Аллельный полиморфизм генов IL1B, TNF и его рецепторов у больных ревматоидным артритом и эффективность антицитокиновой терапии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное Государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения РАМН

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Аллельный полиморфизм генов IL1B, TNF и его рецепторов у больных ревматоидным артритом и эффективность антицитокиновой терапии

14.03.09 -Клиническая иммунология, аллергология

Шкаруба Надежда Сергеевна

Новосибирск-2012

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, Академик РАМН Козлов Владимир Александрович;

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Тотолян Арег Артемович;

доктор медицинских наук, профессор Суховей Юрий Геннадьевич.

Ведущее учреждение: ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ" ФМБА России, 197110, г.Санкт-Петербург, ул. Пудожская, 7, тел.8(812) 2351225, факс 8(812) 230 4948.

Защита диссертации состоится «19» апреля 2012 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН (630099, г.Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14).

Автореферат разослан «10» марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Ревматоидный артрит - часто встречающееся воспалительное заболевание суставов, распространенность которого в популяции превышает 1,0% [Сигидин Я.А.,2001; Harris E.D., 1990.]. Одна из ключевых ролей в патогенезе заболевания отводится дисбалансу между продукцией провоспалительных цитокинов, таких как TNF-б, IL-1в, IL-6, IL-8 и противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10, растворимого антагониста IL-1, растворимых TNF рецепторов), с преобладанием продукции первых над вторыми [Feldman M., 1996; Dinarello C.A., 1999.].

Важное значение TNF-б в патогенезе ревматоидного артрита определяется широким спектром биологических эффектов, в том числе его способностью стимулировать синтез других цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IL-8, ГМ КСФ [Brennan F.M., 1989; Haworth, C., 1991; Butler D.M., 1995.], а также способностью вызывать деструкцию хрящевой и костной ткани [Dayer J.M., 1985; Bertolini D.R., 1986]. TNF-б действует через два типа рецепторов TNFRI и TNFRII.

Одно из наиболее ярких достижений фармакотерапии воспалительных заболеваний человека связано с разработкой препаратов моноклональных антител против определенных детерминант иммунокомпетентных клеток или провоспалительных цитокинов [Breedveld F., 2000]. Одним из первых разработанных терапевтических препаратов, блокирующим эффекты TNF-б, был инфликсимаб. Он представляет собой химерные моноклональные антитела, состоящие на 75% из человеческого белка и на 25% из мышиного. Инфликсимаб с высокой специфичностью связывается как с растворимым, так и с мембранно-связанным TNF-б. Однако улучшение течения заболевания на фоне комбинированной терапии с использованием инфликсимаба не наблюдается приблизительно у 30% больных ревматоидным артритом (РА) [Насонов Е.Л, 2008; Lipsky P.E., 2000.] .

В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что аллельный полиморфизм генов цитокинов, вносит существенный вклад в экспрессию конечных продуктов самих белков, влияя тем самым и на процессы, которые регулируют эти медиаторы. Для генов TNF и его рецепторов, а также гена IL1B известен целый ряд аллельных вариантов в промоторных и интронных областях, которые ассоциированы с повышенной или пониженной продукцией цитокина, а также с развитием целого ряда заболеваний, ключевую роль в которых играют данные цитокины (инфекционные, аутоиммунные, онкологические заболевания) [Bayley J-P., 2004; Gordon W. Duff., 2006; Qidwai T., 2011.].

В клинических исследованиях показано, что в сыворотке, в синовиальной ткани и жидкости у больных РА отмечено увеличение концентрации TNF-б, коррелирующее с клиническими признаками активности ревматоидного процесса [Насонов Е.Л., 2000.]. TNF-б реализует свои эффекты через 2 типа рецепторов, которые могут существовать как в мембранно-связанной, так и в растворимой форме и от уровня экспрессии которых зависят биологические эффекты этого медиатора. Использование ингибиторов TNF-б является одним из наиболее эффективных методов терапии у большинства пациентов. Можно предположить, что одной из причин неэффективности использования блокаторов TNF-б в терапии ревматоидного артрита у части больных РА может быть различный уровень продукции и экспрессии TNF-б и его рецепторов вследствие аллельного полиморфизма их генов. Кроме того, на развитие РА оказывает влияние провоспалительный цитокин IL-1в, который также обуславливает многие клинические проявления этого заболевания. Превалирующая роль в патогенезе РА IL-1в или TNF-б, может влиять на эффективность применения инфликсимаба. Аллельный полиморфизм генов цитокинов и их рецепторов является одним из молекулярных механизмов, влияющих на уровень экспрессии медиатора, а, следовательно, и его участие в патогенезе, что в свою очередь может определять эффективность применения ингибитора данного цитокина в качестве метода терапии.

Следовательно, изучение влияние аллельного полиморфизма генов на уровень продукции самих медиаторов и исследование эффективности антицитокиновой терапии блокаторами TNF-б у больных ревматоидным артритом в зависимости от аллельного полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов представляется актуальным и требует всестороннего изучения.

Цель работы: изучение аллельного полиморфизма генов IL1B, TNF и его рецепторов у больных ревматоидным артритом с различной эффективностью антицитокиновой терапии.

Задачи исследования:

1.Определить уровень продукции TNF-б мононуклеарными клетками периферической крови условно здоровых доноров, являющихся носителями различных полиморфных вариантов промотора гена TNF в позиции -238, -308, -376, -857, -1031.

