Дослідження психотропних властивостей та взаємодії з речовинами пригнічувальної та збуджувальної дії нових олігопептидів, гомологічних первинній амінокислотній послідовності ділянки АКТГ 15-18

Размещено на http://www.allbest.ru/

Дослідження психотропних властивостей та взаємодії з речовинами пригнічувальної та збуджувальної дії нових олігопептидів, гомологічних первинній амінокислотній послідовності ділянки АКТГ 15-18

Р.Д. Дейко, С.Ю. Штриголь, А.Н. Прусаков, О.О. Колобов

Національний фармацевтичний університет

ФГУП «Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА России

Досліджені психотропні властивості оригінальних нейроактивних олігопептидів загальної формули Lys-Lys-Arg-Arg, які містять природні амінокислоти, стійкі до дії амінопептидаз крові, їх D-форми, а також N-метильовані похідні. Всі пептиди мають виражену ноотропну активність. Деякі з них виявили стимулювальний вплив на ЦНС в тестах екстраполяційного позбавлення, плавання з навантаженням, антагонізму з етанолом та анксіолітичну активність.

Ключові слова: нейропептиди; психотропні властивості; поведінкові тести

Исследованы психотропные свойства оригинальных нейроактивных олигопептидов общей формулы Lys-Lys-Arg-Arg, содержащих природные аминокислоты, резистентные к действию аминопептидаз крови, их D-формы, а также N-метилированные производные. Все пептиды обладают ноотропной активностью. Ряд олигопептидов проявил активирующее влияние на ЦНС в тестах экстраполяционного избавления, плаванья с нагрузкой, антагонизма с этанолом и анксиолитическую активность.

Ключевые слова: нейропептиды; психотропные свойства; поведенческие тесты

Investigated psychotropic properties original neuroactive oligopeptides of the general formula Lys-Lys-Arg-Arg, which contain naturally aminoacids that are resistant to the action of blood aminopeptidases, their D-forms, as well as N-methylated derivatives. For all the objects found pronounced nootropic activity. Some oligopeptides showed an activating effect on the CNS in the tests of the extrapolation deliverance, swimming with a load, antagonism with ethanol, anxiolytic activity.

Key words: neuropeptides; psychotropic properties; behavioral tests

Пошук нових церебропротекторних засобів є актуальною проблемою сучасної неврології, фармакології та суміжних галузей медицини та фармації [7]. Впродовж останніх десятиліть дедалі більшу увагу науковців та клініцистів привертають пептидергічні нейропротектори [4]. Наразі використовуються такі пептидні церебропротектори та ноотропи як семакс, церебролізин. На різних стадіях клінічних та експериментальних досліджень знаходяться інші препарати.

В НДІ Особливо чистих біопрепаратів (м. Санкт-Петербург) під керівництвом д. біол. наук Колобова О. О. шляхом твердофазного хімічного синтезу створено панель конформаційно обмежених олігопептидів, гомологічних амінокислотній послідовності АКТГ 15-18. Вони містять природні амінокислоти аргінін та лізин, їх D-форми та N-метильовані похідні. Дослідження in vitro вказали на відсутність цитотоксичності та високу стійкість до амінопептидаз крові, що зумовлює їх тривалу дію [11]. Виявлені антигіпоксичні та церебропротекторні властивості пептидів на моделі нормобаричної гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією та церебральною ішемією [2].

Розмаїття механізмів впливу на патологічний процес в нервовій системі зумовлює широкий спектр психотропних властивостей, що виявляють олігопептиди. Зокрема, для відомого олігопептидного нейропротектора семаксу відомим є вплив на холінергічну трансмісію в головному мозку, рівень моноамінів. Також семакс виявляє ноотропну та стреспротекторну дії, стимулює ЦНС [6, 8]. Деякі церебропротектори змінюють свій фармакодинамічний профіль на тлі паралельного застосування інших психотропних засобів. З огляду на викладене актуальним є дослідження психотропних властивостей нейропептидів та з'ясування характеру їх взаємодії з речовинами, які пригнічують та збуджують ЦНС.

Мета роботи визначення можливих видів нейротропної активності нових пептидів: ноотропної, актопротекторної, антидепресантної, протитривожної, а також їх взаємодії з коразолом та етанолом.

Матеріали та методи. Вивчали психотропні властивості тетрапептидів, аналогів ланки АКТГ 15-18, загальної формули Lys-Lys-Arg-Arg. Усі вони мають у своєму складі одну або декілька неприродних форм лізину чи аргініну: Dі/або N-метильовану. Структура пептидів і лабораторні шифри наведені в табл. 1.

