Обоснование применения молекулярно-биологических методов для диагностики и лечения одонтогенных воспалительных заболеваний головы и шеи

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

14.01.14 - Стоматология (мед. науки)

03.02.03 - Микробиология (мед. науки)

Обоснование применения молекулярно-биологических методов для диагностики и лечения одонтогенных воспалительных заболеваний головы и шеи

Башилов Леонид Игоревич

Москва 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор ПАНИН Андрей Михайлович

доктор медицинских наук, профессор ЦАРЕВ Виктор Николаевич

Официальные оппоненты:

Робустова Татьяна Григорьевна - доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России, профессор кафедры стоматологии общей практики ФПДО).

Червинец Вячеслав Михайлович - доктор медицинских наук, профессор (ГОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России», профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии).

Ведущее учреждение:

ФГБУ «Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства России»

Защита состоится «____» ___________ 2012 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.03 при ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России по адресу: 127006 Москва ул. Долгоруковская д. 4. Почтовый адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская д. 20 стр.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета» (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а)

Автореферат разослан _____ ________________2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Гиоева

1. Актуальность проблемы

В настоящее время, рядом авторов, отмечено увеличение частоты заболеваемости тяжелыми формами флегмон с неблагоприятными исходами (Бернадский Ю.И 2000; Царев В.Н., Ушаков Р.В. 2010; ). Среди основных факторов, определяющих данную патологию, выделяют изменение микрофлоры и ее биологических свойств, в частности увеличение количества антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов (Царев В.Н., Ушаков Р.В. 2010; Шаргородский А.Г. 2002). В настоящее время при данных заболеваниях обнаруживают ассоциации микроорганизмов. В состав ассоциаций могут входить, как неспорообразующие анаэробные бактерии, так и факультативно-анаэробные виды (Порфириадис М.П., Шулаков В.В. и др. 2008; Al-Qamachi LH, Aga H et al. 2010). Анаэробно-аэробные ассоциации часто состоят из 3-4 видов, которые вступают в антагонистические и синергические отношения. Именно этим обстоятельством объясняется существенное ухудшение клинической картины заболевания, появление резистентных форм микроорганизмов (Poeschl P.W., Spusta L. et al. 2010; ).

Наиболее часто (19 - 23 %) встречающимися анаэробными компонентами в микробных ассоциациях при воспалительных процессах челюстно-лицевой области являются представители группы Baсteroides spp. Приблизительно в 8 % случаев, определяют фузобактерии, вейлонеллы, пропионибактерии (Бернадский Ю.И 2000; Порфириадис М.П., Шулаков В.В. и др. 2008).

Многие вопросы этиологии и патогенеза, профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области до настоящего времени остаются недостаточно решенными, что объясняет постоянный интерес и внимание к ним ряда исследователей (Шаргородский А.Г. 2002; Bratton TA, Jackson DC 2002). Для успешного лечения воспалительных заболеваний имеет значение ранняя диагностика, в том числе и определение состава микробной флоры. В настоящее время на это может уходить до 10 суток. За это время состояние больного может усугубиться.

В связи с этим совершенствование бактериологического метода, а также поиск новых молекулярно-генетических методов диагностики при лечении пациентов с острыми и хроническими одонтогенными воспалительными заболеваниями является актуальной проблемой современной стоматологии.

Цель работы

Повышение эффективности диагностики и лечения одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний лица и шеи на основании молекулярно-генетических методов исследования.

Задачи работы

1) Оценить эффективность применения молекулярно-генетических методов исследования в диагностике и лечении одонтогенных воспалительных заболеваний.

2) Сравнить результаты диагностики одонтогенных воспалительных заболеваний при бактериологическом и молекулярно-генетическом методах исследований.

3) Выявить взаимосвязь между видовым составом микробной флоры и клинической картиной заболевания.

4) Разработать алгоритм микробиологической и молекулярно-генетической диагностики возбудителей одонтогенных воспалительных заболеваний.

5) Оценить эффективность применения препарата моксифлоскацин при лечении одонтогенных воспалительных заболеваний головы и шеи.

