Экспрессия человеческого и вирусного интерлейкинов-6 при аденокарциноме предстательной железы

Размещено на http://www.allbest.ru/

14.00.40 - «Урология»

14.00.14 - «Онкология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

ЭКСПРЕССИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО И ВИРУСНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНОВ - 6 ПРИ АДЕНОКАРЦИНОМЕ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Рыбальченко Александр Владимирович

Москва - 2008



Работа выполнена в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию РФ.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ Доктор медицинских наук, профессор

Велиев Евгений Ибадович

Доктор медицинских наук, профессор

Тупицын Николай Николаевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

доктор медицинских наук, Зайцев

профессор Андрей Владимирович

доктор медицинских наук Алексеев

Борис Яковлевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГОУ ВПО «Московская медицинская академия имени И.М.Сеченова»

Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию РФ.

Защита состоится « » _________2008 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.06. при ГОУ ВПО «Московский госдарственный медико-стоматологический университет Росздрава» (127006 Москва, ул.Долгоруковская, 4).

Почтовый адрес: 127473, г.Москва, ул.Делегатская д.20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а).

Автореферат разослан «__» 2008г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор М.М. Умаханова



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

рак предстательный железа вирусный

Актуальность проблемы. Рак предстательной железы (РПЖ) сегодня представляет собой крупную медицинскую и социальную проблему. В России РПЖ ежегодно диагностируется практически у 180 тысяч мужчин и 37 тысяч мужчин ежегодно умирают от этого заболевания. Латентный РПЖ обнаруживается приблизительно у 25% мужчин в возрасте 40 лет [Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2003, Заридзе Д.Г., 1997, Матвеев Б.П., Бухаркин Б.В., Матвеев В.Б, 1999].

В последние годы оптимизация оценки прогноза РПЖ и разработка эффективных схем противоопухолевой терапии связаны с поиском новых методов диагностики, среди которых особо важное место занимают биологические маркеры (сигнальные молекулы), синтезируемые в клетках уротелия и предстательной железы. Иммунологическая верификация этих маркеров в ткани опухолей у онкологических больных позволяют во многих случаях своевременно выявить злокачественную опухоль и оценить степень ее прогрессии, инвазии, вероятности метастазирования и возникновения рецидивов.

В исследованиях последних лет показано участие биологически активных соединений (цитокинов), в частности, интерлейкина-6 (ИЛ-6) в патогенезе РПЖ. Как известно, биологическая активность ИЛ-6 осуществляется после его связывания с высокоаффинным рецепторным комплексом, состоящим из двух мембранных гликопротеидов 80 kDa (непосредственно связывающего ИЛ-6) и 130 kDA (обеспечивающего высокую аффинность связывающего комплекса). Роль ИЛ-6 при опухолях заключается в том, что он способствует пролиферации клеток и оказывает антиапоптотическое действие [Тупицын Н. Н., 1998, Autissier P., De Vos J., Liautard J., Tupitsyn N. et al., 2 1998. Harris KA, Reese DM., 2001, Palmer J., Hertzog P.J., Hammacher A., 2004].

Клетки нормального эпителия предстательной железы рецептора для ИЛ-6 на мембране не имеют и, поэтому, неспособны к ответу на данный цитокин. При доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) клетки стромы продуцируют ИЛ-6, а эпителиальные клетки приобретают рецептор ИЛ-6 на мембране, и, таким образом, становятся подверженными пролиферативному и антиапоптотическому действию цитокина. Таким образом, при ДГПЖ ИЛ-6 оказывает паракринное ростовое влияние на клетки эпителия предстательной железы. На этапе же малигнизации происходит качественное изменение экспрессии эпителиальных клеток - они становятся способными сами продуцировать ИЛ-6. Именно таким образом клетки, на мембране которых имеются рецепторы к ИЛ-6, приобретают независимость от экзогенного ИЛ-6, т.е. на этом этапе уже идет речь об аутокринной регуляции опухолевого роста [Siegsmung M.J. et al., 1994; Тупицын Н. Н., 2000, Palmer J. et al., 2004].