2.Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов гена TNF в позициях -238, -308, -376, -857, -1031 и гена IL1B в позиции -31 и +3954 у больных ревматоидным артритом.

3.Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов генов TNFRI в позициях -609 и -1207 и TNFRII типа в -1709 и -3609 у больных ревматоидным артритом.

4.Исследовать частоту встречаемости полиморфных вариантов генов провоспалительных цитокинов TNF и IL1B в группах больных ревматоидным артритом с различной эффективностью терапии инфликсимабом.

5. Оценить эффективность лечения ревматоидного артрита инфликсимабом с учетом аллельных вариантов генов TNFRI в позициях -609 и -1207 и TNFRII типа в -1709 и-3609.

Научная новизна работы.

В результате проведения работы впервые получены данные о взаимосвязи аллельных вариантов гена TNF в позициях -238G>A и -857C>T с уровнем его спонтанной и стимулированной Кон А продукции МНК ПК условно здоровых доноров.

Впервые выявлено сочетание генотипов -238GG/-308GG/-857CC/-1031NC, носители которого среди условно здоровых доноров характеризуются наименьшей продукцией TNF-б как интактными, так и митоген-стимулированными мононуклеарными клетками в культуре при сравнении с группой носителей остальных генотипов.

Также впервые получены данные о частоте встречаемости сочетания аллельных вариантов промоторных регионов генов TNFRI в позициях -609 и -1207 и TNFRII типа в позициях -3609 и -1709 у больных ревматоидным артритом. Показано достоверное снижение частоты сочетания генотипов TNFRI-609GT + TNFRII-3609CC у больных РА.

Впервые получены данные по ассоциации аллельных вариантов генов TNF в позиции -857C>T и IL1B в позиции -31 T>C с эффективностью антицитокиновой терапии инфликсимабом у больных ревматоидным артритом. Показано, что генотип СС и аллель С полиморфизма промотора гена TNF в позиции -857C>T чаще представлены у больных с неэффективной терапией. Установлено, что генотип -31ТТ гена IL1B чаще встречается у больных с эффективной терапией.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Получены результаты о влиянии аллельного полиморфизма промотора гена TNF в позициях -238 и -857 на уровень продукции конечного белка мононуклеарными клетками, что является одной из причин индивидуальных различий в выраженности иммунных реакций, регулируемых данным медиатором, у носителей этих генотипов в норме и может являться одним из молекулярных механизмов их участия в патологических процессах. Выявлено изменение частоты встречаемости аллельных вариантов генов TNF и его рецепторов у больных РА, по сравнению с группой популяционного контроля, что может являться маркером предрасположенности к указанному патологическому процессу. Установлено, что эффективность терапии инфликсимабом зависит от аллельного полиморфизма генов TNF и IL1B. В силу чего, определение аллельных вариантов этих генов при назначении терапии инфликсимабом может помочь прогнозировать эффективность данного метода терапии у конкретного пациента.

Положения, выносимые на защиту.

1.Аллельный вариант CC гена TNF в позиции -857 ассоциирован с пониженным уровнем продукции медиатора мононуклеарными клетками

2.У больных с ревматоидным артритом наблюдается снижение частоты аллеля С в позиции -857 гена TNF, при этом среди не отвечающих на антицитокиновую терапию блокатором TNF-б (инфликсимаб) больных носители аллеля С и генотипа СС в позиции -857 встречаются достоверно чаще.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1. XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 8-11 июня 2009г., 2. Ежегодном конкурсе-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2010», 15-16 апреля, г. Новосибирск 2010г., 3. Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» Новосибирск 15-17 сентября 2010г., 4. Международном конгрессе EULAR 2010, 16-19 июня 2010 Италия, Рим, 5. 8 отчетной научной конференции НИИКИ СО РАМН 21-23 июня 2011г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ. Подана 1 заявка на патент.

Личный вклад автора в проведение исследования.

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором, либо при его непосредственном участии. Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной иммунологии и на базе отделения ревматологии клиники иммунопатологии ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из обзора литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 228 источников, из них 217 зарубежных. Работа иллюстрирована 2 рисунками и 18 таблицами.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Материал для исследования (образцы цельной крови) получен от условно здоровых доноров: в УФ и НП НСО (ОГУЗ «Новосибирский центр крови»). Выборка популяционного контроля для исследования уровня продукции цитокинов МНК ПК и генотипов сформирована случайным образом из числа жителей г. Новосибирска, согласившихся сдать кровь для исследования (222 человек).

