Біотехнологічне обґрунтування режиму культивування грибів роду Candida

Размещено на http://www.allbest.ru/

Біотехнологічне обґрунтування режиму культивування

грибів роду Candida

М.В. Рибалкін, Н.І. ФілімоновА,

О.П. Стрілець, Л.С. Стрельников

Національний фармацевтичний університет

Кандидоз небезпечна хвороба, яка вражає шкіру, слизові та внутрішні органи. Для попередження та лікування кандидозної інфекції перспективно використовувати вакцини на основі грибів Candida. Метою роботи було обґрунтовано оптимальної температури та часу культивування грибів Candida albicans та Candida tropicalis. У результаті проведених досліджень було обґрунтовано оптимальний час 6 діб при температурі 25 ± 2 °С для культивування клітин грибів Candida albicans та Candida tropicalis окремо на поживному середовищі агар Сабуро у матрасах.

Ключові слова: кандидамікоз; антиген; вакцина; імунітет; культивування candida.

Кандидоз опасная болезнь, которая поражает кожу, слизистые и внутренние органы. Для предупреждения и лечения кандидозной инфекции перспективно использовать вакцины на основе грибов Candida. Целью работы было обоснование оптимальной температуры и времени культивирования грибов Candida albicans и Candida tropicalis. В результате проведенных исследований было обосновано оптимальное время 6 суток при температуре 25 ± 2 °С для культивирования клеток грибов Candida albicans и Candida tropicalis отдельно на питательной среде агар Сабуро в матрасах.

Ключевые слова: кандидамикоз; антиген; вакцина; иммунитет; культивирование

Biotechnological justification cultivation mode fungi of the genus Candida. Candidiasis dangerous disease that affects the skin, mucous membranes and internal organs. Prevention and treatment of Candida infections perspective to use vaccines, based on fungi Candida. The aim was to study the optimum temperature and time of mushroom cultivation Candida albicans and Candida tropicalis. The studies were justification optimal time 6 days at a temperature of 25 ± 2 ° C for cell culturing fungi Candida albicans and Candida tropicalis separately on agar Sabouraud broth in flasks.

Key words: candidiasis; antigen; vaccine; immunity; cultivation

Сьогодні людство переживає епідемію опортуністичних інфекцій, серед яких мікозам належить одне з провідних місць. Частіше збудниками мікозів є представники роду Саndida. Кандидоз опортуністичний мікоз, що перебігає з ураженням слизових оболонок і шкірних покривів, у хворих із важкими імунодефіцитними станами можливі дисеміновані форми, частіше з ураженням легенів та органів шлунковокишкового тракту [1, 2, 7, 10, 13].

Для попередження та лікування кандидозної інфекції ведуться активні дослідження з розробки вакцин у країнах СНГ, Європи та Америки [5, 8, 9, 11]. Необхідно відзначити, що на сьогодні в Україні не випускається жодної вітчизняної та не зареєстровано жодної імпортної вакцини проти кандидозної інфекції. Дослідники виділяють декілька видів вакцин, таких як убиті або субодиничні [3]. Однак єдиної думки з приводу найефективнішої вакцини не існує. Також останні тенденції з розробки вакцин передбачають створення комбінованих вакцин, які діють одразу проти кількох збудників [6, 14, 15].

Технологія розробки убитої та субодиничної вакцини для попередження та лікування кандидозної інфекції передбачає культивування грибів роду Candida, на основі яких і планується розробка вакцин. Тому першочерговим завданням є обґрунтування технологічного режиму культивування грибів роду Candida.

Для культивування грибів можуть бути використані рідкі та щільні середовища. Однак при культивуванні грибів на рідкому середовищі необхідно проводити тривалі та дорогі процедури очищення, які не завжди забезпечують повне очищення від компонентів поживного середовища, продуктів метаболізму, а їх введення у подальшому разом з вакциною можуть викликати супутні імунні або алергічні реакції. Таким чином, культивування грибів роду Candida доцільно проводити на щільних середовищах. Відомі поживні середовища для виділення дріжджеподібних грибів роду Candida: м'ясопептонний глюкозний агар, середовище Сабуро, пивне суслоагар, морквяний агар, морквянокартопляний агар та інші. За даними літератури агар Сабуро є оптимальним поживним середовищем для культивування грибів роду Candida [12].

