6 контроль). Внесение комплекса способствовало повышению титра штамма E.coli М-17 в 2,5 раза и длительному его сохранению в смешанной культуре (рис. 6 опыт). Механизм действия комплекса, по-видимому, заключался в понижении скорости роста E.coli О 75, в результате которого вытеснение М-17 происходило медленнее, и одновременном повышении антагонистической активности E.coli М-17. В целом результаты экспериментов показали, что разработанный комплекс может успешно использоваться для регуляции роста смешанной культуры патогенного и пробиотического штаммов.

Важным фактором патогенности штамма E.coli О 75 является синтез гемолизина - порообразующего токсина. Поскольку одной из задач работы являлась разработка комплекса с антипатогенной активностью, в качестве модели был выбран процесс гемолиза эритроцитов под действием внеклеточной среды E.coli О 75. В процессе роста E.coli О 75 гемолитическая активность в среде выращивания сначала возрастала, затем достигала максимального значения и к концу роста падала (рис. 7).

Рисунок 6 - Действие комплекса на рост смешанной культуры E.coli О75 и М-17

Звездочкой обозначено время добавления комплекса О75 в типовом эксперименте.

Рисунок 7 - Кривые роста и концентрация гемоглобина в процессе выращивания патогенного штамма E.coli О 75 с добавлением комплекса

Добавление в среду комплекса способствовало понижению гемолитической активности в 15 раз. Таким образом, комплекс был активным в отношении, по крайней мере, одного из факторов патогенности E.coli О 75, то есть обладал антипатогенной активностью.

На молекулярном уровне синтез секреторного белка гемолизина детерминируется геном hlyA. При проведении ПЦР было установлено присутствие этого гена в геноме E.coli O75. Секвенирование кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции, подтвердило ее идентичность фрагменту гена hlyA. В результате проведения ПЦР в реальном времени было показано, что через 2 часа после добавления комплекса экспрессия гена гемолизина понижалась в 2,6 раза, а через 4 часа - в 2,9 раза по сравнению с контролем.

4.3 Разработка технологии комплекса для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613 на основе анализа активности внеклеточной среды

При изучении активности образцов ВС E.coli VL613 оказалось, что максимальной стимулирующей активностью обладает образец, отобранный на 4-м часу культивирования. Анализ его состава методом ВЭЖХ позволил идентифицировать четыре карбоновые кислоты и двенадцать аминокислот. Этот состав послужил прототипом для синтетического комплекса (комп. №1), стимулирующая активность которого оказалась даже выше, чем у нативного образца внеклеточной среды. Затем стимулирующий эффект был дополнительно повышен за счет увеличения доли аминокислот (комп. №2). В целях оптимизации состава комплекса желательным являлось сокращение числа его компонентов до минимально необходимого. Первоначально предполагалось удалять компоненты группами, чтобы избежать перебора всех вариантов, однако в процессе работы выяснилось, что целесообразным является последовательное удаление каждого из компонентов. Таким образом, в результате анализа 37 комплексов был выбран наиболее активный комплекс, он стимулировал рост пробиотического штамма E.coli VL613 в концентрации 0,2 мг/л.

4.4 Биологическая активность комплекса для стимуляции роста E.coli VL613

При совместном выращивании патогенный штамм S. enteritidis практически полностью вытеснял пробиотический штамм E.coli VL613 (рис. 8).

Рисунок 8 - Действие комплекса на соотношение штаммов E.coli VL613 и S.enteritidis при культивировании в стационарных условиях

В случае если при засеве в среду вносили комплекс в концентрациях 0,2-8,4 мкг/мл исходное соотношение культур сохранялось, а добавление 34 мкг/мл приводило к полному вытеснению S.enteritidis.

Методом отсроченного антагонизма было показано, что разработанный комплекс в широком диапазоне концентраций (0,05-34мкг/мл) повышал антагонистическую активность E.coli VL613 в отношении патогенных штаммов E.coli О 75 и №14.