Изучение распределения аллельных вариантов генов IL1B, TNF-б и его рецепторов проводилось у больных РА, находившихся на госпитализации в клинике ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН (г. Новосибирск), ГОУ ДПО СПб МАПО (г.Санкт-Петербург), ГОУ ВПО Рост ГМУ (г. Ростов-на-Дону). У всех пациентов было получено информированное согласие. Выборка больных РА составила 470 человек, из них - женщин: 86,5%, мужчин-13,5%, в возрасте от 18 до 70 лет. Среди пациентов была выделена группа больных, получающих анти-TNF-б терапию инфликсимабом - 103 человека. Внутривенное капельное введение инфликсимаба проводилось в течение не менее 2-х часов в дозе 3 мг\кг, по схеме: недели 0, 2, 6, 14 и т.д. каждые 8 недель. Диагноз РА верифицирован в соответствии критериями AСR [Arnett F.C., 1988]. Среди группы больных ревматоидным артритом, получавших терапию инфликсимабом, все пациенты принимали стабильную дозу базисного препарата на протяжении терапии инфликсимабом и в течение 3-х месяцев, предшествующих ее началу (92,2% получали метотрексат, 1 пациент - сульфасалазин, остальные - лефлуномид,), этим больным не проводилась интенсивная терапии ревматоидного артрита и локальное ведения глюкокортикостеройдов. 78,6% пациентов имели к началу терапии инфликсимабом высокую степень активности заболевания, у остальных была умеренная активность заболевания.

Эффективность терапии инфликсимабом у пациентов с РА оценивалась по критерию EULAR [van Gestel AM, 1996]. Выборка больных ревматоидным артритом, пролеченных инфликсимабом. на основе международного критерия (EULAR), была разделена на 2 группы: пациенты, у которых терапия была эффективна (умеренный и хороший эффект по критерию EULAR), и пациенты, у которых терапия была неэффективна (неотвечающие на терапию по критериюEULAR). Оценка терапии проводилась в сроки: перед 3-4 инфузиями, перед 6 инфузией, перед 9 инфузией.

Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови человека

Кровь брали из локтевой вены в пробирки с K3EDTA (VACUTEST KIMA, Италия). Мононуклеарные клетки (МНК) из цельной крови выделяли по стандартной методике в градиенте плотности фиколл-урографина (с=1.077 г/л)[ Boyum A.1968].

Культивирование мононуклеарных клеток in vitro

Культивирование МНК ПК проводили в 96-луночных круглодонных планшетах (Linbro, США). В каждую лунку помещалось 200 мкл полной культуральной среды, содержащей 0,2 млн. клеток. Для стимуляции МНК ПК использовали Конканавалин А (Кон А) или липополисахарид (ЛПС) («Sigma» Serotyp 055:B5) в концентрации 10 мкг/мл. Время культивирования - 24 часов во влажной атмосфере при температуре +37єС и при концентрации СО2 5%. Перед сбором кондиционной среды клетки осаждали центрифугированием в планшетах при 1000 оборотов/мин в течение 10 мин. Собранные пробы хранились при -20є С до определения в них содержания цитокинов. ревматоидный артрит ген инфликсимаб

Определение количественного содержания цитокинов в кондиционных средах проводили электрохемилюминесцентным методом [Крысов С.В., 2000; Sennikov S.V., 2003], применяя антитела R?D System (UK): anti-hTNF-б #AB-210-NA и #MAB210.

Выделение ДНК

ДНК из цельной крови выделяли сорбционным методом с помощью набора «Проба-НК» (ООО «ДНК-технология», Россия) согласно инструкции производителя.

Генотипирование генов TNF, IL1B, TNFRI и TNFRII проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей рестрикцией продукта амплификации (ПДРФ). ПЦР смесь для амплификации объемом 20 мкл содержала: 75 мМ Tris-HCI, рН 8.8, 20 мМ (NH4)2SO4, 0.01% Tween-20, 0.2 мкг тотальной ДНК, по 0.25 мкМ каждого из праймеров, 0.2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 2.5 мМ MgCl2 и 1-2 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск). Режим термоциклирования зависел от состава праймеров и длины амплифицируемого фрагмента и рассчитывался с использованием программы «Primer Premier 5» (Premier Biosoft International, USA). Все праймеры были синтезированы в ЗАО «Биосан», г. Новосибирск. Генотипирование гена TNF по полиморфизмам -238G/A, -308G/A, -376G/A, -857C/T и -1031T/C [Lin H.J., 2003; Soga Y., 2003; Park K., 2006.], гена TNFRI в позиции -609 [Allen R.A., 2001; Waschke K.A., 2005.], гена TNFRI в позиции -1207 и гена TNFRII в позиции -1709 [Culpan D., 2007], гена IL1B по полиморфизмам +3954C/T и -31С/T [Zeng Z-R., 2003; Lee KA, 2004.] проводилось методом полимеразной цепной реакции с использованием опубликованной структуры праймеров. Для генотипирования гена TNFRII в позиции -3609, размер продукта 331 п.н., последовательности праймеров были подобраны с использованием программы NCBI/ Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi).

Прямой: 5'-ATGCTTTTGTCCATGCAGGT -3'

Обратный:5'-GCTGTACCCCGTATTAGCTG -3'

Затем продукты амплификации подвергали рестрикции соответствующими эндонуклеазами. Для полиморфизмов гена TNF в позиции -238G/A использовалась эндонуклеаза МspI, -308G/A - Bsp19I, -376G/A - Sse9I, -857C/T - Hind II, -1031T/C - BstV9I. Для полиморфизмов генов TNFRI и TNFRII использовались следующие эндонуклеазы: TNFRI -609 - Bst4C I, TNFRI -1207 - Bst8C I, TNFRII -1709 - DseD I, TNFRII -3609- Msp I. Для исследования полиморфизмов гена IL1B использовались эндонуклеазы: в позиции +3954C/T- Taq I, 31C/T- Alu I. («СибЭнзим», Новосибирск). Рестрикционная смесь включала 2,5-5 мкл амплификата и 5-10 единиц активности соответствующего фермента рестрикции, далее инкубировали согласно рекомендациям производителя фермента.

