Синергічна дія поверхнево активних речовин nocardia vaccinii imb b-7405 і антифунгальних засобів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 759.873.088.5:661.185

Національний університет харчових технологій

Синергічна дія поверхнево активних речовин nocardia vaccinii imb b-7405 і антифунгальних засобів

Анотація

антифунгальний активний антибіотик флуконазол

У статті досліджено антифунгальну активність щодо грибів родів Candida, Fusarium і Mucor суміші поверхнево-активних речовин (ПАР) Nocardia vaccinii IMB B-7405 та антибіотика ністатину або синтетичного протигрибкового препарату флуконазолу. Встановлено, що ПАР штаму ІМВ В-7405 знижували мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) досліджуваних лікарських засобів. За наявності 60--80% ПАР у суміші з ністатином або флуконазолом МІК щодо Candida albicans Д-6, Candida tropicalis PE-2 і Candida utilis БВС-65 була у 2--32 рази нижчою, ніж мінімальна інгібуюча концентрація антифунгальних засобів. Незважаючи на надзвичайно низьку МІК флуконазолу щодо Fusarium culmorum Т-7 (0,65 мкг/мл), додавання ПАР N. vaccinii ІМВ В-7405 (60--80%) супроводжувалося зниженням цього показника у два рази. Наведені у дослідженні значення мінімальної інгібуючої концентрації щодо грибів роду Candida суміші ПАР штаму ІМВ В-7405 та ністатину (флуконазолу) є порівнянними із встановленими для відомих у світі ефективних лікарських засобів.

Ключові слова: Nocаrdia vacdnii ІМВ В-7405, поверхнево-активні речовини, антифунгальні засоби, синергізм.

Abstract

Synergistic action of nocardia vacciniiimv b-7405 surfactants and antifungal agents

T. Pirog, L. Nikitiuk

National University of Food Technologies

The antifungal activity against fungi of Candida, Fusarium and Mucor genera mixture of Nocardia vaccinii IMV B-7405 surfactants and antibiotic nystatin or synthetic antifungal drug fluconazole was studied in the article. It was found that the surfactants of IMV B-7405 strain decreased the minimum inhibitory concentration (MIC) of the test drugs. In the presence of 60--80% surfactants in mixture with nystatin or fluconazole MIC against Candida albicans D-6, Candida tropicalis PE-2 and Candida utilis BVC-65 was 2--32 times lower than minimum inhibitory concentration of antifungal agents. Despite the extremely low MIC for fluconazole against Fusarium culmorum T-7 (0.65 ^/ml), the addition of N. vaccinii IMV B-7405 (60-- 80%) surfactant was accompanied by decreasing this index twice. The presented minimum inhibitory concentration against fungi of Candida genus mixture of IMV B-7405 strain surfactants and nystatin (fluconazole) is comparable with the one established for the world-known effective drugs.

Key words: Nocardia vaccinii IMV B-7405 Surfactants Antifungal agents Synergism

Article history: Received 12.11.2016 Received in revised form 25.11.2016 Accepted 14.12.2016

Corresponding author: T. Pirog E-mail:

npnuht@ukr.net

Аннотация

Синергическое действие поверхностноактивних веществ nocardia vaccinii imb b-7405 и антифунгальных средств

Т.П. Пирог, Л.В. Никитюк

Национальный университет пищевых технологий

В статье исследована антифунгальная активность по отношению к грибам родов Candida, Fusarium и Mucor смеси поверхностно-активных веществ (ПАВ) Nocardia vaccinii IMB B-7405 и антибиотика нистатина или синтетического противогрибкового препарата флуконазола. Установлено, что ПАВ штамма ИМВ В-7405 снижали минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) исследуемых лекарственных средств. При наличии 60--80% ПАВ в смеси с нистатином или флуконазолом МИК по отношению к Candida albicans Д-6, Candida tropicalis PE-2 и Candida utilis БВС-65 была в 2--32 раза ниже, чем минимальная ингибирующая концентрация антифунгальних средств. Несмотря на чрезвычайно низкую МИК флуконазола по отношению к Fusarium culmorum Т-7 (0,65 мкг/мл), добавление ПАВ N. vaccinii ИМВ В-7405 (60--80%) сопровождалось снижением этого показателя в два раза. Приведенные в работе значения МИК по отношению к грибам рода Candida смеси ПАВ штамма ИМВ В-7405 и нистатина (флуконазола) сопоставимы с установленными значениями известных в мире эффективных лекарственных средств.