психотропний олігопептид амінокислота

Більшість досліджень проводили на білих мишах масою 18-24 г, отриманих із віварію Центральної науково-дослідної лабораторії НФаУ Тест екстраполяційного вивільнення виконували на білих щурах масою 180-220 г. При проведенні фармакологічних випробувань дотримувалися вимог «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, використовуваних для експерименту та з іншою науковою метою» (Страсбург, 1985).

Фармакологічні препарати вводилися інтраназально в дозі 20 мкг/кг за 15-20 хвилин до проведення тесту. Дози пептидів, використовувані у дослідженні, є умовно терапевтичними на моделях ішемії та гіпоксії [2]. З урахуванням пептидної природи препаратів та видів досліджуваної фармакологічної активності як препарати порівняння використовували семакс, який вводили в аналогічному режимі та еквівалентній дозі 20 мкг/кг, і класичний ноотроп пірацетам, що його вводили внутрішньоочеревинно в дозі яка за даними літератури виявляє виразний психотропний ефект 400 мг/кг [3].

Відкрите поле. Локомоторну, орієнтовно-дослідницьку діяльність та вегетативний супровід емоційних реакцій мишей оцінювали у відкритому полі, де протягом 3 хв реєстрували кількість перетнутих квадратів, вертикальних стійок та обстежень отворів, реакцій грумінгу, фекальних болюсів та уринацій.

Умовний рефлекс пасивного уникнення (УРПУ). Для вивчення першої фази пам'яті як показника мнестичної активності ЦНС фармакологічні препарати вводили на фоні скополамінової ретроградної амнезії [6]. Формували УРПУ, наявність якого перевіряли через 24 год. Скополамін вводили в дозі 1,5 мг/кг, мишам групи інтактного контролю внутрішньоочеревинно ізотонічний розчин NaCl, група контролю амнезії отримувала тільки розчин скополаміну. Визначали латентний час входу до темної камери та відсоток тварин, що досягли критерію навченості (не входили до темного відсіку протягом 3 хв).

Екстраполяційне вивільнення (ЕВ). Через 20 хв після введення пептидів або референс-препарату щурів вміщували до циліндра установки та визначали час, потрібний для вивільнення з циліндра шляхом пірнання під його край, а також відсоток щурів, які розпізнали ситуацію впродовж 3 хв [5].

Плавання з навантаженням використовували для оцінки фізичної витривалості. Через 20-25 хв після введення препаратів на корінь хвоста прикріплювали вантаж (10 % маси тварини). Мишей поміщали в басейн довільного розміру з водою кімнатної температури. Реєстрували час плавання до моменту, доки тварина не могла випірнути з води протягом 10 с [5, 7].

Іммобілізаційний тест Порсолта використовували для дослідження антидепресантних властивостей [5, 10]. Мишей фіксували до штативу за кінчик хвоста лейкопластирем на відстані 10 см від поверхні стола. Тривалість іммобілізації (нерухомого зависання) реєстрували секундоміром протягом 6 хв. Також реєстрували кількість епізодів іммобілізації.

Піднесений хрестоподібний лабіринт. Тварин, витриманих у темному місці протягом 5 хв, розташовували на освітленому центральному майданчику, піднесеному на 1 м над підлогою хрестоподібного лабіринту головою до відкритого рукава. Протягом 5 хв реєстрували латентний час входу до темного рукава, кількість відвідувань темних та світлих рукавів, центрального майданчика, кількість тварин, що відразу відвідали світлий або темний рукав, кількість фекальних болюсів та уринацій [5].

Етанольний наркоз (ЕН) використовували для оцінки взаємодії нейропептидів з отрутою депримуючого типу дії. 12,5 % (мас./мас.) розчин етанолу внутрішньоочеревинно вводили мишам (5,5 г абсолютного спирту на 1 кг маси тварини). Реєстрували час наркозної фази інтоксикації з моменту прийняття тваринами бічного положення до пробудження [5].

Коразолові судоми моделювали підшкірним введенням пентилентетразолу (коразолу) в дозі 80 мг/кг [5]. Як препарат порівняння використовували відомий антиконвульсант вальпроат натрію (Депакін, Sanofi, Франція), внутрішньошлунково в дозі 300 мг/кг. Водні розчини пептидів вводили за 20 хв до коразолу. Протягом 60 хв реєстрували латентний період судом, кількість нападів в однієї тварини, % мишей із судомами (клонічними та тонічними), тяжкість судом, час судомного періоду, час смерті, смертність у групах.

Результати наведені в формі середнього та помилки середнього (M ± m). Для статистичної обробки використано t-критерій Стьюдента, а при врахуванні в альтернативній формі кутове перетворення Фішера. Міжгрупові відмінності вважали статистично значущими за умови р < 0,05.