Продукты амплификации и рестрикции анализировали с помощью капилярного электрофореза на станции QIAxcel (Qiagen) или электрофореза в 2% агарозном геле или в 5% ПААГ с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете. Окрашивали гель в растворе этидиума бромида. Молекулярный вес фрагментов оценивался с помощью видеоденситометра и пакета прикладных программ «ImageMasterVDS». (Pharmacia Biotech, USA).

Статистическая обработка данных

Оценку соответствия частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга проводили по критерию ч2. Различие частот аллелей и генотипов устанавливалось с использованием критерия ч2 и точного критерия Фишера. С помощью программы OpenEpi (www.openepi.com) проводилась оценка отношения шансов и 95% доверительного интервала (OR, CI), оценка относительного риска. Корреляционный анализ проводили по методу Спирмена. Связь генотипов с уровнем продукции тестировали, применяя непараметрический дисперсионный анализ рангов - критерий Крускала-Уоллиса (Н) и критерий Мана-Уитни (Z). Расчеты проводили с помощью программ “Statistica 6.0”. Индексы стимуляции продукции рассчитывались как простое отношение концентрации цитокина в кондиционных средах клеток стимулированных митогеном к концентрации в кондиционных средах от нестимулированных клеток.

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе работы были изучены ассоциации аллельных вариантов промоторных регионов гена TNF с уровнем продукции конечного белка мононуклеарными клетками периферической крови у условно здоровых доноров, что необходимо для понимания того, как изучаемый полиморфизм связан с уровнем продукции медиатора. Было показано, что носители генотипа -238GG характеризовались сниженной спонтанной продукцией TNF-б в культурах МНК в сравнении с гетерозиготами -238GА (Н=3,8; Z= -1,92; p=0,05), в тоже время стимуляция клеток КонА вызывала у них более выраженное усиление продукции этого цитокина (Н=3,95; Z= -1,99;p=0,046)(табл. 1, 2).

Таблица 1 Спонтанная продукция TNF-б мононуклеарными клетками периферической крови (пг/мл).

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с носителями альтернативного аллеля (р? 0,05)

Таблица 2 Индексы стимуляции продукции TNF-б митогеном - Конканавалин А в культуре мононуклеарных клеток периферической крови.

Примечание: * - достоверные различия по сравнению с носителями альтернативного аллеля (р? 0,05)

Носители генотипа -857СС характеризовались более низкой продукцией TNF-б в культурах МНК при обработке клеток КонА (Z= -1,98; p=0,047) в сравнении с носителями альтернативного аллеля. (рис. 1). В группе носителей гомозиготного варианта -857СС в сравнении с группой индивидов имеющих альтернативные варианты генотипов -857СТ и -857ТТ также выявлен и более низкий уровень TNF-б в культурах без стимуляции, однако критического уровня значимости эти различия не достигали (рис. 1). Индексы стимуляции продукции TNF-б митогеном КонА, приведенные в таблице 2, также были незначительно повышены в группе носителей аллеля Т в сравнении с гомозиготами СС.

Рис. 1. Продукция TNF-б мононуклерными клетками индивидов с разными аллельными вариантами в позиции -857 промотора гена TNF.

(Приведены медианы и квартили уровней TNF-б в кондиционных средах мононуклерных клеток (n=148) культивированных без митогенной стимуляции (спонтанная) и стимулированных КонА (конА). Индивиды с генотипом -857СС(n=113), индивиды с генотипами -857СТ и -857ТТ(n=35). * - данные имеют статистически значимые отличия (р? 0,05)

Отсутствие статистически значимой ассоциации продукции цитокинов мононуклеарными клетками in vitro с полиморфизмами TNF: -308G>A, -1031T>C, тем не менее, не указывает на полное отсутствие их влияния на экспрессию генов. Вклад этих полиморфизмов в регуляцию экспрессии, может не затрагивать непосредственно конечный уровень секретируемого белка, а реализовываться, например, в регуляции скорости транскрипции или стабильности матричной РНК и иметь специфику в различных типах клеток и тканей. Кроме того, так как TNF-б - это индуцибельный белок, как и большинство иммунорегуляторных медиаторов, то его экспрессию могут вызывать достаточно большое количество молекул эндо- и экзогенного происхождения [Bhart B. 2001] и эффект влияния полиморфизма можно определить при индукции экспрессии TNF-б другими молекулами.

Нужно отметить, что результаты, полученные по ассоциации отдельных генотипов с уровнем продукции TNF-б, согласуются с данными для комбинаций генотипов. Было показано, что носители сочетания генотипов -238GG/-308GG/-857CC/-1031NC, характеризовались наименьшей продукцией TNF-б как интактными (Z= -2,39; p=0,017), так и стимулированными КонА (Z= -2,21; p=0,027) и ЛПС (Z= -2,69; p=0,007) мононуклеарными клетками в культуре при сравнении с группой носителей остальных генотипов (табл. 3).

Подтверждение значимости аллельного полиморфизма промотора гена TNF было получено при сравнении распределения аллельных вариантов в группе популяционного контроля и больных РА.