Научная новизна

В результате проведенных исследований проведена комплексная оценка микробного пейзажа при острых и хронических воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области. При проведении исследования использовалась тест-система Micro-Ident plus (Германия) для определения генетических маркеров 6 агрессивных видов бактерий: Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum/ periodonticum, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum, Eikenella corrodents, Capnocytophaga sp. (S.gingivalis, C. ochraces, C.sputigena) и тест-системы Мультидент 5 (Россия) для определения генетических маркеров 5 агрессивных видов бактерий: Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia (Baсteroides forsythus), Treponema denticola для этиологической диагностики одонтогенных воспалительных процессов, в том числе одонтогенных флегмон. Распространенность этих видов бактерий при одонтогенных флегмонах также не изучена. На основании полученных данных разработан диагностический алгоритм микробиологического и молекулярно-генетического определения возбудителей острых и хронических воспалительных заболеваний ЧЛО, позволяющий оценить клиническое течение заболевания и возможность возникновения осложнений.

Практическая значимость работы

Проведенные исследования позволили разработать алгоритм микробиологической и молекулярно-генетической диагностики с использованием тест-систем Micro-Ident plus (Германия) и тест-системы Мультидент 5 (Россия), пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области, что позволяет повысить эффективность лечения данной патологии.

С целью повышения качества диагностики воспалительных процессов ЧЛО предложено использование молекулярно-генетических методов исследования для выявления генетических маркеров возбудителей воспалительных процессов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Молекулярно-генетический метод диагностики возбудителей острых и хронических гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области эффективнее традиционного бактериологического метода исследования.

2. Тест-система Mult-Ident plus (Германия) и тест-система Мультидент-5 (Россия) могут быть использованы в диагностики одонтогенных воспалительных процессов целью выявления агрессивных видов бактерий.

3. Сопоставление результатов бактериологического выделения микроорганизмов с данными молекулярных исследований позволяет обосновать целесообразность применения молекулярных методов исследования для экспресс-диагностики воспалительных заболеваний ЧЛО.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику работы кафедры факультетской хирургической стоматологии и имплантологии МГМСУ, а также кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ.

Результаты работы также внедрены в практику хирургического отделения клинико-диагностического центра МГМСУ, а также в практику Центра стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ.

Материалы диссертации используются в учебном процессе для студентов 3-4 курса, интернов, клинических ординаторов и аспирантов кафедры факультетской хирургической стоматологии и имплантологии, а также кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии.

Внедрен в практику кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ набор реактивов Micro-Ident plus (Германия) для выявления 6 видов бактерий на основе молекулярно-генетических методов исследования - Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum/ periodonticum, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum, Eikenella corrodents, Capnocytophaga sp. (S.gingivalis, C. ochraces, C.sputigena).

Личное участие автора

Автором проведено обследование и лечение 49 пациентов с острыми и вялотекущими одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями лица и шеи. Автор провел анализ данных полученных при молекулярно-генетическом методе исследования, осуществлял забор проб для проведения бактериологических исследований.

Апробация работы

Основные материалы диссертационной работы были доложены:

§ на 8-м Всероссийском стоматологическом форуме Дентал-Ревю 14-16 февраля 2011, Москва

§ на XXXIII Итоговой конференции молодых ученых МГМСУ, Москва, 2011 год.

Диссертация апробирована 15.03.12 на совместном заседании кафедр факультетской хирургической стоматологии и имплантологии и кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии и пропедевтической стоматологии ГБОУ ВПО МГМСУ федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 5 из которых в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа включает в себя введение, 4 главы: «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты собственного исследования», «Обсуждение результатов», а так же выводы, практические рекомендации и библиографический список. Материал работы изложен на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирован 39 рисунками и 6 таблицами. Список литературы включает 126 отечественных источника и 78 зарубежных.

2. Основное содержание работы

Материалы и методы исследования

Общее количество пациентов составило 49 человек, которые были разделены на 2 группы в зависимости от течения воспалительного процесса: острые и вялотекущие.

Методика проведения хирургического лечения пациентов

Под комбинированным обезболиванием и инфильтрационной анестезией 10-40ml 0,5 % Sol. Lidocaini производили разрез кожи с учетом анатомических образований (сосуды, нервные волокна) длиной 3 - 15 см. Далее послойно проходили до воспалительного инфильтрата Полутупым путем осуществляли ревизию пораженных клетчаточных пространств. Получали от 5 до 30 мл гноя. В рану устанавливали трубочные дренажи. Дренажи фиксировали в ране йодоформным тампоном. Гемостаз по ходу операции. Накладывали антисептическую повязку.

Методика бактериологического исследования

Исследуемый материал (гнойный экссудат, содержимое раны) забирали с помощью транспортной системы, содержащей среду Эймса без угля.