Результати та їх обговорення. У тесті відкритого поля досліджувані препарати знижують суму всіх видів активності. Найбільш виражено це для пептидів КК-2, КК-3 та КК-5. Вони максимально та статистично значущо порівняно з контролем знижують локомоторну (р < 0,05) та виявляють тенденцію до пригнічення орієнтовно-дослідницької діяльності, що свідчить про седативний вплив. Тенденцію до зниження всіх видів активності демонструють також пептиди КК-1 та КК-10, однак пригнічення орієнтовно-дослідницької активності мінімальне для пептиду КК-1 і знаходиться на рівні групи контролю.

Вегетативний супровід емоційних реакцій не зазнав значущих змін у жодній з досліджених груп. Все ж статистично значуще (р < 0,05 порівняно з контролем) почастішання уринацій в групах КК-2 та КК-10 може свідчити про збільшення емоційної лабільності тварин за умов стресу.

На фоні пригнічувального впливу на поведінку у відкритому полі (КК-2, КК-3, КК-5) та тенденції до нього (КК-1, КК-10) усі пептиди позитивно вплинули на мнестичні функції у тесті УРПУ Всі вони статистично значущо (р < 0,05) збільшували латентний період входу до неосвітленої камери у 3,5-5,4 рази порівняно з контролем амнезії, а навченості досягли в різних групах 55-100 % тварин (р < 0,05). Препарат порівняння пірацетам у дозі 400 мг/кг збільшував латентний час у 3,7 рази (р < 0,05). Подібний ефект виявив і семакс, що відповідає даним літератури [9], в дозі в 20 тисяч разів меншій за дозу пірацетаму.

Позитивний вплив пептидів КК-1, КК-3 та КК-5 на когнітивні функції підтверджено в тесті ЕВ. Вони статистично значущо (р < 0,05 порівняно з контролем) зменшували час, витрачений щурами на вивільнення з циліндра (на 39,4 %, 58,3 % та 72,8 % відповідно). Пептид КК-2 майже не впливав на показник, а семакс виявив тенденцію до його зниження (на 16,5 %). Критичну ситуацію опанували 100 % тварин у групах КК-1 та КК-5 та 83% в групі КК-3 проти 43 % у контролі (р < 0,05).

Пептиди КК-1 та КК-5 відзначилися позитивним впливом на фізичну витривалість у тесті плавання з навантаженням. Вони збільшували час плавання на 56,2 % та 36,2 % відповідно (р < 0,05 порівняно з контролем). Тенденцію до збільшення фізичної витривалості виявив також пептид КК-3.

Стимулювальний вплив пептидів КК-1 та КК-5 на ЦНС спостерігався у тесті антагонізму з етанолом. Обидва пептиди зменшували тривалість наркозної фази інтоксикації на 34 % порівняно з контролем (р < 0,05), як і референс-препарат семакс та нейропептид КК-2 (р < 0,05).

За результатами іммобілізаційного тесту антидепресивних властивостей не виявлено. Однак пептид КК-10 та референс-препарат семакс продемонстрували депресогенні властивості. Вони на 63,7 % та 55,7 % відповідно збільшували час іммобілізації (р < 0,05 порівняно з контролем). Подібною була тенденція у пептидів КК-1, КК-3 та КК-5. Зважаючи на стимулювальний вплив нейропептидів, відзначений у попередніх тестах, це може свідчити про особливості фенотипу емоційно-стресової реакції мишей, які використовувалися у дослідах.

Час, проведений мишами в освітлених рукавах піднесеного хрестоподібного лабіринту, свідчить про тенденцію до анксіолітичної дії у пептидів КК-2, КК-3 та КК-5 (пряма кореляція із седативним впливом у тесті відкритого поля). Також зазначені препарати статистично недостовірно збільшували латентний час входу тварин до темного рукава, що свідчить на користь зниження тривожності мишей. Пептид КК-1 достовірно порівняно з контролем (р < 0,05) у 4 рази збільшував цей показник. Поєднання протитривожного та активуючого компонентів дії описане в літературі та є характерним для деяких похідних ГАМК (фенібут, мефебут), що вдало використовуються в неврологічній практиці [1].

На моделі коразолових судом жоден з досліджених нейропептидів не виявив ані проконвульсивних, ані антиконвульсивних властивостей. Однак фармакологічний препарат КК-10 та референс-препарат семакс статистично недостовірно збільшували летальність тварин і тяжкість судом, що свідчить про підвищену збудливість мотонейронів під дією ноотропів [3].