Распределение генотипов промотора гена TNF в выборке популяционного контроля подчинялось закону Харди-Вайнберга, частоты аллелей и генотипов в исследованных группах представлены в таблице 4. Замена основания в позиции промотора -376 в исследованной нами выборке была крайне редка, что послужило основанием для исключения данного полиморфизма из дальнейшего анализа.

При проведении сравнительного анализа частот аллелей и генотипов промотора гена TNF в исследованных группах не было выявлено статистически значимых различий по частотам для точек -1031 и -308. На предыдущем этапе исследований указанные полиморфизмы также не продемонстрировали значимой ассоциации с уровнем продукции TNF-б мононуклеарными клетками в культуре.

Таблица 3 Продукция TNF-б в культурах МНК ПК у носителей разных сочетаний генотипов TNF

Спонтанная - спонтанная продукция, Кон А - Кон А стимулированная продукция, ЛПС - ЛПС стимулированная продукция; *-достоверные различия по сравнению с остальной популяцией (р? 0,05); данные представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона (пкг/мл) N=135

Анализ частот для позиции -238 выявил статистически значимое повышение частоты гомозигот GG (p=0,03, ч2= 3,623; отношение шансов OR= 2,242, CI95 =1,046-4,806), и статистически значимое повышение частоты носительства аллеля G у больных ревматоидным артритом (0,03, ч2=3,537; отношение шансов OR=2,192, CI95 =1,035-4,642), при этом риск развития РА для таких гомозигот повышался на 4,16%. Таким образом, была показана ассоциация аллельного полиморфизма гена TNF в позиции -238 с ревматоидным артритом, причем именно генотип, ассоциированный с повышенным ответом на стимуляцию Кон А (-238GG), чаще встречается у больных РА. Сравнительный анализ частот выявил отличия в распределении генотипов полиморфного сайта -857C>T в группе больных РА от группы популяционного контроля (табл. 4). Аллель С встречался в группе больных РА статистически значимо реже в сравнении с группой популяционного контроля (ч2=3.051, p=0,04). Распределение частот генотипов полиморфизмов -857C>T группе больных РА имело отклонение от ожидаемого в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга (ч2=9,72; p=0,002), что свидетельствует о наличии факторов влияющих на частоту аллелей и генотипов в группе больных.

Таблица 4 Частоты генотипов и аллелей полиморфизмов гена TNF у больных ревматоидным артритом и группе популяционного контроля

Примечание *- статистически значимое различие в сравнении с группой популяционного контроля (p<0.05)

Обобщая полученные данные можно заключить, что носители генотипа -857СС характеризуются сниженным уровнем стимулированной Кон А продукцией TNF-б по сравнению с носителями альтернативного аллеля, а в группе больных ревматоидным артритом установлено снижение частоты аллеля С в позиции -857. Выявленные различия согласуются с современным представлением о значимой патогенетической роли фактора некроза опухоли при ревматоидном артрите.

Относительно полиморфизма в позиции -857 была показана ассоциация -857Т аллеля с риском развития РА у носителей разных вариантов микросателлитных повторов HLA-DR при проведении семейного анализа [Waldron-Lynch F., 2001]. По данным литературы в исследовании популяции кавказоидов (группа больных РА n=376, группа контроля n=463) генотип -238GG ассоциирован с развитием РА без коррекции групп по полу и возраст [Emonts M., 2011], преобладание генотипа -238GG в группе больных РА по сравнению со здоровыми было также показано в мексиканской популяции (больные РА n=137, контрольная группа n=169) [Rodrнguez-Carreуn A.A., 2005], что согласуется с полученными нами результатами. В работе В.И.Коненкова с соавторами при исследовании популяции г.Новосибирска (больные РА n=125, контрольная группа n=513), были получены аналогичные данные по распределению аллельных вариантов гена TNF в позициях -238G>A и -308G>A между группой контроля и больными ревматоидным артритом. Причем генотип -238GG, как и аллель G в точке -238 достоверно чаще встречается в группе больных РА, что согласуется с полученными нами данными. В отличие от наших данных в работе В.И. Коненкова с соавторами показано статистически значимое снижение частоты генотипа -308GG и аллеля G в группе больных РА [Коненков В.И., 2010].

TNF-б действует через 2 типа рецепторов TNFRI и TNFRII, следовательно, реализация биологических, а в том числе и провоспалительных, эффектов этого цитокина, может зависеть от уровня экспрессии данных рецепторов. Это означает, что развитие патологических процессов, ключевым цитокином в которых является TNF-б, в том числе ревматоидного артрита, может быть обусловлено не только уровнем продукции самого этого цитокина, но и уровнем экспрессии рецепторов. Уровень экспрессии TNFRI и TNFRII может быть обусловлен аллельными вариантами кодирующих их генов, где в результаты точечных замен может происходить изменение уровня транскрипции гена. Поэтому было интересно изучить ассоциацию аллельных вариантов генов TNFRI и TNFRII с ревматоидным артритом.