Ключевые слова: Nocаrdia vacdnii ИМВ В-7405, поверхностно-активные вещества, антифунгальные средства, синергизм.

Постановка проблеми. В останні десятиліття відзначається значне зростання грибкових захворювань. Це пов'язано з багатьма факторами і, зокрема, з широким застосуванням в медичній практиці антибіотиків широкого спектра дії, імунодепресантів та інших груп лікарських засобів. Мікозам належить одне з провідних місць серед опортуністичних інфекцій [1].

Кандидози -- яскравий приклад опортуністичної інфекції, свого роду «імунологічна драма», де свою роль відіграють фактори агресії й патогенності гриба і фактори антифунгальної резистентності макроорганізму [2; 3]. Причому Candida spp. не є серйозною загрозою здоров'ю імунокомпетентної людини. У той же час на тлі збільшення числа пацієнтів із порушеннями в системах антимікробної резистентності спостерігається значне зростання захворюваності кандидозами.

Крім того, інвазивні грибкові інфекції (Candida spp., Aspergillus spp., Mucorales, Fusarium spp. та ін.) досить часто зустрічаються у внутрішньолікарняних умовах [4]. Ці інфекції важкі в діагностиці і є причиною високої захворюваності й смертності, незважаючи на антифунгальну терапію.

На сьогодні одними з найуживаніших антифунгальних лікарських засобів є полієнові антибіотики (ністатин, леворин, натаміцин, амфотерицин В, мікогептин), похідні імідазолу (міконазол, кетоконазол, ізоконазол, клотримазол, еконазол, біфоназол, оксиконазол) та похідні триазолу (флуконазол, ітраконазол, вориконазол) [5].

У зв'язку з тенденцією до зростання грибкових захворювань (як поверхневих, так і важких вісцеральних мікозів, асоційованих з ВІЛ-інфекцією, онкогематологічними захворюваннями), розвитком стійкості збудників до наявних лікарських засобів, виявленням видів грибів, що раніше вважалися непатогенними, біоплівкоутворенню за участю грибів, зросла потреба в нових ефективних протигрибкових засобах [6; 7]. На теперішній час активно досліджуються препарати біологічного походження [8; 9], у тому числі й мікробні поверхнево-активні речовини (ПАР) [10], які здатні проявляти не тільки ефективну антимікробну активність, а й посилювати антифунгальну дію існуючих лікарських засобів [11; 12].

У попередніх дослідженнях нами було встановлено антимікробну активність ПАР, синтезованих Nocardia vaccinii IMB B-7405 на очищеному та технічному гліцерині [13].

Мета статті: дослідити синергічну дію на деякі гриби поверхнево-активних речовин N. vaccinii IMB B-7405 і антифунгальних лікарських засобів.

Матеріали і методи. Об'єкт дослідження -- штам N. vaccinii К-8, зареєстрований в Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної академії наук України за номером ВМВ В-7405.

N. vaccinii ІМВ В-7405 вирощували в колбах на качалці (320 об./хв) при 30°С упродовж 7 діб в рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 -- 0,5; MgSO4*7^O -- 0,1; CaClx2 H2O -- 0,1; KH2PO4 -- 0,1; FeSO₄*7H₂O -- 0,001, дріжджовий автолізат -- 0,5% (об'ємна частка). Як джерело вуглецю використовували очищений гліцерин у концентрації 2% (об'ємна частка).

У дослідженнях використовували поверхнево-активні речовини, екстрагованіз супернатанту сумішшю Фолча (хлороформ і метанол, 2:1), як описано раніше у [13].

У дослідженні використовували такі антифунгальні засоби:

- ністатин -- полієновий антибіотик (продуцент Streptomyces noursei), механізм дії якого полягає у зв'язуванні із стеринами клітинної мембрани грибів, унаслідок чого мембрана стає нездатною функціонувати як селективний бар'єр, що призводить до втрати основних компонентів клітини. Особливо чутливими до ністатину є гриби роду Candida і Aspergillus;

- флуконазол -- синтетичний засіб, який за хімічною природою є похідним триазолу. Спричиняє фунгістатичну дію, пригнічуючи синтез ергостерину, важливого компонента мембрани грибів. Характеризується високою активністю щодо грибів роду Candida і Cryptococcus.