Помимо человеческого, существует и вирусный ИЛ-6, ген которого находится в геноме человеческого герпес вируса 8 типа (HHV-8). Вирусный ИЛ-6 гомологичен человеческому на 25%. В предстательной железе здоровых лиц гены HHV-8 не выявляются. Однако у больных СПИДом в ткани предстательной железы наблюдается персистенция HHV-8, и методом гибридизации in situ было показано, что в отдельных случаях в железистом эпителии предстательной железы наблюдается экспрессия некоторых генов латентной инфекции HHV-8 [Гурцевич В.Э., 2004, Гурцевич В.Э., Кадырова Е.Л., 2004].

Однако данные о наличии генома HHV-8 в опухолевой ткани РПЖ и об особенностях экспрессии вирусного ИЛ-6 при РПЖ отсутствуют. Получение сведений такого рода позволит глубже понять роль HHV-8 в патогенезе РПЖ, идентифицировать опухоли, продуцирующие ИЛ-6, и разработать новые методы их патогенетической терапии.

Цель исследования: изучение наличия генов HHV-8 и экспрессии человеческого и вирусного интерлейкинов-6 в ткани аденокарциномы предстательной железы.

Задачи исследования:

Оценить наличие HHV-8 в образцах ткани РПЖ.

Изучить экспрессию человеческого ИЛ-6 в образцах РПЖ методом ОТ-ПЦР.

Оценить наличие гена К2 и экспрессию вирусного ИЛ-6 в образцах ткани РПЖ.

Охарактеризовать особенности нуклеотидного состава ДНК гена вирусного ИЛ-6 HHV-8, выделенной из ткани РПЖ.

Изучить взаимосвязь экспрессии человеческого ИЛ-6 в образцах ткани РПЖ с его основными клиническими характеристиками.

Научная новизна работы. Впервые установлен факт наличия генома и экспрессии ИЛ-6 в тканях РПЖ.

Впервые обнаружены гены вирусного ИЛ-6 в образцах опухолевой ткани у 12% пациентов и ORF-26 у 6% пациентов, страдающих РПЖ, что может свидетельствовать о патогенетической роли этого вирокина при раке предстательной железы.

Впервые показано, что трансформирующий ген К1 HHV-8 в ткани РПЖ отсутствует даже при наличии других фрагментов генома HHV-8.

Впервые выявлены нуклеотидные замены в ДНК гена вирусного ИЛ-6, присутствующего в ткани РПЖ, которые отражаются на аминокислотном составе вирокина: в одном случае - замена 192Асп > 192Асп, в другом - 3 аминокислотные замены: 16Лей>16Про, 70Фен>70Тир, 90Глу>90Асп. Часть из этих аминокислот находится в сайтах связывания вирокина с рецептором, что может влиять на функцию вирусного ИЛ-6.

Впервые показано, что продукция человеческого ИЛ-6 обнаруживается в опухолевой ткани у 70% пациентов, страдающих РПЖ.

Установлено, что экспрессия человеческого ИЛ-6 ассоциируется с большей агрессивностью распространенностью РПЖ. Так, практически у всех больных в «ИЛ-6 позитивной» группе опухоли крупного размера (Т3 и Т4), наблюдается поражение обеих долей, достоверно большая частота случаев с высокой степенью дисплазии железистого эпителия, преобладание низкодифференцированных аденокарцином и достоверно более высоких уровней ПСА в сыворотке крови.

Практическая значимость работы. Полученные данные, в частности, выявление экспрессии ИЛ-6 в тканях РПЖ, могут служить дополнительным критерием идентификации наиболее агрессивных форм РПЖ, что в свою очередь может быть полезным при выборе адекватных подходов к лечению, основанных на блокаде продукции или биологического действия ИЛ-6.

В случаях выявления фрагментов генома HHV-8 в ткани РПЖ целесообразно изучать вопрос о показаниях к противовирусной терапии. Вирусные белки (вирусный ИЛ-6, продукт гена К2), в случае их экспрессии в ткани РПЖ, могут явиться потенциальной мишенью иммунотерапии.