Дальнейшее бактериологическое исследование проводили в соответствии с общепринятыми правилами клинической анаэробной микробиологии. Доставку материала в лабораторию осуществляли в пределах 5 - 6 часов. Посев исследуемого материала осуществляли секторальным методом на плотную питательную среду. Учет количества выросших колоний осуществляли с помощью бинокулярной лупы. Проводили пересчет количества колоний образующих единиц (КОЕ) через десятичный логарифм lg для удобства последующей статистической обработки.

Проводили количественный секторальный посев на среды, предназначенные для культивирования бактерий в аэробных и анаэробных условиях.

Проведение молекулярно-генетического метода исследования

Определение ДНК Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia (Baсteroides forsythus), Treponema denticola с помощью набора реактивов “Мультидант-5”. Материал для исследования забирали с помощью сорбирующих штифтов для высушивания корневых каналов и помещали в пробирку Эпиндорф содержащую физиологический раствор. (Рис 1)

Рисунок 1 Перенос материала в пробирку для транспортировки в лабораторию

Образцы для исследования доставляли в лабораторию кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ в течение 2-х часов, выделяли из них ДНК с помощью набора реагентов “Пробоподготовка Универсальная” или хранили при - 30оС до использования. Амплификацию ДНК пяти агрессивных видов микробов A. actinomycetemcomitas, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia и T. denticola проводили в термоциклере “Терцик МС-2” (“ДНК-технология”, Москва) с помощью мульпраймерного ПЦР набора “Мультидент-5” (ООО НПФ “Генлаб”). Клонированные образцы ДНК анализировали гель-электрофорезом в 1,6 % агарозе после окрашивания бромистым этидием. Для амплификации ДНК P. micra (Peptostreptococcus micros), F. nucleatum/ periodonticum, C. rectus, E. nodatum, E. corrodents, Capnocytophaga spp. (S. gingivalis, C. ochraces, C. sputigena), использовали набор праймеров системы Мicro-IDent®plus компании Hain Lifescience (Германия).

Результаты исследования и их обсуждение

Из гнойного отделяемого, полученного при хирургическом вмешательстве, выделяли образцы ДНК. С помощью молекулярно-генетических методов исследований идентифицировали маркеры наиболее вирулентных агрессивных видов I порядка и II порядка.

Анализ обратной гибридизации включал денатурацию ампликона ДНК и нанесение полученного образца на нитроцелюлозную полоску, содержащую специфические зонды пяти видов бактерий, контрольный зонд для выделенной ДНК и контроль конъюгата. Ампликоны, связавшиеся с комплементарным зондом, визуализировали после добавления конъюгата стрептавидина со щелочной фосфатазой. Результаты считывали по предоставленному шаблону.

С наибольшей частотой в гнойном экссудате у обследованных нами пациентов были выявлены ДНК-маркеры трех вирулентных видов бактерий - агрессивных видов 1 порядка: T. forsythia - в 73 %, P. gingivalis - 47 % образцов. A. actinomycetemcomitas были выявлены у 27 % пациентов.

Из представителей второй группы потенциально агрессивных бактерий, в экссудате полученном при вскрытии одонтогенных воспалительный заболеваний, с наибольшей частотой (64 %) выявляли ДНК-маркеры P. intermedia - 67 %, T. denticola - 20 % F. nucleatum, P. micra (ранее относящиеся к виду P. micros) . Представителей рода Capnocytophaga spp. выявили с одинаковой частотой в 18 % случаев, E. nodatum - в 9 % образцов. C. rectus и E. corrodents нами обнаружены не были. (рис. 2)

Рисунок 2 Относительная частота встречаемости агрессивных видов первого и второго порядка

Динамика клинических симптомов и состава микробной флоры при лечении острых воспалительных процессов

Мы провели оценку количественного состава микрофлоры в зоне хирургического вмешательства до и после операции при применении разных схем антибактериальной терапии (группа сравнения получала моксифлоксацин (17 человек), а контрольная группа - традиционный препарат - амоксициллин/клавунат натрия (12 человек). Оба препарата использовали в инъекционной форме, после получения результатов молекулярно-генетического метода исследования. Продолжительность курса - 5 суток.



Рисунок 3 Количественный состав микробной флоры у пациентов на 3-и сутки после операции по поводу острых одонтогенных гнойно-воспалительных процессов (n=29)

Количество микробов основных резидентных и агрессивных видов в послеоперационной ране в большинстве случаев оказалось статистически достоверно ниже в основной группе пациентов, получавших моксифлоксацин (P<0,05).