Для дослідження синергічної дії розчини антифунгальних засобів і ПАР однакової концентрації (0,1 мг/мл) змішували у різних співвідношеннях (табл. 1).

Таблиця 1. Співвідношення антифунгальних засобів і поверхнево-активних речовин у суміші

Антимікробну дію антибіотиків, поверхнево-активних речовин та їх суміші аналізували за показником мінімальної інгібуючої концентрації (МІК). Визначення МІК здійснювали методом двократних серійних розведень у рідкому суслі, як описано раніше [13]. Результати оцінювали візуально за помутнінням середовища: (+) -- пробірки, в яких спостерігали помутніння середовища (ріст тест-культури), (-) -- помутніння не було (ріст відсутній). Мінімальну інгібуючу концентрацію розчину ПАР, антифунгальних засобів та їх суміші визначали як значення концентрації досліджуваних речовин у першій пробірці, де ріст був відсутній.

Як тест-культури використовували гриби Candida albicans Д-6, Candida tropicalis PE-2, Candida utilis БВС-65, Fusarium culmorum Т-7 та Mucor racemosus М-6 з колекції мікроорганізмів кафедри біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій.

Усі досліди проводили в трьох повторностях, кількість паралельних визначень в експериментах становила від 3 до 5. Статистичну обробку експериментальних даних проводили, як описано раніше у [13]. Відмінності середніх показників вважали достовірними при рівні значущості р <0,05.

Результати і обговорення. У табл. 2 наведено дані про антифунгальну активність щодо досліджуваних тест-культур грибів антибіотика ністатину, розчину ПАР N. vaccinii ІМВ В-7405 та їх суміші.

Таблиця 2. Мінімальна інгібуюча концентрація ністатину, ПАР N. vaccinii ІМВ В-7405 та їх суміші щодо тест-культур грибів

Примітка. Під час визначення МІК похибка не перевищувала 5%.

Експерименти показали, що прояв синергічної дії на гриби поверхневоактивних речовин і ністатину залежав від співвідношення цих антифунгальних сполук у суміші й типу тест-культури. Зазначимо, що у більшості варіантів антифунгальна активність суміші ПАР штаму ІМВ В-7405 та антибіотика підвищувалася у разі збільшення вмісту поверхнево-активних речовин. Так, ПАР за їх вмісту у суміші 60--70% (об'ємна частка) знижували МІК ністатину щодо F. culmorum Т-7 і M. racemosus М-6 у 4-15 разів (з 20,5 до 1,3-5,1 мкг/мл) (табл. 2).

Показник мінімальної інгібуючої концентрації щодо C. albicans Д-6, C. tropicalis PE-2 і C. utilis БВС-65 був найнижчим (1,3--5,1 мкг/мл) за наявності у суміші з антибіотиком ПАР у концентрації 75--80, 60 і 70--80 % відповідно. Зазначимо, що за такого вмісту поверхнево-активних речовин МІК ністатину знижувалася у 8--32 рази порівняно із значенням без ПАР (див. табл. 2).

У доступній літературі нам не вдалося знайти інформацію про антифунгальні сполуки, здатні до прояву синергічної активності спільно з ністатином. Разом з тим, у [14] було встановлено, що антибіотик колістин (поліміксин Е) посилює антифунгальну активність ехінокандинів -- нової групи протигрибкових засобів, яким притаманна фунгіцидна активність щодо Candida spp., у т.ч. штамів, резистентних до азолів (флуконазолу, ітраконазолу) і амфотерицину В. Представниками ехінокандинів, дослідження яких розпочалося близько 15 років тому, є каспофунгін [9] -- напівсинтетичний ліпопептид, одержаний на основі метаболітів Glarea lozoyensis, а також амінокандин, синтезований Aspergillus sydowi [14]. Встановлено, що виживання різних штамів C. albicans через 16 год за наявності суміші амінокандину (0,00125 мг/л) і колістину (30 мг/л) становило 20--60%, у той час в аналогічних умовах без колістину -- 80--90%. Автори показали, що позитивна дія колістину полягає у порушенні цілісності плазматичної мембрани дріжджів, що, у свою чергу, підвищує її проникність для антифунгального засобу [14].

Продовженням досліджень, описаних у [14], стала праця [12], в якій встановлено, що інший представник поліміксинових антибіотиків (поліміксин В) проявляє з каспофунгіном синергічну дію щодо стійких до флуконазолу штамів Candida glabrata. Щодо чотирьох із семи досліджених штамів C. glabrata було встановлено синергічну дію суміші поліміксину В і каспофунгіну, щодо одного -- адитивну [12].