Личное участие диссертанта в разработке проблемы. Автором было проведено обследование и лечение 85 пациентов различных возрастных групп, в основную группу вошло 17 пациентов с гистологически верифицированным диагнозом - аденокарцинома предстательной железы. В ходе сбора материала для диссертационной работы Рыбальченко А.В. были освоены все необходимые лабораторные и инструментальные методы диагностики, консервативные и оперативные способы лечения аденокарциномы предстательной железы. Выбор методов исследования, планирование и проведение различных исследований, выполнение расчетов, обработка и обсуждение результатов, оформление диссертации и автореферата выполнены автором самостоятельно.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Применение метода ПЦР с ДНК, выделенной из образцов ткани РПЖ, позволило обнаружить комбинации генов HHV-8, среди которых присутствовал ген вирусного ИЛ-6. Показано, что геном вируса неполноценен - отсутствует ген К1, присутствуют гены К2 и ORF-26.

Особенностями нуклеотидного состава гена вирусного ИЛ-6 в сравнении с последовательностями, приводимыми Генбанком, являются, как нуклеотидные замены, не ведущие к изменению аминокислотного состава вирусного ИЛ-6 (36С>36A, 306T>306C), так и замены, ведущие к изменению структуры белка. Последние ведут к изменениям двух типов: а) вне функциональных сайтов цитокина (574G>574A и 209Т>209А, 47Т>47С); б) в составе функциональных сайтов цитокина (270G>270T).

У 70% пациентов, страдающих РПЖ, опухоль продуцирует человеческий ИЛ-6. ИЛ-6 позитивный РПЖ характеризуется большей агрессивностью и распространенностью опухолевого процесса.

Апробация работы. Основные положения настоящей работы обсуждены на заседании кафедры урологии и хирургической андрологии ГОУ ДПО «РМАПО РОСЗДРАВА».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки РФ.

Внедрение результатов работы в практику. Предложенный новый метод определения ИЛ-6-продуцирующего РПЖ внедрен в клиническую практику урологических отделений ГКБ им. С.П. Боткина.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы описания материалов и методов, 3 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 177 источников (15 отечественных и 162 зарубежных). Работа иллюстрирована 20 таблицами, 5 диаграммами и 6 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на кафедре урологии и хирургической андрологии РМАПО совместно с лабораторией иммунологии гемопоэза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в 2004-2007 годах.

Материалом исследования явились образцы биопсийного материала гистологически верифицированного РПЖ, полученные от 17 больных, находившихся на лечении в отделении урологии КБ им. С.П.Боткина.

Верификацию диагноза РПЖ проводили путем сбора анамнеза больных, их физикального обследования, морфологического исследования пункционного биоптата и хирургически удаленной опухоли, определения уровня ПСА в сыворотке крови, проведения УЗИ, ТРУЗИ, КТ, МРТ органов малого таза и сцинтиграфии костей скелета. Морфологическая верификация РПЖ осуществлялась в патологоанатомическом отделении Московского научно-исследовательского института им. П.А. Герцена.

Все пациенты находились в возрасте старше 50 лет. Средний возраст пациентов в исследуемой группе составил - 62,5±3,5 года.

Сроки наблюдения за пациентами варьировали от 6 месяцев до 3 лет.

Размеры опухоли у пациентов в исследуемой группе составляли 1,0 - 7,0 см в диаметре.

У 4 пациентов опухоль находилась в пределах капсулы, у 7 пациентов наблюдалось поражение семенных пузырьков, у 6 пациентов опухоль прорастала за пределы капсулы.

У 10 (59%) пациентов была поражена одна доля предстательной железы, а у 7 (41%) - обе доли.

У 10 (59%) пациентов имела место высокая и умеренная степень дифференцировки клеточных элементов опухоли, а у 7 (41%) пациентов - низкая.

У 13 (76%) пациентов наблюдалась аденокарцинома с инфильтративным ростом, а у 4 (24%) пациентов - ацинарная аденокарцинома.

У 14 (82%) пациентов была 1-2 стадия РПЖ, а у 3 (8%) пациентов - распространенная (см. таблицу № 1).

В эксперименте были использованы стандартные методы выделения ДНК и РНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и обратной транскрипции.

Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ (грант №00-04-55000).

