Филогенетический анализ М. tuberculosis, выделенных у больных химиорезистентным туберкулезом легких

П.І. Потейко¹, А.П. Герілович², А.В. Рогожин¹, О.С. Константиновська¹, O.O. Ляшенко³, С.А. Сапко², О.С. Солодянкін², В.І. Болотін²

^{1 Харківська медична академія післядипломної освіти,}

^{2 Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини, Харків,}

^{3 Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна.}

Мета роботи - вивчити спектр резистентності у різних штамів M. tuberculosis, виділених у хворих на хіміорезистентний туберкульоз легень, що перебували на лікуванні у стаціонарах Харкова та Харківської області.

Матеріали та методи. З вересня 2014 р. по вересень 2015 р. за допомогою VNTR-генотипування нами вивчено 93 штами M. tuberculosis, отриманих від пацієнтів з ХРТБ легень.

Результати та обговорення. Усім хворим проводили клініко-рентгенологічні та лабораторні дослідження згідно з чинним протоколом, а також VNTR-генотипування штамів мікобактерій туберкульозу (МБТ). Для VNTR-генотипування використовували 5 пар праймерів, які відповідають ETR-локусам. У 41 (44 %) пацієнта діагностовано мультирезистентний туберкульоз легень і у 52 (56 %) - туберкульоз з розширеною резистентністю. В результаті VNTR- генотипування у 69 % випадках серед виділених штамів зустрічалися генотипи Beijing. Найчастіше спостерігалася резистентність мікобактерій туберкульозу (МБТ) до стрептоміцину.

Висновки. Відмінностей в структурі хіміорезистентності до антимікобактеріальних препаратів I ряду залежно від штамів МБТ не виявлено. У структурі хіміорезистентності до антимікобактеріальних препаратів II ряду залежно від штамів МБТ визначено, що стійкість МБТ до Km, PAS і Et виявлялася достовірно частіше у штаму LAM порівняно з Beijing.

Ключові слова: туберкульоз, Mycobacterium tuberculosis, генотип, резистентність, Харківська область, полімеразна ланцюгова реакція.

Phylogenetic analysis of M. Tuberculosis, obtained from patients with chemo-resistant pulmonary tuberculosis

Р.І. Poteiko¹, А.Р. GoriLovych², A.V. Rogozhin¹, O.S. Konstantynoska¹, O.O. Liashenko³, S.A. Sapko², O.S. SoLodiankin², V.I. BoLotin²

¹ Kharkiv Medical Academy of Postgraduate Education, Kharkiv, Ukraine,

² Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine, Kharkiv, Ukraine,

³ V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, Ukraine.

Objective - to study the spectrum of resistance at the different strains of MBT recived from patients with DRTB (drug resistant tuberculosis) that treated in TB hospitals of Kharkiv and Kharkiv region.

Materials and methods. From September 2014 for September 2015 by means of VNTR genotyping we studied 93 strains of M. tuberculosis received from patients with lungs DRTB.

Results and discussion. Clinicoradiological and laboratory researches conducted with all patients according to WHO (World Heals Organization) protocols, and also VNTR genotyping of Mycobacteria tuberculosis strains (MBT). For VNTR genotyping were used 5 pairs of primers according to ETRloci. In 41 (44 %) of patients were diagnosed with MDRTB and at 52 (56 %) had tuberculosis with extended resistance. As a result VNTR genotyping in 69 % cases among the distinguished strains were genotypes of Beijing. More often there was resistance of MBT to streptomycin.

Conclusions. Differences in the structure of chemo resistance to I-st line of drugs depending on the strains of МBT were not found. It was detected that resistance of MBT to Km, PAS and Et appeared more often at the strains of LAM in compare with Beijing in the structure of the chemo resistance to antimycobacterial drugs to II series based on strains of MBT.

Keywords: tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, strains, Kharkiv region, resistance, VNTR.

Введение

На сегодняшний день туберкулез является актуальной медико-социальной проблемой не только в Украине, но и во всем мире [5, 7].

На фоне постепенного снижения эпидемических показателей на современном этапе угрозу представляет распространение химиорезистентного туберкулеза (ХРТБ) в Украине [4, 8].

Согласно приказу МЗ Украины № 620 от 04.09.2014 г., мультирезистентный туберкулез (МРТБ) - это форма туберкулеза, при которой пациент выделяет микобактерии туберкулеза (МБТ), резистентные как минимум к изониазиду и рифамипину, а часто и к большому количеству противотуберкулезных препаратов I и II рядов, что подтверждено лабораторным методом в тесте медикаментозной чувствительности. Туберкулез с расширенной медикаментозной резистентностью (РРТБ) - резистентность МБТ одновременно к изониазиду, рифампицину и к одному из двух групп противотуберкулезных препаратов II ряда - аминогликозидам (амикацин, канамицин и капреомицин) и фторхинолонам [2, 9, 13, 14].