На наступному етапі ми аналізували вплив поверхнево-активних речовин N. vaccinii ІМВ В-7405 на антифунгальну активність флуконазолу (табл. 3). Експерименти показали, що так само як і антибіотика ністатину, ПАР штаму ІМВ В-7405 посилювали антимікробну дію і синтетичного протигрибкового засобу. За наявності 70--75% вмісту ПАР у суміші з флуконазолом спостерігали зниження мінімальної інгібуючої концентрації останнього щодо представників роду Candida у 2--8 разів (з 41 до 5,1--20,5 мкг/мл, табл. 3). Незважаючи на надзвичайно низьку МІК флуконазолу щодо F. culmorum Т-7 (0,65 мкг/мл), додавання ПАР N. vaccinii ІМВ В-7405 (60--80%) супроводжувалося зниженням цього показника у два рази. Зазначимо, що нам не вдалося встановити синергічну дію суміші ПАР штаму ІМВ В-7405 і флуконазолу на M. racemosus М-6. З'ясуванню цього явища будуть присвячені наші подальші дослідження.

Таблиця 3. Синергізм антифунгальної активності ПАР N. vaccinii ІМВ В-7405 і флуконазолу

Примітки. Н.в. -- не визначали. Під час визначення МІК похибка не перевищувала 5%.

Літературні дані про синергізм антифунгальної дії мікробних ПАР і протигрибкових препаратів є вкрай обмеженими. Так, у [11] показано, що суміш С15-сурфактину (6,25 мг/мл), синтезованого Bacillus amyloliquefaciens MB 199, і кетоконазолу (0,004 мг/мл) спричиняє синергетичну дію на C. аlbicans SC5314. Концентрації цих препаратів у суміші були нижчими, ніж встановлені для кожної з сполук окремо (0,100 і 0,016 мг/мл, відповідно).

У той же час у літературі є більше відомостей про синергізм дії антифунгальних засобів з іншими, відмінними від мікробних ПАР, сполуками. Так, встановлено, що INK128 (інгібітор mTOR -- протеїнкінази, що бере участь у фосфорилюванні білків) проявляє синергічну дію на Exophiala spp. і Fusarium spp. із золами (ітраконазол, вориконазол, позаконазол) [15]. Ефективна концентрація INK128, що забезпечувала прояв синергічної антифунгальної активності, становила 0,125--4 мкг/мл.

У [16] показано, що антифунгальні рослинні пептиди дефензини HsAFP1, виділені з гейхери (Heuchera sanguinea), посилюють дію каспофунгіну та амфотерицину В на штами C. аlbicans, причому синергічна дія спостерігається як на суспензійні клітини дріжджів, так і клітини у складі біоплівки.

N. Kiraz із співав. [17] досліджували антифунгальну дію на 50 штамів Candida glabrata різних сумішей вориконазолу, флуконазолу та ітраконазолу з каспофунгіном. Синергічний ефект був встановлений для восьми (16%) комбінацій каспофунгіну і вориконазолу і семи (14%) -- каспофунгіну з флуконазолом, проте не з ітраконазолом.

Висновки

Отже, одержані нами результати є одними з перших, що засвідчують можливість використання поверхнево-активних речовин мікробного походження (на прикладі ПАР N. vaccinii ІМВ В-7405) для посилення антимікробної дії протигрибкових лікарських препаратів. Наведені у статті значення мінімальної інгібуючої концентрації щодо грибів роду Candida суміші ПАР штаму ІМВ В-7405 та ністатину (флуконазолу) є порівнянними із встановленими для відомих у світі ефективних антифунгальних засобів.

Література

1. Lyon S. Antifungal prophylaxis: why, what and how? Future Microbiol. 2016; 11(1): 11--15. doi: 10.2217/fmb.15.129.

2. Chin V.K., Lee T.Y., Rusliza B., Chong P.P. Dissecting Candida albicans infection from the perspective of C. albicans virulence and omics approaches on host-pathogen interaction: a review. Int. J. Mol. Sci. 2016; 17(10). doi: 10.3390/ijms17101643.