Таблица 1 - Распределение больных в зависимости от стадии РПЖ

Стадия	Количество больных
	Абс.	%
T1cN0M0	1	5,8
T1cNxM0	2	11,6
T2NxM0	1	5,8
T2NxMx	1	5,8
T2aNxM0	2	11,6
T2bNxM0	2	11,6
T2cN0M0	2	11,6
T2cNxM0	3	17,4
T3aN0M0	1	5,8
T3aNxM0	1	5,8
T4NxMx	1	5,8
Всего	17	100,0

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты одновременного изучения экспрессии человеческого и вирусного ИЛ-6 тканью РПЖ суммированы в таблице № 2. В качестве положительного контроля изучалась мРНК -глобина (100% положительный результат).



Таблица 2 - Результаты ПЦР с обратной транскрипцией с РНК, выделенной из образцов аденокарциномы предстательной железы

Пациент	Экспрессия мРНК
	hIL-6	vIL-6	-globin
ВИ	-	-	+
ТБ	+	-	+
МИ	+	-	+
ТК	-	-	+
КО	+	-	+
АМ	+	-	+
МА	-	-	+
ЭЛ	+	-	+
БО	+	-	+
АТ	+	-	+

Как видно в таблице № 2, экспрессия вирусного ИЛ-6 не наблюдалась ни в одном из исследованных случаев. Экспрессия же человеческого ИЛ-6 была обнаружена у 70% пациентов. Полученные данные свидетельствует о том, что ИЛ-6 непосредственно секретируется in situ тканью РПЖ. Следовательно, концентрация ИЛ-6 в ткани опухоли является достаточной для индукции пролиферации или антиапоптотического эффекта в опухолевых клетках.

На рисунке 1 представлены результаты RT-PCR у 10 больных РПЖ, свидетельствующие о том, что даже следовых уровней экспрессии vIL-6 не наблюдается.



А

Б

В

Рисунок 1. Экспрессия мРНК hIL-6 и vIL-6 при РПЖ. Экспрессия hIL-6 - полосы 3, 5 (А), 1, 3, 7 (Б), 1, 3 (В). Отсутствие экспрессии vIL-6 - полосы 2, 4, 6, 8 (А, Б), 2, 4 (В), положительный контроль на экспрессию мРНК vIL-6 в линии клеток ВС-3 - линия 8 (В)



Анализ на наличие последовательностей вируса герпеса человека 8 типа дал положительный ответ у 2-х пациентов (см. таблицу № 3). У пациента МК были обнаружены ген vIL-6 и ген ORF-26. А у пациента ЧН только ген vIL-6.

Таблица 3 - Характеристика результатов ПЦР с ДНК, выделенной из образцов РПЖ

Пациент	Гены HHV-8	+контроль
	vIL-6	ORF26	K1	GAPDH
КВ	-	-	-	+
КС	-	-	-	+
МК	+	+	-	+
ВИ	-	-	-	+
ТБ	-	-	-	+
ВФ	-	-	-	+
МИ	-	-	-	+
ТК	-	-	-	+
ФЯ	-	-	-	+
ЧН	+	-	-	+
БК	-	-	-	+
КО	-	-	-	+
АМ	-	-	-	+
МА	-	-	-	+
ЭЛ	-	-	-	+
БО	-	-	-	+
АТ	-	-	-	+

Учитывая имеющиеся на сегодняшний день экспериментальные знания о том, что продукция ИЛ-6 клетками РПЖ связана с поздними этапами опухолевой прогрессии и агрессивностью течения, мы провели клиническую и морфологическую характеристику указанных групп больных.

Возраст больных в группах с продукцией ИЛ-6 опухолевой тканью и без таковой не различался и составил 63,0 ± 2,5 и 64,7 ± 3,8 лет соответственно (р = 0,73).