По данным ВОЗ, в Украине МРТБ выявлено у 16 % больных, которым первично установлено диагноз туберкулеза, и у 44 % больных с рецидивом заболевания. Около 8 % впервые заболевших прерывают лечение, 12 % умирают [4, 7, 10, 12].

Количество выявления случаев химиорезистентного туберкулеза за последние 10 лет увеличилось практически в три раза благодаря внедрению методов молекулярной диагностики. Из общего количества больных МРТБ 13 % составили больные с РРТБ [1, 3, 7, 8, 14].

С развитием молекулярной генетики стало возможным проводить генетическое типирование МБТ, что позволяет различать штаммы возбудителя и определять их роль в дальнейшем течении заболевания.

Рисунок. Распределение штаммов МБТ у пациентов с химиорезистентным туберкулезом легких

Разнообразные генетические семейства M. tuberculosis представлены в разных географических регионах, например, Beijing, Haarlem, LA-M (Latin American and Mediterranean), Africanum, а также неидентифицированные штаммы, условно названные генотипами индивидуальных профилей (ГИП), и некоторые другие широко распространены и поддерживают на высоком уровне эпидемиологические показатели туберкулеза. В целом ряде наблюдений обнаружено, что случаи тяжелого течения и неэффективного лечения часто связаны с заражением штаммами МБТ семейства Beijing [3, 11, 15].

Цель работы - изучить спектр резистентности у различных штаммов M. tuberculosis, выделенных у больных химиорезистентным туберкулезом легких, находившихся на лечении в стационарах Харькова и Харьковской области.

Материалы и методы

С сентября 2014 г. по сентябрь 2015 г. нами изучено 93 случая ХРТБ легких у пациентов, находившихся на лечении в стационарах Харькова и Харьковской области. Пациентов отбирали слепым методом.

Пробы мокроты культивировали на питательных средах, после чего отбирали и проводили инактивацию возбудителя по разработанной нами схеме с использованием влияния температурного режима и лизирующегося раствора с гуанидин тиоционатом (документы поданы на получение патента). Это позволяло обеспечить биобезопасность и провести достоверные ПЦР исследования. Экстракцию ДНК проводили согласно с инструкцией к набору реагентов Diatom DNA Prep 200 (ТУ 9398-00173867468-2012). Амплификацию проводили с использованием набора реагентов GenPak PCR Core согласно с листом-вкладышем (ТУ 9398-001738674468-2012). Для VNTR генотипирования использовали 5 пар праймеров, которые соответствуют ETR-локусам, на базе лаборатории молекулярной диагностики ННЦ "Института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины". Амплификацию проводили за следующими режимами: начальная денатурация при 95 °С - 5 мин, далее в течение 35 циклов с денатурацией при 94 °С 15 с, отжигом при температуре 62 °С - 15 с и элонгацией при 72 °С - 25 с. Финальную элонгацию проводили при 72 °С - 5 мин. На подготовительном этапе для приготовления раствора ТБЕ (х 1) использовали борную кислоту (Н₃ВО₃, НПФ "Син^- биас"), соль етилентетрауксусной кислоты (ЭДТА, C₁₀H₁₄O₈N₂Na₂, Sigma-Aldrich, ООО, США), Трис (C₄H₃₁O₃N, Sigma-Aldrich, ООО, США). Для приготовления агарозного геля использована агароза производства Serva (Германия) и бромид этидия (C₂₁H₂₀N₃Br) производства Sigma-Aldrich ООО (США). В целях определения размера ампликона использовали маркер молекулярной массы 100 bp Ladder (ООО "Изоген", РФ).

Статистическая обработка результатов произведена с помощью Excel 2007 (Microsoft, лиц. № RW2FR-7DFDD-TCF8J-9K9BJ-MJ678).

Результаты и обсуждение

Из 93 пациентов было 80 % (n = 74) мужчин и 20 % (n = 19) женщин. Возраст пациентов колебался от 23 до 84 лет. Средний возраст составил (49 ± 1,2) года.

Всем больным проводили клинико-рентгенологическое и лабораторное исследования согласно "Унифицированному клиническому протоколу первичной, вторичной (специализированной) и третичной (высокоспециализированной) медицинской помощи. Туберкулез", утвержденному приказом МЗ Украины № 620 от 04.09.2014 г. [6].

Результаты VNTR-генотипирования отражены на рисунке.

У всех пациентов с ХРТБ наблюдался распространенный туберкулез легких с массивным микобактериовыделением, которое было подтверждено бактериоскопически и культурально.

Из 93 пациентов с ХРТБ легких у 41 (44 %) установлен диагноз МРТБ, а у 52 (56 %) - РРТБ.

Произведено исследование МБТ на медикаментозную чувствительность на жидких (BACTEC 960) и плотных питательных средах. Результаты устойчивости к антимикобактериальным препаратам (АМБП) I ряда отражены в табл. 1.