Распределение генотипов промоторных регионов гена TNFRI в позициях -609 и -1207 и гена TNFRII в позициях -3609 и -1709 в выборке популяционного контроля подчинялось закону Харди-Вайнберга и составило следующие значения (количество человек): -609GG (88), -609GT (96), -609TT (24), -1207CC (48), -1207CG (105), -1207GG (58), -1709AA (187), -1709AT (24), -1709TT (0), -3609CC (69), -3609CT (114), -3609TT (28). Распределение генотипов промоторных регионов гена TNFRI в позициях -609 и -1207 и гена TNFRII в позициях -3609 и -1709 в выборке больных ревматоидным артритом: -609GG (177), -609GT (185), -609TT (61), -1207CC (117), -1207CG (213), -1207GG (132), -1709AA (384), -1709AT (50), -1709TT (2), -3609CC (135), -3609CT (255), -3609TT (76). При проведении сравнительного анализа частот аллелей и генотипов промоторных регионов генов TNFRI в позициях -609 и -1207 и TNFRII в позициях -3609 и -1709 в исследованных группах мы не выявили статистически значимых различий. Тем не менее, при анализе комбинаций, выявлено сочетание генотипов TNFRI-609GT + TNFRII-3609CC частота которого у больных, которая составила 10,4%, статистически значимо была ниже таковой в группе популяционного контроля, где составила 16,35% (ч2=4,016, р=0,02), отношение шансов для этого сочетания генотипов OR=0,5941 (CI95 =0.3668-0.9622), при этом относительный риск ревматоидного артрита для носителей этого генотипа был на 5,9% ниже.

Важное значение в развитии ряда клинических проявлений РА, в том числе разрушение хряща и кости, придается еще одному провоспалительному цитокину - IL-1в. Было установлено, что распределение генотипов гена IL1B в выборке популяционного контроля подчиняется закону Харди-Вайнберга и составляет следующие значения (количество человек): +3954СС (115), +3954СТ (71), +3954 (11); -31ТТ (79), -31ТС (96), -31СС (20). Распределение генотипов гена IL1B в выборке больных ревматоидным артритом составило следующие значения: +3954СС (259), +3954СТ (154), +3954 (37); -31ТТ (186), -31ТС (195), -31СС (58). При проведении сравнительного анализа частот аллелей и генотипов гена IL1B в исследованных группах не было выявлено статистически значимых различий. В работе В.И. Коненкова с соавторами при исследовании популяции жителей Новосибирска (больные РА n=125, контрольная группа n=513) были получены сходные данные по распределению аллельных вариантов гена IL1B. Статистически значимых различий в распределении аллелей между группами также получено не было [Коненков В.И., 2010].

Полученные в работе данные по ассоциации аллельных вариантов гена TNF с уровнем его продукции и по распределению аллельных вариантов гена в группе популяционного контроля и больных РА, согласуются с результатами, полученными при изучении эффективности применения инфликсимаба у больных РА в зависимости от аллельного полиморфизма. При изучении эффективности применения инфликимаба у больных РА (перед шестой инфузией) в зависимости от аллельного полиморфизма гена TNF была выявлена статистически значимая связь эффективности терапии (критерий EULAR) и полиморфизма в позиции -857 промотора гена TNF (распределение генотипов промотора гена TNF у больных РА перед 6 инфузией инфликсимаба представлено в табл.5). Индекс корреляции Спирмена составил для этих параметров R = -0,27 (p=0,01). Было установлено, что генотип СС чаще представлен у больных с неэффективной терапией (ч2=5,27, р=0,02). Отношение шансов для носителей генотипа СС и генотипов СТ + ТТ составляет 0.1, CI95= 0.01272- 0.7998, относительный риск неэффективной терапии анти-TNF антителами у носителей генотипа -857СС выше на 29,29% в сравнении с носителями альтернативных вариантов полиморфизма. Кроме того установлено, что аллель С этого полиморфизма чаще представлен у больных с неэффективной терапией (ч2= 5,015, р=0,03). Отношение шансов для носителей аллеля С и аллеля Т составляет 0.1851, CI95= 0.04226 - 0.8103, относительный риск неэффективной терапии анти-TNF-б антителами у носителей аллеля С в позиции -857 выше на 17,14% в сравнении с носителями альтернативного аллеля. Таким образом, показано, что аллельный полиморфизм гена TNF в позиции -857 ассоциирован с эффективностью терапии инфликсимабом у больных ревматоидным артритом. Причем, носители генотипа -857СС, который, как было показано на предыдущем этапе работы, ассоциирован с более низкой по сравнению с группой носителей остальных генотипов стимулированной КонА продукцией TNF-б МНК ПК, достоверно чаще встречаются среди пациентов с ревматоидным артритом, которые не отвечают на терапию инфликсимабом.

Таблица 5 Распределение генотипов промотора гена TNF у больных РА перед 6 инфузией инфликсимаба

Примечание. * - достоверные различия по сравнению с группой с эффективной терапией (p<0.05)

Поскольку TNF-б реализует свои эффекты через 2 типа рецепторов, на эффективность применения инфликсимаба может влиять уровень их экспрессии. Поэтому было изучено распределение аллельных вариантов промоторных регионов гена TNFRI в позициях -609 и -1207 и гена TNFRII в позициях -3609 и -1709 у больных ревматоидным артритом в зависимости от эффективности терапии инфликисмабом. При анализе эффективности терапии инфликсимабом в зависимости от аллельных вариантов генов TNFRI и TNFRII не было получено достоверных различий между группой отвечающих на терапию и группой с отсутствием эффекта. Однако это не означает, что гены рецепторов не влияют на предрасположенность к разной эффективности терапии. Возможно, имеются другие точки в местах связывания транскрипционных факторов, а также, нельзя исключать возможности влияния комплекса полиморфных сайтов на уровень экспрессии гена, а, следовательно, на предрасположенность к эффективной или неэффективной терапии блокатором TNF-б.