Рисунок 4 Количественный состав микробной флоры у пациентов на 5-и сутки после операции по поводу острых одонтогенных гнойно-воспалительных процессов (n=29)

Неприятным фактом явилось появление в ране у некоторых пациентов контрольной группы (у 3-х из 12-и) дрожжеподобных грибов Candida spp. в количестве 4,50,5.

В тоже время наиболее вирулентные агрессивные виды - Porphyromonas spp. и Prevotella intermedia, а также Staphylococcus aureus «удерживали» свои позиции.



Рисунок 5 Количественный состав микробной флоры у пациентов на 7-е сутки после операции по поводу острых одонтогенных гнойно-воспалительных процессов (n=29)

Клиническое течение раннего послеоперационного периода отображают данные о частоте проявлений клинических симптомов в разные сроки наблюдения.

Рисунок 6 Динамика клинических симптомов при лечении острых воспалительных процессов в группе сравнения



Рисунок 7 Динамика клинических симптомов при лечении острых воспалительных процессов в основной группе

Динамика клинических симптомов и состава микробной флоры при лечении вялотекущих воспалительных заболеваний

При операциях по поводу вялотекущих воспалительных процессов, прежде всего, гипореактивных форм флегмон и абсцессов, риск развития осложнений воспалительного характера существенно возрастает, вследствие инфицирования раны вирулентной флорой из хронических очагов на фоне крайне низкой реактивности организма (Т.Г. Робустова, 2004; В.Н. Царёв с соавт., 2009; В.В. Шулаков, 2010).

Поэтому, мы провели оценку количественного состава микрофлоры послеоперационной раны, проведённых у этого контингента больных и с последующим применением разных схем антибактериальной терапии. Группа сравнения получала моксифлоксацин (11 человек), а контрольная группа - амоксициллин/клавунат натрия (9 человек). Оба препарата использовали в инъекционной форме, после получения результатов молекулярно-генетического метода исследования. Продолжительность курса увеличивалась до 10 суток.



Рисунок 8 Количественный состав микробной флоры у пациентов на 3-и сутки после операции по поводу вялотекущих одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний (n=20)

Статистический анализ показал, что среднее количество микробов было достоверно меньшим для всех основных видов, чем при острых одонтогенных воспалительных процессах (P<0,05) .

Вместе с тем, в контрольной группе из области послеоперационной раны выделяли соответствующие виды резидентных и агрессивных видов бактерий в количествах статистически достоверно больших, чем в группе сравнения. Не отличалась только степень обсеменённости стафилококками обоих видов.

Таким образом, применение моксифлоксацина обеспечивало более эффективную эрадикацию резидентных и агрессивных видов в послеоперационной ране.



Рисунок 9 Количественный состав микробной флоры у пациентов на 5-е сутки после операции по поводу вялотекущих одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний (n=20)

Учитывая затяжное течение воспалительного процесса и сохранение экссудации у большинства пациентов группы сравнения, курс лечения был продлён до 10 суток и очередное исследование микрофлоры проводили на 10-ые сутки .



Рисунок 10 Количественный состав микробной флоры у пациентов на 10-е сутки после операции по поводу вялотекущих одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний (n=20)

Таким образом, у пациентов группы сравнения, при использовании моксифлоксацина нормализация микробиоценоза в зоне послеоперационной раны происходила в более ранние сроки, чем у пациентов контрольной группы. Восстановление состава микробиоценоза у пациентов контрольной группы, на наш взгляд, происходило частично, так как сохранялась высокая обсеменённость некоторыми агрессивными видами, выделялись дрожжеподобные грибы, что свидетельствовало о дисбиозе.

Клиническое течение раннего послеоперационного периода отображают данные о частоте проявлений клинических симптомов в разные сроки наблюдения.



Рисунок 11 Динамика клинических симптомов при лечении вялотекущих воспалительных процессов в группе сравнения

Рисунок 12 Динамика клинических симптомов при лечении вялотекущих воспалительных процессов в основной группе

Выводы

1. Микробиологическая диагностика должна основываться на сочетанном примененим культуральных и молекулярных методов, что и позволяет более полно оценить состав и свойства микробной флоры ассоциации раны. При традиционной диагностике с использованием бактериологического метода при одонтогенных воспалительных процессах в 16,6% случаев рост микробной флоры отсутствует, а при использовании молекулярно-генетического метода исследования отсутствие обнаружения ДНК-маркеров вирулентых бактерий было выявлено только в 7% случаев.