Таблица 1. Устойчивость МБТ различных штаммов к АМБП I ряда устойчивость M. tuberculosis

Таблица 2. Устойчивость МБТ различных штаммов к АМБП II ряда устойчивость M. tuberculosis

Таким образом, достоверных статистических различий по частоте устойчивости выделенных штаммов МБТ к АМБП I ряда не выявлено (P > 0,05).

Результаты устойчивости к АМБП II ряда отражены в табл. 2.

Итак, частоту устойчивости к Km, PAS и Et выявляли достоверно чаще у штамма L-AM в сравнении с Beijing (p < 0,05).

Выводы

В Харьковской области ситуация по ХРТБ остается сложной. У 56 % из проанализированных 93 случаев ХРТБ легких выявлен РРТБ к АМБП. Преобладал штамм Beijing - 68,8 % случая.

Различий в структуре химиорезистентности к АМБП I ряда в зависимости от штаммов МБТ не выявлено.

В структуре химиорезистентности к АМБП II ряда в зависимости от штаммов МБТ определено, что устойчивость МБТ к Km, PAS и Et выявлялась достоверно чаще у штамма L-AM в сравнении с Beijing.

В целях получения более убедительных данных по филогенетическим связям штаммов МБТ со спектром их устойчивости к АМБП необходимо проводить более широкомасштабные исследования в тесном сотрудничестве врачей и молекулярных биологов.

устойчивость антимикобактериальный химиорезистентный туберкулез

Список литературы

1. Бажора Ю.І., Часникова М.М., Польова С.П., Левицька І.А. Молекулярна епідеміологія туберкульозу // Клінічна та експериментальна цитологія.-- 2010.-- № 2.-- С. 138--140.

2. Дымова М.А., Чередниченко А.Г., Ширшова А.Н. и др. Молекулярные основы возникновения лекарственной устойчивости у Mycobacterium tuberculosis // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: биология, клиническая медицина. - 2012. - № 2. - С. 243-251.

3. Ляшенко А.А. Методы генотипирования во фтизиатрии // Туберкульоз, легеневі хвороби, ВІЛ-інфекція. - 2015. - № 1 (20). - С. 98-103.

4. Наказ МОЗ України № 620 від 04.09.2014 "Уніфікований клінічний Протокол первинної, вторинної (спеціалізованої) та третинної (високоспеціалізованої) медичної допомоги. Туберкульоз".

5. Тодоріко Л.Д., Петренко В.І., Гришин М.М. Резистентність мікобактерій туберкульозу: міфи та реальність // Туберкульоз, легеневі хвороби, ВІЛ-інфекція. - 2014. - № 1. - С. 60-67.

6. Туберкульоз в Україні: Аналітично-статистичний довідник за 2004-2014 роки) // За ред. О.К. Толстанова. - К.: Вища школа,- 2015. - 102 с.

7. Фещенко Ю.І., Мельник В.М. Організація контролю за хіміорезистентним туберкульозом. - К.: Здоров'я. - 2013. - 704 с.

8. Фещенко Ю.І., Мельник В.М., Ільницький І.Г Основи клінічної фтизіатрії: посібник для лікарів: у 2 томах. - К. - Львів: Атлас, 2011. - 1363 с.

9. Cowan L.S., Mosher L., Diem L. et al. Variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis isolates with low copy numbers of IS6110 by using mycobacterial interspersed repetitive units // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40. - P. 1592-1602.

10. Hashimoto R. et al. Concordance of variable-number tandem- repeat (VNTR) and large sequence polymorphism (LSP) analyses of Mycobacterium tuberculosis strains // Infect. Genet. Evol. - 2010. - Vol. 10, N 7. - P. 913-918.

11. Joseph B.V., Soman S., Radhakrishnan I. et al. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis isolates from Kerala, India using IS6110-RFLP, spoligotyping and MIRU-VNTRs // Infect. Genet. Evol. - 2013. - Vol. 16. - P. 157-164.

12. Kwara A., Schiro R., Cowan L.S. et al. Evaluation of the epidemiologic utility of secondary typing methods for differentiation of Mycobacterium tuberculosis isolates // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41, N 6. - P. 2683-2685.

13. Lu B., Zhao P., Liu B. et al. Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from Beijing, China assessed by Spoligotyping, LSPs and VNTR profiles // BMC Infectious Diseases. - 2012. - Vol. 12. - P. 372.

14. Migliori G.B., Ortmann J., Girardi E. et al. Extensively drug- resistant tuberculosis, Italy and Germany/SMIRA/TBNET Study Group // Emerg. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 13, N 5. - P. 780-782.

15. World Health Organization. "WHO report 2014: Global tuberculosis control". - 2014, Geneva, Switzerland. - 273 p.

Размещено на Allbest.ru