3. Orasch C., Marchetti O., Garbino J., Schrenzel J., Zimmerli S., Muhlethaler K.,Pfyffer G., Ruef C., Fehr J., Zbinden R., Calandra T., Bille J. Candida species distribution and antifungal susceptibility testing according to European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing and new vs. old Clinical and Laboratory Standards Institute clinical breakpoints: a 6-year prospective candidaemia survey from the fungal infection network of Switzerland. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20(7): 698--705.doi:10.1111/1469-0691.12440.

4. MiceliM.H., Lee S.A. Emerging moulds: epidemiological trends and antifungal resistance. Mycoses. 2011; 54(6): e666--678. doi: 10.1111/j.1439-0507.2011.02032.x.

5. Steinbach W.J., Perfect J.R. Newer antifungal therapy for emerging fungal pathogens. Int. J. Infect. Dis. 2003; 7(1): 5--20.

6. Hagiwara D., Watanabe A., Kamei K., Goldman G.H. Epidemiological and genomic landscape of azole resistance mechanisms in Aspergillus fungi. Front Microbiol. 2016. doi:10.3389/fmicb.2016.01382.

7. Desai J.V., Mitchell A.P., Andes D.R. Fungal biofilms, drug resistance, and recurrent infection. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2014; 4(10). doi:10.1101/cshperspect.a019729.

8. Zida A., Bamba S., Yacouba A., Ouedraogo-Traore R., Guiguemde R.T. Anti-Candida albicans natural products, sources of new antifungal drugs: a review. JMycol. Med. 2016; doi: 10.1016/j.mycmed.2016.10.002.

9. Balkovec J.M., Hughes D.L., Masurekar P.S., Sable C.A., Schwartz R.E., Singh S.B. Discovery and development of first in class antifungal caspofungin (CANCIDAS®) -- a case study. Nat. Prod. Rep. 2014; 31(1): 15--34. doi: 10.1039/c3np70070d.

10. Rautela R., Singh A.K., Shukla A., Cameotra S.S. Lipopeptides from Bacillus strain AR2 inhibits biofilm formation by Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 2014; 105(5): 809--821. doi: 10.1007/s10482-014-0135-2.

11. Liu X., Ren B., Gao H., Liu M., Dai H., Song F., Yu Z., Wang S., Hu J., Kokare C.R., Zhang L. Optimization for the production of surfactin with a new synergistic antifungal activity. PLoS One. 2012; 7(5): e34430. doi: 10.1371/journal.pone.0034430.

12. Adams E.K., Ashcraft D.S., Pankey G.A. In vitro synergistic activity of Caspofungin plus Polymyxin B against fluconazole-resistant Candida glabrata. Am. J. Med. Sci. 2016; 351(3): 265--270. doi: 10.1016/j.amjms.2015.12.014.

13. Pirog T.P., NikitukL. V., Iutynska G.O. Bological properties of Nocardia vaccinii IMV В-7405 surfactants synthesized on byproduct of biodiesel production //Microbiol. Zh. 2016; 78(5): 12--20.

14. Zeidler U., Bougnoux M.E., Lupan A., Helynck O., Doyen A., Garcia Z., Sertour N., Clavaud C., Munier-Lehmann H., Saveanu C., d'Enfert C. Synergy of the antibiotic colistin with echinocandin antifungals in Candida species. J. Antimicrob. Chemother. 2013; 68(6): 1285-- 1296. doi: 10.1093/jac/dks538.

15. Gao L., Sun Y., He C., Li M., Zeng T., Lu Q. INK128 Exhibits synergy with azoles against Exophiala spp. and Fusarium spp. Front Microbiol.2016;7:1658. doi:

10.3389/fmicb.2016.01658.

16. Vriens K., Cools T.L., Harvey P.J., Craik D.J., Spincemaille P., Cassiman D., Braem A., Vleugels J., Nibbering P.H., Drijfhout J.W., De Coninck B., Cammue B.P., Thevissen K. Synergistic activity of the plant defensin HsAFP1 and caspofungin against Candida albicans biofilms and planktonic cultures. PLoS One. 2015; 10(8). doi:10.1371/journal.pone.0132701.

17. Kiraz N., Dag I., Yamac M., Kiremitci A., Kasifoglu N., Oz Y. Synergistic activities of three triazoles with caspofungin against Candida glabrata isolates determined by time-kill, Etest, and disk diffusion methods. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54(5): 2244--2247. doi: 10.1128/AAC.01527-09.

Размещено на Allbest.ru