Для розробки кандидозної вакцини необхідно визначити штами або види мікроорганізмів, які є найрозповсюдженішими або головними збудниками кандидозної інфекції. Згідно з даними літератури при видовій ідентифікації виділених грибів від хворих на кандидозну інфекцію встановлено, що практично в усіх випадках захворювання збудниками хвороби є гриби виду Candida albicans. Другим за частотою виділення є вид Candida tropicalis, який зустрічається, як правило, в асоціації з Candida albicans. В окремих випадках (виявлені Candida parapsilosis, Candida glabrata і Candida krusei також в асоціації з Candida albicans або Candida albicans та Candida tropicalis) [2, 4, 5, 10]. Таким чином, перспективно проводити дослідження з видами Candida albicans та Candida tropicalis для розробки комбінованої вакцини.

Культивування грибів роду Candida різними дослідниками проводилося на матрасах з агаром Сабуро при температурі від 17 ± 2 °С до 35 ± 2 °С тривалістю від 2 до 20 діб [5, 8, 12]. Культивувати гриби роду Candida більше 20 діб недоцільно, оскільки культура починає старіти та втрачати свої антигенні властивості.

Метою даної роботи було обґрунтування оптимального часу та температури культивування клітин грибів Candida albicans та Candida tropicaiis на поживному середовищі агар Сабуро.

Матеріали та методи. Усі дослідження проводили у ламінарному боксі, підтримуючи асептичні умови. У дослідах використовували гриби Candida albicans штам ССМ 885653 та Candida tropicaiis штам АТТС 20336.

Клітини грибів Candida albicans та Candida tropicaiis окремо культивували у пробірках з агаром Сабуро. Агар розплавляли на водяній бані та заливали по 10,0 мл в стерильні пробірки, які вкладали під кутом для збільшення площі висіву культури гриба. Пробірку з агаром витримували у термостаті протягом 24 годин при температурі 33 ± 2 °С та протягом 24 годин при температурі 25 ± 2 °С для перевірки агару Сабуро на стерильність візуально та методом мікроскопування. Далі клітини грибів Candida albicans та Candida tropicaiis окремо висівали у пробірку з агаром Сабуро, використовуючи петлю, яку перед висівом прожарювали у полум'ї горілки. Пробірки з висівами культивували у термостаті при температурі 25 ± 2 °С протягом 48 годин та перевіряли культури на мікробіологічну чистоту візуально та методом мікроскопування. Біомасу штамів грибів Candida змивали розчином ізотонічного стерильного 0,9 % натрію хлориду по 5,0 мл на пробірку. Далі одержані клітини грибів Candida окремо культивували у матрасах. Для цього попередньо агар Сабуро розплавляли на водяній бані та по 150,0 мл заливали у стерильні матраси. Матраси з агаром витримували у термостаті протягом 24 годин при температурі 33 ± 2 °С та протягом 24 годин при температурі 25 ± 2 °С для перевірки агару Сабуро на стерильність та методом мікроскопування. Далі попередньо одержані змиви з пробірок з агаром Сабуро культур грибів Candida albicans та Candida tropicalis окремо висівали у матраси з агаром Сабуро. Матраси з висівами культивували у термостаті при температурі від 17 ± 2 °С до 34 ± 2 °С тривалістю від 2 діб до 14 діб. Кожну добу відзначали кількість клітин грибів Candida albicans та Candida tropicalis, також перевіряли культури на мікробіологічну чистоту візуально та методом мікроскопування. Одержані культури змивали 25,0 мл ізотонічного 0,9 % розчину натрію хлориду, інтенсивно збовтуючи матрац до повного переходу клітин гриба з поверхні агару Сабуро до розчину. Для визначення кількості клітин грибів в суспензії підраховували їх у камері Горяєва та за стандартним показником каламутності.

Результати та їх обговорення. За результатами даних видно, що перші 4 доби відбувається активний ріст клітин грибів Candida albicans та Candida tropicalisпри всіх температурних режимах. Починаючи з 6 доби і далі, кількість клітин грибів поступово стає константою і майже не змінюється. А саме кількість клітин грибів Candida albicans становила 8 х 1088 х 109 в 1 мл та кількість клітин грибів Candida tropicalis становила 7 х 1087 х 109 в 1 мл. Необхідно відзначити, що при температурі 25 ± 2 °С кількість клітин перестає змінюватися на 6 добу, при інших температурах це відбувається дещо пізніше. Однак кількість клітин грибів при температурі 25 ± 2 °С дещо збільшувалася після 6 доби, однак їх кількість не змінювалася настільки суттєво, що культивування більше 6 діб можна вважати економічно невигідним. Також враховуючи те, що культури після 6 доби культивування починають «старіти» і відповідно у них послаблюються антигенні властивості, їх тривале культивування недоцільне.