В таблице № 4 показано, что у 28,6% пациентов с экспрессией ИЛ-6 тканью РПЖ наблюдались опухоли крупных размеров, соответствующие индексам Т3 и Т4 по TNM. В группе больных с отсутствием продукции ИЛ-6 опухолевой тканью опухолей Т3 и Т4 не наблюдали. Напротив, при отсутствии секреции ИЛ-6 тканью РПЖ у 1 из 3 (33%) пациентов имела место опухоль Т1, чего не наблюдалось ни в одном случае в более многочисленной группе с продукцией ИЛ-6. Что касается индекса Т2, то пациенты этой группы встречались с равной частотой вне зависимости от наличия или отсутствия продукции ИЛ-6 опухолевой тканью (71% и 67% соответственно). В целом эти данные не противоречат представлениям о продукции ИЛ-6 на более поздних стадиях РПЖ, однако, взаимосвязь не носит достоверного характера, необходимо накопление большего числа наблюдений.

Таблица 4 - Распределение больных в соответствии с размером опухоли в зависимости от экспрессии ИЛ-6 опухолевой тканью

Экспрессия ИЛ-6	Индекс Т по TNM
	T1	T2	T3	T4
Отсутствует	1	2	0	0
	33%	67%	0%	0%
Присутствует	0	5	1	1
	0%	71,40%	14,30%	14,30%

В анализируемой группе больных при проведении гистологического исследования не обнаружено метастазов в удаленных лимфоузлах (индекс N0 во всех случаях). Отдаленные метастазы также отсутствовали у всех больных (М0 во всех случаях). Следовательно, проведение сопоставлений по этим признакам в зависимости от продукции ИЛ-6 не представлялось возможным.

У большинства больных (6 из 10) были поражены обе доли предстательной железы. Интересно отметить, что у 3 из 4 пациентов с поражением одной доли предстательной железы продукция ИЛ-6 опухолевой тканью отсутствовала. Иными словами, во всех случаях РПЖ с отсутствием секреции цитокина опухолевой тканью была поражена только одна доля предстательной железы. В случаях с продукцией цитокина опухолью частота поражения только одной доли составила 14%

Во всех случаях, изученных нами на предмет экспрессии человеческого ИЛ-6 опухолевой тканью, имел место инфильтративный рост аденокарциномы. По этим причинам анализ в зависимости от гистологического типа опухоли и наличия или отсутствия инфильтративного компонента не представился возможным.

Степень выраженности дисплазии неинвазивного компонента (PIN - prostatic intraepithelial neoplasia) в 4 случаях была низкой и в 6 - высокой. Сравнение этого показателя с наличием продукции ИЛ- 6 опухолевой тканью выявило интересные ассоциации. Во всех случаях с отсутствием продукции ИЛ-6 опухолевой тканью наблюдалась низкая степень выраженности дисплазии эпителия (ПИН), в то время как у больных с секрецией ИЛ-6 опухолевыми клетками, напротив, в 86% случаев отмечена высокая степень выраженности ПИН. Несмотря на малочисленность выборки, взаимосвязь между признаками (выраженностью ПИН и продукцией ИЛ-6 РПЖ) носит достоверный характер при р = 0,011.

Прорастание капсулы предстательной железы имело место у половины больных, обследованных нами на предмет экспрессии ИЛ- 6 человека опухолевой тканью (5 из 10). В группе больных без экспрессии ИЛ-6 тканью опухоли преобладали случаи (67%) с отсутствием прорастания капсулы, а при наличии продукции цитокина - случаи с прорастанием капсулы. Однако достоверной связи между принаками не обнаружено.

Периневральная инвазия опухоли имела место в половине случаев, изученных на предмет экспрессии ИЛ-6 человека (5 из 10). Связи этого признака с продукцией ИЛ-6 тканью РПЖ не отмечено

Прорастание семенных пузырьков отмечено лишь у 2 из 10 больных. Взаимосвязь этого признака с продукцией ИЛ-6 тканью опухоли также отсутствовала

Весьма интересные данные получены относительно взаимосвязи продукции ИЛ-6 опухолевой тканью и степенью дифференцировки клеток опухоли (баллом по Глисону). В анализируемой группе больных преобладали случаи с 5 и 7 баллами (по 3 наблюдения), 4 балла отмечено у 2 больных, 3 и 6 баллов - по 1 наблюдению. При сравнении среднего балла по Глисону в группах с продукцией ИЛ-6 и с отсутствием таковой отмечено некоторое преобладание среднего балла у ИЛ-6-позитивных больных (5,8 и 4,7 соответственно). Однако различия не достоверны, р = 0,37.