Другим немаловажным достоинством комплекса является его способность повышать устойчивость пробиотического штамма к стрессовым факторам. Предварительная инкубация клеток E.coli VL613 с раствором комплекса повышала устойчивость штамма к термическому воздействию. Термошок приводил к гибели 80 % бактериальных клеток, а после инкубирования с комплексом (0,2 мкг/мл), процент термоустойчивых клеток повышался в 4,1 раза. Сублимационное высушивание без специальных защитных сред приводило к уменьшению числа жизнеспособных клеток E.coli VL613 в 180 раз. Высушивание с комплексом повышало выживаемость культуры в 40 раз. После 40-минутной инкубации E.coli VL613 с желчью количество жизнеспособных клеток падало практически в 2 раза. Комплекс (0,84мкг/мл) способствовал выживаемости 97 % клеток.

Таким образом, комплекс на основе бактериальных экзометаболитов повышает пробиотический потенциал штамма E.coli VL613: стимулирует рост, антагонистическую активность и устойчивость к стрессовым факторам.

Глава 5. Разработка технологии производства комплексов бактериальных экзометаболитов в виде капель и раствора для приема внутрь

Комплексы бактериальных экзометаболитов представляют собой смесь 8-10 компонентов в различных концентрациях от 0,17 до 77 %, в связи с чем получение однородного по составу порошка представляет сложную технологическую задачу. Изготовление твердой лекарственной формы было бы возможным при приготовлении водного раствора компонентов и последующем его сублимационном или распылительном высушивании. Однако некоторые компоненты комплексов являются летучими веществами. В этой связи проводилась разработка технологии производства комплексов бактериальных экзометаболитов в виде капель и раствора для приема внутрь.

По результатам проведенных экспериментов в состав жидкой формы был включен консервант - калия сорбат (0,15 %), являющийся наиболее эффективным и биологически безвредным консервантом.

В процессе работы на биологически активный комплекс в виде капель для приема внутрь был разработан проект ФСП "Комплекс бактериальных экзометаболитов для подавления роста и патогенности E.coli O75", одновременно проводилась разработка проекта ТУ на биологически активный комплекс в виде раствора для приема внутрь "Комплекс бактериальных экзометаболитов для стимуляции роста E.coli VL613". В разработанных проектах предложены основные показатели качества капель и раствора для приема внутрь: органолептические свойства, подлинность, рН среды, удельная электрическая проводимость, микробиологическая чистота, специфическая активность и количественное содержание солей карбоновых кислот и аминокислот (таблицы 1, 2).

Таблица 1 - Показатели качества капель для приема внутрь "Комплекс бактериальных экзометаболитов для подавления роста и патогенности E.coli O75"

Наименование показателя	Метод определения	Значение параметра
Описание	Визуальный и органолептический	Прозрачный раствор с характерным запахом
Подлинность:
Аминокислоты	ТСХ	пять пятен
Ацетат-ион	Качественные реакции	Покраснение раствора
Формиат-ион		Черный осадок и блестящий налет
Лактат-ион		Фиолетовое окрашивание
рН среды	Потенциометрический	7,5-7,7
Удел. электрич. проводимость	Кондуктометрический	35,15-35,25 mS/cm
Микробиологическая чистота	Микробиологический	Категория 3А
Специфическая активность	Биологический	При внесении 0,6 г/л в среду М-9 прирост биомассы E.coli O75 за 4 часа роста в условиях периодического культивирования должен составлять не более 50 % от контроля
Количественное определение	Высокоэффективная жидкостная хроматография
аланин		1,52-1,86 г/л
серин		1,85-2,27г/л
метионин		2,54-3,10 г/л
цистеин		2,03-2,47 г/л
глицин		1,35-1,65 г/л
натрия ацетат		74,72-79,32 г/л
натрия формиат		4,96-5,26 г/л
натрия лактат		16,33-17,35 г/л

Показания к применению. Острые кишечные инфекции, вызванные штаммом E.coli O75.