Несмотря на то, что одна из главных ролей в патогенезе РА принадлежит TNF-б, не следует упускать возможный вклад других про- о противовоспалительных цитокинов в развитие этого заболевания. Подтверждением этому служит ряд исследований по ассоциации аллельных полиморфизмов генов IL-10, рецептора IL-6 и других цитокинов с ответом на анти-TNF терапию [Liu C., 2008; Hassan B., 2010]. IL-1в провоспалительный цитокин, имеющий широкий спектр эффектов на клетки организма, способный стимулировать разрушение хряща и кости, которые являются основными мишенями при РА. Можно предположить, что неэффективность анти-TNF-б терапии у ряда пациентов обусловлена повышением патогенетической значимости эффектов IL-1в над эффектами TNF-б в процессе развития болезни. Это в свою очередь может быть обусловлено генетической предрасположенностью к повышенному или пониженному уровню экспрессии гена этого цитокина, что, в свою очередь, может быть обусловлено аллельным полиморфизмом гена IL1B. Поэтому, было изучено распределение аллельных вариантов гена IL1B в позициях -31 и +3954 у больных ревматоидным артритом с разной эффективностью терапии инфликсимабом (табл.6).

Таблица 6 Анализ распределения полиморфных вариантов гена IL1B среди больных РА с разной эффективностью терапии инфликсимабом перед 6 инфузией инфликсимаба

Примечание. * - достоверные различия по сравнению с группой, не ответившей на терапию (p<0.05)

При анализе данных по эффективности терапии перед шестой инфузией препарата инфликсимаб, была выявлена статистически значимая связь эффективности терапии (критерий EULAR) и полиморфизма в позиции -31 гена IL1B. Индекс корреляции Спирмена составил для этих параметров R = 0,25 (p=0,02). Было установлено, что генотип -31ТТ чаще встречается у больных с эффективной терапией (ч2=4,005, р=0,045). Отношение шансов для носителей генотипа -31ТТ и носителей остальных генотипов составляет 5.329, CI95=1.125-25.25, относительный риск неэффективной терапии анти-TNF-б антителами у носителей генотипа -31ТТ ниже на 29,77% в сравнении с носителями альтернативных вариантов полиморфизма. Таким образом, эффективность терапии инфликсимабом ассоциирована с аллельным полиморфизмом гена IL1B.

Выводы

1.Показана сниженная спонтанная продукция TNF-б у лиц с генотипом GG относительно лиц с генотипом GA в позиции -238 промотора гена TNF, а также достоверное увеличение индекса стимуляции продукции TNF-б МНК ПК в ответ на митоген КонА у лиц с генотипом -238GG, что указывает на влияние аллельного полиморфизма промотора гена TNF в позиции -238 на уровень его продукции.

2.Установлен статистически значимый сниженный уровень продукции TNF-б в культурах МНК ПК при обработке клеток КонА у условно здоровых доноров с генотипом -857СС промотора гена TNF по сравнению с носителями альтернативного аллеля, что свидетельствует о наличии связи аллельного полиморфизма промотора гена TNF в позиции -857 с уровнем его продукции.

3.Показано, что среди условно здоровых доноров носители сочетания генотипов гена TNF -238GG/-308GG/-857CC/-1031NC, характеризуются статистически значимой наименьшей спонтанной и митоген-стимулированной продукцией TNF-б, что указывает на связь аллельного полиморфизма гена TNF с уровнем его продукции.

4.При изучении распределения генотипов промотора гена TNF и его рецепторов установлено, что больные ревматоидным артритом характеризуются повышением частоты встречаемости генотипа TNF-238GG и аллеля G в этой позиции, снижением частоты аллеля С в позиции TNF-857 и снижением частоты встречаемости сочетания генотипов TNFRI-609GT + TNFRII-3609CC по сравнению с группой популяционного контроля, что указывает на ассоциированность этих полиморфизмов с заболеванием.

5.При изучении частоты встречаемости полиморфных вариантов генов TNF и IL1B в группах больных РА в зависимости от эффективности терапии инфликсимабом было показано, что генотип СС и аллель С в позиции -857 гена TNF чаще представлены у больных с неэффективной терапией инфликсимабом, а генотип -31ТТ гена IL1B чаще встречается у больных с эффективной терапией инфликсимабом, что свидетельствует о вкладе генетического фактора в эффективность данного метода терапии.

6. При изучении частоты встречаемости полиморфных вариантов генов TNFRI и TNFRII в группах больных РА в зависимости от эффективности терапии инфликсимабом не было выявлено статистически значимых различий.

7.Аллельные варианты генов цитокинов и их рецепторов, ассоциированные с повышенным или пониженным уровнем продукции конечного белка, являются одним из генетических факторов, связанных с развитием ревматоидного артрита и эффективностью применения антицитокиновой терапии при этом заболевании.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Сенникова Н.С., Пискунов А.А., Силков А.Н., Козлов В.А., Сенников С.В. Влияние аллельного полиморфизма гена TNFб на уровень его продукции мононуклеарными клетками здоровых доноров Юго-Западной Сибири. // Материалы XIII Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». - 2009.- Медицинская иммунология.- Т.11. - №4-5. - С.475.