В случаях отсутствия секреции ИЛ-6 преобладали высокодифференцированные опухоли, а при наличии экспрессии цитокина, напротив, умеренно- и низкодифференцированные. Учитывая тот факт, что при наличии 5 групп сравнения, выделяемых на основании балла Глисона, количество больных в каждой группе крайне малочисленно и недостаточно для статистического анализа, мы объединили пациентов с высокодифференцированными опухолями (балл 3 и 4) в одну группу, а пациентов с умеренно- и низкодифференцированными - в другую. В этом случае более отчетливо наблюдалась взаимосвязь продукции ИЛ-6 со снижением степени дифференцировки опухолевых клеток, ассоциация близка к достоверной при р < 0,1.

Однако даже большее значение имеет другой вытекающий из представленных данных феномен - отсутствие экспрессии ИЛ-6 при умереннодифференцированных аденокарциномах предстательной железы.

Так, у больного Т. при гистологическом исследовании удаленной предстательной железы в двух фрагментах левой доли обнаружен инфильтративный рост умереннодифференцированной, преимущественно мелкоацинарной аденокарциномы с прорастанием в фиброзную капсулу, периневральным ростом, врастанием в семенники, 5 баллами по Глисону (3+2).

Следует отметить, что низкодифференцированных аденокарцином у пациентов с отсутствием продукции ИЛ-6 клетками опухоли мы не наблюдали.

Важным диагностическим показателем при РПЖ являются сывороточные уровни простатоспецифического антигена (ПСА). Мы проанализировали уровни маркера в группах с продукцией ИЛ-6 клетками РПЖ и без таковой. Несмотря на малочисленность групп сравнения уровни ПСА при наличии продукции ИЛ-6 опухолью были достоверно выше (в среднем 22,4 ± 5,2 и 6,4 ± 0,9 соответственно, р = 0,05).

Следующим этапом исследования явился анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих вирусный ИЛ-6, выделенных из клеток РПЖ. Как уже указывалось, у 2 из 17 больных (12%) РПЖ в опухолевой ткани обнаружены гены HHV-8. У пациента М. обнаружены 2 из 3 изученных генов (К2 и ORF26), а у пациента Ч. - один ген - К2. Гены К2 кодируют вирусный ИЛ-6.

Мы провели анализ нуклеотидной последовательности генов К2 у обоих пациентов.

В таблице 5 представлены нуклеотидные последовательности генов вирусного ИЛ-6 согласно данным Генбанка (vIL-6) и соответствующие последовательности генов К2 пациентов М. и Ч. Верхняя строка - последовательность гена вирусного ИЛ-6 (vIL-6) по данным Генбанка, М. - последовательность гена К2 (вирусного ИЛ-6) больного М., Ч. - последовательность гена К2 (вирусного ИЛ-6) больного Ч. Нижний ряд - звездочками отмечено совпадение нуклеотидных последовательностей, пробел - нуклеотидные замены. Для удобства восприятия представлена последовательность не кодирующей, а комплементарной цепи ДНК, соответствующая мРНК, если заменить тимин (Т) на урацил (U).

Рассмотрим более подробно нуклеотидные последовательности, выделенные из ткани рака предстательной железы больных.

Как видно из представленных в таблице 6 данных у пациента М., лишь одна нуклеотидная замена в положении 574 вела к аминокислотной замене в положении 192 - замена аспарагина на аспарагиновую кислоту. Замена в положении 574 приводит к замене аспарагина на аспарагиновую кислоту, что, в свою очередь, приводит к замещению незаряженной полярной группы на отрицательно заряженную аминокислоту в данном участке полипептида. При этом данный аминокислотный остаток находится довольно далеко от сайтов взаимодействия vIL-6 с gp130 и IL6R, следовательно, скорее всего, не влияет на функциональную активность вирокина.

Как видно в таблице 7, при анализе последовательности гена вирусного ИЛ-6, выделенного из опухолевой ткани больного Ч., все три нуклеотидные замены вели к изменению аминокислотного состава вирокина. На сегодняшний день достаточно затруднительно судит о том, насколько данные аминокислотные замены могут сказаться на функциональных свойствах вирусного ИЛ-6. Указанные замены являются уникальными и не встречались в других опубликованных исследованиях.