Таблица 2 - Показатели качества раствора для приема внутрь "Комплекс бактериальных экзометаболитов для стимуляции роста E.coli VL613"

Наименование показателя	Метод определения	Значение параметра
Посторонний запах (затхлый, плесневый, гнилостный)	Органолептический	Отсутствие постороннего запаха
Признаки заплесневения	Визуальный	Отсутствие признаков заплесневения
Подлинность:
Аминокислоты	ТСХ	Восемь пятен
Лактат-ион	Качественная реакция	Фиолетовое окрашивание
рН среды	Потенциометрический	3,5-3,7
Удел. электрич. проводимость	Кондуктометрический	0,92-0,94 mS/cm
ОМЧ	Микробиологический	Не более 5Ч105 КОЕ/г
ОЧГ		Не более 1Ч103 КОЕ/г
Наличие патогенных бактерий		Отсутствие патогенных E.coli в 1 г
Специфическая активность	Биологический	При добавлении 0,2 мг/л в пробирки со средой М-9 рост E.coli VL613 (начальная плотность засева 2Ч102 кл/мл) должен наблюдаться на 24±2 часа раньше, чем в контрольных пробирках
Количественное определение
серин	Высокоэффективная жидкостная хроматография	0,144-0,176 г/л
аргинин		0,339-0,415 г/л
треонин		0,130-0,158 г/л
глицин		0,046-0,056 г/л
валин		0,043-0,053 г/л
метионин		0,062-0,076 г/л
фенилаланин		0,027-0,033 г/л
тирозин		0,344-0,420г/л
натрия лактат		0,95-1,01 г/л
натрия сукцинат		7,42-7,88 г/л

Показания к применению. Совместно с пробиотическим штаммом E.coli VL613 и (или) индивидуально при кормлении сельскохозяйственных животных.

Таким образом, разработана технология производства биологически активного комплекса в виде капель для приема внутрь "Комплекс бактериальных экзометаболитов для подавления роста и патогенности E.coli O75", а также комплекса в виде раствора для приема внутрь "Комплекс бактериальных экзометаболитов для стимуляции роста E.coli VL613". В условиях естественного хранения установлен срок годности при температуре 4-8^оС - 1 год (срок наблюдения составлял 1,5 года). Разработана технологическая схема производства, для капель и раствора для приема внутрь она является общей (приложение А).

ВЫВОДЫ

1. Комплексный анализ состава экзометаболитов пяти штаммов энтеробактерий, а также B. bifidum и L. plantarum позволил идентифицировать более 40 метаболитов, состав которых является специфической характеристикой каждого штамма. Показано, что растущая культура активно обменивается экзометаболитами со средой, выделяя их на одних стадиях и поглощая на других, при этом концентрация экзометаболитов (карбоновых кислот) коррелирует со скоростью их роста.

2. Смешанные культуры характеризуются сложными взаимоотношениями двух штаммов, приводящими к изменению метаболизма каждого из штаммов: так при совместном культивировании E.coli М-17 с патогенными штаммами наблюдается повышенный синтез кислоты молочной, изменяются концентрации и других экзометаболитов.

3. Экзометаболиты (соли карбоновых кислот и аминокислоты) обладают биологической активностью: стимулируют или ингибируют рост бактерий, либо не оказывают на него влияния. Действие экзометаболитов является штаммоспецифичным и зависит от их концентрации. Сочетания экзометаболитов действуют на рост иначе, чем индивидуальные соединения.

4. Разработана технология биологически активных комплексов на основе синтетических аналогов экзометаболитов. Показано, что при получении комплексов может использоваться два подхода. Первый подход основан на анализе активности предварительно идентифицированных экзометаболитов и их сочетаний, второй подход - на использовании в качестве прототипа состава внеклеточной среды с требуемой активностью.

5. На основе анализа активности индивидуальных экзометаболитов и их сочетаний разработан комплекс для подавления роста и патогенности штамма E.coli О 75, вызывающего острые кишечные инфекции. Комплекс обладает антипатогенной активностью и повышает конкурентоспособность пробиотического штамма E.coli М-17 при выращивании с патогенным штаммом E.coli О 75.