2.Силков А.Н., Сенникова Н.С., Горева Е.П., Сенникова Ю.А., Лопатникова Ю.А. Сенников С.В. Аллельный полиморфизм и экспрессия TNF-б. // Дни иммунологии в Сибири: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием под ред. В.А.Козлова, С.В.Смирновой, В.Т.Манчука. - Красноярск. - 2010. - С. 153-155.

3.Силков А.Н., Сенникова Н.С., Горева Е.П., Сизиков А.Э., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. Генетический полиморфизм промотора гена TNF у больных ревматоидным артритом. // Материалы Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск. - 2010. - Цитокины и воспаление. - Т.9. - №3. - С. 57.

4.Sennikova N., Silkov A., Goreva E., Lopatnikova J., Sennikova J., Herzsog O., Sizikov A., Dolgikh S., Mazurov V., Kozlov V., Sennikov S. Association of single nucleotide polymorphisms in the TNF-a gene with production of TNF-a protein by mononuclear cells from healthy donors and frequency of allelic variants in rheumatoid arthritis.// Annual EULAR congress, Rome, Italy 16-19, abstract. - Ann. Rheum. Dis. - 2010. - V.69 (Suppl. 3). - P.329.

5. Сенникова Н.С., Силков А.Н., Горева Е.П., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В.. Взаимосвязь аллельного полиморфизма гена TNF с уровнем его продукции мононуклеарными клетками периферической крови. // Материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2010» - Новосибирск, Сибмедиздат НГМУ. - 2010. - С. 668.

6Силков А.Н., Шкаруба Н.С., Горева Е.П., Яценко О.П., Садовская В.А., Сенников С.В. Аллельный полиморфизм и альтернативный сплайсинг в системе цитокинов. // «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике». Материалы 8-й отчетной конференции НИИКИ СО РАМН. - Новосибирск. - 2011. - С.46-48.

7.Шкаруба Н.С., Силков А.Н., Калашникова Т.А., Сизякина Л.П., Шульман Ю.Б., Долгих С.В., В.И.Мазуров, Горева Е.П., Герцог О.А., Сизиков А.Э., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. Полиморфизм промотора гена TNF у больных ревматоидным артритом. // «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике». Материалы 8-й отчетной конференции НИИКИ СО РАМН. - Новосибирск. - 2011. - С.139-141.

8.Шкаруба Н.С., Силков А.Н., Калашникова Т.А., Сизякина Л.П., Шульман Ю.Б., Долгих С.В., В.И.Мазуров, Горева Е.П., Герцог О.А., Сизиков А.Э., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. Полиморфизм промотора гена TNF и эффективность антицитокиновой терапии у больных ревматоидным артритом. // Материалы XIV Всероссийского научного Форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». 2011. - Медицинская иммунология. - Т.13. - №4-5. - С.375-376.

9.Shkaruba N., Silkov A., Goreva E., Lopatnikova J., Sennikova J., Sizikov A., Kozlov V., Sennikov S. Association of single nucleotide polymorphism in the TNF-a and IL-1b genes with production of proteins by mononuclear cells from healthy donors. // Annual EULAR congress, London, United Kingdom 25-28 May, abstract. - Ann Rheum Dis. - 2011. -V.70(Suppl3). - P.538

10.Силков А.Н., Шкаруба Н.С., Горева Е.П., Сенникова Ю.А., Лопатникова Ю.А., Герцог О.А., Сизиков А.Э., С.В. Сенников. Полиморфизм промотора гена TNF-а в норме и у больных ревматоидным артритом. // Дни иммунологии в Сибири: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. под ред. В.А.Козлова, С.В.Смирновой, В.Т.Манчук. - Абакан. - Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф.Каганова». - 2011. - С.85-86.

11.Силков А.Н., Шкаруба Н.С., Горева Е.П., Сенникова Ю.А. Продукция цитокинов мононуклеарными клетками у индивидов с разными аллельными вариантами генов. // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2/2(35). - , С.115-116.

12.Силков А.Н., Сенникова Н.С., Горева Е.П., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. Продукция TNF-б и IL-1в мононуклеарными клетками периферической крови у носителей разных аллельных вариантов генов. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012 . - Т.153. - № 1. - С.78-81.

13.Силков А.Н., Шкаруба Н.С., Калашникова Т.А., Сизякина Л.П., Шульман Ю.Б., Долгих С.В., В.И.Мазуров, Герцог О.А., Сизиков А.Э., Козлов В.А. Сенников С.В. Полиморфизм -857С>Т промотора гена фактора некроза опухоли -б и эффективность антицитокиновой терапии у больных ревматоидным артритом.// Медицинская иммунология. - 2012. - Т.14. - №1-2. - С.81-86.

Заявка на патент РФ № 2011128114/15(041699) от 07.07. 2011. «Способ прогнозирования эффективности лечения ревматоидного артрита моноклональными антителами к ФНО-альфа на основе аллельного полиморфизма промотора гена ФНО». Сенников С.В., Силков А.Н., Шкаруба Н.С., Мазуров В. И., Долгих С.В., Шульман Ю.Б., Сизякина Л.П., Калашникова Т.А., Сизиков А.Э., Козлов В.А.

Размещено на Allbest.ru