2. По данным молекулярно-генетического метода исследования при одонтогенных воспалительных процессах из агрессивных видов наиболее часто обнаруживали представителей вида T. forsythia (73%). Следует отметить, что наиболее часто (в 33%) обнаруживали ассоциации из 3-х агрессивных видов бактерий T. forsythia, P. intermedia и F. nucleatum.

3. На современном этапе одонтогенные воспалительные заболевания характеризуются острым или вялотекущим клиническим течением, отличаются по степени микробной обсемененности гнойного очага и динамике послеоперационного периода. При острых воспалительных заболеваниях преобладают: S.sanguis, Prevotella intermedia. При вялотекущих воспалительных заболеваниях наиболее часто выявляются: Enterococcus spp., Porphyromonas spp.

4. Сочетанное применение бактериологического метода исследования и молекулярно-генетических методов позволяет на ранних этапах проводить диагностику, определять наиболее вирулентных видов бактерий и на основе этих данных выбирать антибактериальную терапию.

5. Применение фторхинолона IV поколения - моксифлоксацина является эффективным методом антибактериальной терапии у больных с острыми и вялотекущими одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области.

Практические рекомендации

1. Для обследования пациентов с острыми и вялотекущими одонтогенными процессами предлагается сочетанное применение культурального и молекулярного методов микробиологической диагностики. Взятие материала на исследование осуществляется непосредственно на этапе хирургического лечения в первые сутки. А)Проводится постановка традиционного бактериологического исследования для определения уровня обсеменнености раны и последующего определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Б)Проводится ПЦР-диагностика с применением набора реактивов Мультиден-5 для определения маркеров ДНК: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Treponema denticola; и набора реактивов MicroIdent Plus для определения маркеров ДНК: Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum/ periodonticum, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum, Eikenella corrodents, Capnocytophaga sp

2. Для лечения пациентов рекомендуется схема применения моксифлоксацина - препарата группы фторхинолонов IV поколения по стандартной для этого препарата схеме 400 мг в/в один раз в сутки в течение 5 дней при острых воспалительных заболеваниях, а при вялотекущих воспалительных заболеваниях 400 мг в/в один раз в сутки в течение 10 дней.

3. Повторное взятие материала из раны на 5-е сутки для бактериологическое исследование с целью контроля обсеменнести раны.

генетический воспалительный лицевой терапия

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Николаева Е.Н., Чувилкин В.И., Башилов Л.И., Ипполитов Е.В. Оценка эффективности применения метода полимеразной цепной реакции и обратной гибридизации ДНК при этиологической оценке одонтогенных флегмон. Стоматолог.- М.- 2011.-№1.-С.28-31.

2. Чувилкин В.И., Царев В.Н., Башилов Л.И., Ходулина Е.И., Никитин И.В. Микробиологические аспекты применения цефалоспоринов для лечения одонтогенной инфекции челюстно-лицевой области. Хирург.-М.-2011.-№9.-С.30-35.

3. Николаева Е.Н., Башилов Л.И., Панин М.Г., Панин А.М., Чувилкин В.И., Царев В.Н. Совершенствование методов диагностики и перспективы лечения одонтогенных флегмон. Dental forum.-М.-2011.-№2.-С.9-12

4. Башилов Л.И., Чувилкин В.И., Николаева Е.Н., Панин М.Г. Диагностика возбудителей одонтогенных флегмон при использовании бактериологического и молекулярно-генетического методов исследования. Стоматология для всех/Intrnational Dental Review.-М.-2011.-№3.-С.10-14

5. Башилов Л.И., Чувилкин В.И., Царев В.Н., Панин А.М., Панин М.Г., Ахмедов Г.Д., Просычева О.Ю., Родивилов Б.И. Клинико-микробиологические параллели при лечении одонтогенных воспалительных процессов. Роль микробной микрофлоры при лечении флегмон. Медицинский вестник МВД.-М.-2011.-№6.-С.24-30

6. Николаева Е.Н., Башилов Л.И., Панин М.Г., Панин А.М., Чувилкин В.И., Царев В.Н. Оценка эффективности использования метода полимеразной цепной реакции и обратной гибридизации при диагностике одонтогенных флегмон. Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции. Дентал-Ревю.- М.-2011.-С. 187-188.

7. Башилов Л.И., Чувилкин В.И., Царев В.Н., Панин А.М., Панин М.Г., Ахмедов Г.Д. Особенности бактериальной диагностики при хирургическом лечении одонтогенных флегмон. Российская стоматология.-М.-2011.-№6.-С.3-7

Размещено на Allbest.ru