Результати досліджень росту клітин на агарі Сабуро в матрасах окремо грибів Candida albicans та Candida tropicalis наведені у табл. 1 та 2.

Висновки

культивування гриб сandida

1. Обґрунтовано оптимальний час 6 діб для культивування клітин грибів Candida albicans та Candida tropicalis окремо на поживному середовищі агар Сабуро у матрасах.

2. Визначено оптимальний температурний режим 25 ± 2 °С культивування клітин грибів Candida albicans та Candida tropicalis окремо на поживному середовищі агар Сабуро у матрасах.

3. Визначена кількість клітин грибів Candida albicans та Candida tropicalis, що становить відповідно 8 х 1088 х 109 та 7 х 1087 х 109 в 1 мл зми вів з матрасів при культивуванні протягом 6 діб при температурі 25 ± 2 °С.

Перелік використаних джерел інформації

1. Борщ С. К. Комбіноване застосування протигрибкових засобів і пробіотиків у комбустіології для лікування та профілактики кандидозів і синдрому подразненого кишечника / С. К. Борщ, Т. Р. Масляк // Сучасна гастроентерол. 2011. № 4. С. 3039.

2. Голубка О. В. Поширення кандидозів, загальна характеристика збудника, особливості лабораторної діагностики / О. В. Голубка // Ann. of Mechnikov Institute. 2011. № 2. С. 5159.

3. Жукова Н. В. Современные вакцины: характеристика и классификация / Н. В. Жукова, И. М. Кривошеева // Крымский терапевт. журн. 2013. № 2. С. 99104.

4. Капустина О. А. Видовой состав и биологические свойства грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека / О. А. Капустина, Л. Е. Логачева, О. Л. Карташова // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2009. Т. 4, № 24. С. 179181.

5. Пат. 2445109 Российская Федерация, МПК7А 61 K 36/062, A 61 K 47/02 C 12 N 1/14. Ассоциированная вакцина против кожного кандидоза плотоядных, способ изготовления ассоциированной вакцины против кожного кандидоза плотоядных, способ профилактики и терапии кожного кандидоза плотоядных / А. М. Литвинов, Н. А. Апанасенко. 2010127796/10. Заявл.: 07.07.2010. Опубл.: 07.07.2010.

6. Петров Р. В. Иммуногены и вакцины нового поколения / Р. В. Петров, Р. М. Хаитов. М.: ГЭОТАРМедицина, 2011. 608 с.

7. Anaul Kabir M. Candida infections and their prevention / M. Anaul Kabir, Zulfiqar Ahmad // ISRN Preventive Medicine. 2013. P. 113.

8. Cassone A. Development of vaccines for Candida albicans: fighting a skilled transformer / A. Cassone // Nature Rev. Microbiol. 2013. Vol. 11. P. 884891.

9. Carvalho A. Host defense pathways against fungi: the basis for vaccines and immunotherapy / A. Carvalho // Front. Microbiol. 2012. Vol. 3. P. 19.

10. Diekema D. The changing epidemiology of healthcareassociated candidemia over three decades / [D. Diekema, S. Arbefeville, L. Boyken et al.] // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2012. № 73. P. 4548.

11. Han Y. Comparison of two Candida mannan vaccines: the role of complement in protection against disseminated candidiasis / Y. Han, K. Y. Rhew // Arch. Pharm. Res. 2012. № 35. P. 20212027.

12. Janelle M. Hare Sabouraud agar for fungal growth / M. Hare Janelle // Laboratory Protocols in Fungal Biol. 2013. P. 211216.

13. Leibund GutLandman S. Immunity to fungi / S. Leibund GutLandman, M. Wutrich & T. Hohl // Curr. Opin. Immunol. 2012. № 24. P. 110.

14. Nabel G. J. Designing Tomorrow's Vaccines / G. J. Nabel // New Eng. J. Med. 2013. Vol. 6, № 368. Р. 55160.

15. Skibinski A. G. David. Combination vaccines / A. G. Skibinski David, C. Barbara Baudner, Singh Manmohan, T. O. 'Hagan Derek // Glob. Infect. Dis. 2011. Vol. 3, № 1. P. 6372.

Размещено на Allbest.ru