Таким чином, результати дослідження психотропних властивостей олігопептидів та їх взаємодії з етанолом та коразолом свідчать про стимуляцію когнітивних функцій, особливо виразну для пептидів КК-1 та КК-5, які також виявляють позитивний вплив на фізичну витривалість, у цілому активуючи ЦНС. Седативний вплив пептидів КК-2, КК-3 та КК-5, виявлений у тесті відкритого поля, прямо корелює зі зниженням тривожності мишей у тесті піднесеного хрестоподібного лабіринту, що характеризує психотропний вплив цих препаратів як транквілоноотропний. Жоден із досліджених нейропептидів не потенціює дію коразолу, разом з цим препарати КК-1, КК-2 та КК-5 виявляють антагонізм до дії етанолу. За комплексом фармакологічної активності - виразної церебропротекторної, ноотропної, транквілізувальної, алкота актопротекторної - інтерес для поглибленого вивчення становлять нейропептиди КК-1 та КК-5, що містять D-лізин у першому положенні тетрапептидного ланцюга.

Висновки

1. Усі досліджені пептиди - гомологи ланки АКТГ 15-18 виявляють виражений ноотропний ефект на моделі скополамінової ретроградної амнезії, перевищуючи показники референс-препаратів семаксу та пірацетаму.

2. Нейропептиди КК-1 та КК-5, які містять D-лізин у першому положенні амінокислотної послідовності, мають найбільш сприятливий спектр фармакологічної активності, стимулюючи ЦНС у тестах екстраполяційного вивільнення, плавання з навантаженням та виявляючи антагонізм до дії етанолу. Також ці пептиди знижують тривожність тварин у тестах піднесеного хрестоподіб-ного лабіринту та відкритого поля.

3. Пептид КК-10, що має зворотній до ланки АКТГ 15-18 порядок амінокислот у ланцюгові, а також препарат порівняння семакс виявляють депре-согенні властивості.

4. Олігопептиди не демонструють взаємодії з коразолом. Тільки КК-10 виявив тенденцію до збільшення летальності мишей та тяжкості коразолових судом, однак не перевищив показники референс-препарату семаксу. Пептиди КК-1, КК-2 та КК-5 статистично значущо виявляють анта-гонізм до пригнічувальної дії етанолу.

5. Поєднання встановлених раніше церебропротекторних властивостей пептидів КК-1, КК-5 та їхньої ноотропної, транквілізувальної, алкота акто-протекторної дії є перспективним для подаль-шого клінічного використання.

Перелік використаних джерел інформації

1. Багметова В. В. Сравнительное экспериментальное изучение ноотропных свойств аналога ГАМК фенибута и его метилового эфира / [В. В. Багметова, Л. Е. Бородкина, И. Н. Тюренков и др.] // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 10. - С. 467-471.

2. Дейко Р. Д. Экспериментальное исследование церебропротекторных и антиамнестических свойств но вых нейроактивных пептидов / Р. Д. Дейко, С. Ю. Штрыголь, А. А. Колобов // Обзоры по клин. фармакол. и лекарственной терапии. - 2013. - Т. 11. - С. 46.

3. Машковский М. Д. / Лекарственные средства: в 2-х т. Т. 1. - 14-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО Изд-во Новая Волна, 2002. - 540 с.

4. Нейропротекция: модели, механизмы, терапия / Под ред. М. Бэра; пер. с англ. под ред. В. П. Зыкова, П. Р. Камчатнова. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 429 с.

5. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. д. мед. наук А. Н. Миронова. - Ч. 1. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.

6. Черний В. И. Острая церебральная недостаточность / [В. И. Черний, В. Н. Ельский, Г. А. Городник и др.]. Под ред. В. И. Черний. - 4-е изд., испр. и доп. - Донецк: Издатель Заславский А. Ю., 2010. - 434 с.

7. Штрыголь С. Ю. Модуляция фармакологических эффектов при различных солевых режимах / С. Ю. Штрыголь. - Х.: Ависта-ВЛТ, 2007. - 360 с.

8. De Wied D., Jolles J. Neuropeptides derived from pro-opiocortin: behavioral, physiological, and neurochemical effects // Physiol. Rev. - 1982. - Vol. 62, № 3. - P. 976-1059.

9. Iasnetsov V. V. Pharmacological correction of memory impairment caused by a complex extremal action in mice with bilateral ligation of common carotid arteries / V. V. Iasnetsov, Iu. V. Ivanov // Eksp. Klin. Farmakol. - 2004. - № 5 (67). - P. 4-5.

10. Porsolt R. D., Lenegre A. Behavioral models of depression // Experimental Approaches to Anxiety and Depression / J. M. Elliot, D. J. Heal, C. A. MorsMorsden (eds.) - Chichester New York, 1992. - P. 73-85.

11. Strober W. Trypan blue exclusion test of cell viability / W. Strober // Curr. Protoc. Immunol. - 2001. - Appendix 3B.

Размещено на Allbest.ru