6. На основе анализа состава и активности внеклеточной среды разработан комплекс экзометаболитов для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613. Комплекс повышает пробиотический потенциал штамма: стимулирует рост, антагонистическую активность и устойчивость к стрессовым факторам (повышенной температуре, сублимационному высушиванию, желчи).

7. Разработана технология производства биологически активного комплекса для подавления роста и патогенности штамма E.coli О 75 в виде капель для приема внутрь.

8. Предложены показатели качества комплекса для подавления роста и патогенности штамма E.coli О 75 в виде капель для приема внутрь и разработан проект ФСП.

9. Разработана технология производства биологически активного комплекса для стимуляции роста пробиотического штамма E.coli VL613 в виде раствора для приема внутрь. Предложены показатели качества и разработан проект ТУ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полевая, Е.В. Сравнительное изучение состава и биологической активности экзометаболитов лечебного, производственного и лабораторных штаммов Escherichia coli / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, Е.П. Яковлева // Материалы межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых "Фармация в XXI веке: эстафета поколений", посвященной 90-летию СПХФА. - Санкт-Петербург, 2009. - С. 120.

2. Полевая, Е.В. Состав и биологическая активность низкомолекулярных экзометаболитов различных штаммов Escherichia coli / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов // Материалы 6-й Объединенной научной сессии и 2-го Международного конгресса по пробиотикам "Санкт-Петербург-Пробиотики-2009". - Санкт-Петербург, 2009. - С. М 32.

3. Полевая, Е.В. Карбоновые кислоты и аминокислоты как ауторегуляторы роста Escherichia coli. Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов // Материалы 12-го Международного Славяно-Балтийского научного форума "Санкт-Петербург-Гастро-2010". - Санкт-Петербург, 2010. - С. М 75.

4. Polevaya, E. Non-specialized low-molecular exogenous metabolites as regulators of quorum sensing in bacteria / E. Polevaya, T. Vakhitov // 1^st European Student Conference on Microbial Communication. - Jena, Germany, 2010. - Р.9

5. Полевая, Е.В. Карбоновые кислоты и аминокислоты как авторегуляторы роста Escherichia coli / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов // Материалы 15-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". - Пущино, 2011. - С. 328-329.

6. Полевая, Е.В. Регуляция роста Escherichia coli бактериальными экзометаболитами Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, Е.П. Яковлева // Материалы Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием "Молодая фармация - потенциал будущего". - Санкт-Петербург, 2011 - С. 120.

7. Полевая, Е.В. Экзометаболиты как регуляторы роста пробиотических и патогенных бактерий / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов // Материалы 13 - го Славяно-балтийского научного форума "Санкт-Петербург - Гастро - 2011". - Санкт-Петербург, 2011. - С. 75.

8. Полевая, Е.В. ВЭЖХ анализ состава и динамики карбоновых кислот в процессе роста и последующей инкубации производственных штаммов Bifidobacterium bifidum 1 и Lactobacillus plantarum 8P-A3 / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, В.А. Емельяненко, А.М. Королюк // Естественные и технические науки. - 2011. - №6. - С. 87-92.

9. Полевая, Е.В. Штаммоспецифические особенности в составе и динамике карбоновых кислот при выращивании бактерий Escherichia coli и Salmonella enteritidis / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, Е.П. Яковлева // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. - Краснодар: КубГАУ, 2012. - №03(77). - С. 1-15 - Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2012/03/pdf/49.pdf

10. Полевая, Е.В. Энтеросорбционные свойства псиллиума (Мукофалька®) и возможные механизмы его действия при кишечных инфекциях / Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, С.И. Ситкин // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. - 2012. - №2. - С. 35-39.

11. Берсон, Ю.М. Разработка композиции, ингибирующей рост и гемолитическую активность штамма Escherichia coli О 75 / Ю.М. Берсон, Е.В. Полевая, Т.Я. Вахитов, Е.П. Яковлева // Материалы II-ой Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием "Молодая фармация - потенциал будущего". - Санкт-Петербург, 2012. - Ч.II - С. 68.