Интересно отметить, замена 90-й аминокислоты Глу>Асп находится в непосредственной близости от сайта N-гликозилирования вирусного ИЛ-6. Как известно, негликозилированная форма вирокина обладает в 3-4 раза меньшей функциональной активностью, чем гликозилированная. Вместе с тем, этот участок цитокина является функциональным сайтом, ответственным за связывание с рецептором ИЛ-6 (gp80). Вполне возможно, что модификации в данном функциональном сайте вирусного ИЛ-6 приводят к изменению сродства вирокина к gp80, что может сказаться на сигналинге через gp130, минуя gp80.



Таблица 5 - Сопоставление нуклеотидной последовательности генов вирусного ИЛ-6 по данным Генбанка с последовательностями, выделенными из ткани РПЖ пациентов М и Ч

Таблица 6 - Анализ нуклеотидных замен в гене ИЛ-6 пациента М.

Нуклеотид	Кодон	Аминокислота
№п/п	Замена	№п/п	Замена	№п/п	Замена
36	С>А	12	GTC>GTA	12	Вал>Вал
306	T>C	102	TTT>TTC	102	Фен>Фен
574	G>A	192	GAC>AAC	192	Асп>Асп

Таблица 7 - Анализ нуклеотидных замен в гене ИЛ-6 пациента Ч.

Нуклеотид	Кодон	Аминокислота
№п/п	Замена	№п/п	Замена	№п/п	Замена
47	Т>С	16	CTG>CCG	16	Лей>Про
209	T>А	70	TTT>TAТ	70	Фен>Тир
270	G>Т	90	GAG>GAT	90	Глу>Асп

Таким образом, в 2 случаях обнаружения гена вирусного ИЛ-6 в ткани рака предстательной железы аминокислотный состав цитокина был практически идентичен таковому вирусного ИЛ-6, приводимому Генбанком. У пациента М. обнаружена лишь 1 аминокислотная замена (вероятнее - особенность штамма). У пациента Ч. имели место 3 замены, судить о функциональной роли которых в настоящее время затруднительно



ВЫВОДЫ

В работе получены новые данные относительно экспрессии интерлейкина 6 человека, его вирусного гомолога и персистенции HHV-8 в ткани рака предстательной железы человека.

На тканевом уровне в образцах опухолевой ткани больных раком предстательной железы показана высокая экспрессия (70% случаев) интерлейкина 6 человека, что свидетельствует о возможности паракринной или аутокринной регуляции опухолевого роста этим цитокином.

При наличии продукции ИЛ-6 опухолевой тканью рак предстательной железы имеет признаки большей агрессивности или распространенности процесса. Это заключается в большей частоте опухолей крупного размера (Т3 и Т4) в ИЛ-6-позитивной группе, поражении обеих долей, достоверно большей частоте случаев с высокой степенью дисплазии железистого эпителия (ПИН), преобладании низкодифференцированных аденокарцином и достоверно более высоких уровнях ПСА в сыворотке крови больных.

Патогенетическая роль вирусного интерлейкина 6 в развитии рака предстательной железы представляется весьма вероятной, так как в 12% случаев в опухолевой ткани присутствовал ген вирусного интерлейкина 6.

Впервые установлена персистенция неполного вирусного генома в ткани рака предстательной железы человека.

Обнаружены следующие комбинации генов К2+ ORF26+ K1- и К2+ ORF26- K1-. Во всех изученных случаях отсутствовал трансформирующий ген HHV-8 - К1.

В ДНК гена вирусного ИЛ-6, присутствующего в ткани рака предстательной железы, имелись нуклеотидные замены (в сравнении с последовательностью, приводимой Генбанком), которые отражались на аминокислотном составе вирокина: в одном случае - замена 192Асп > 192Асп, в другом - 3 аминокислотные замены (16Лей>16Про, 70Фен>70Тир, 90Глу>90Асп). Часть из этих аминокислот находится в сайтах связывания вирокина с рецептором, что может влиять на функцию вирусного ИЛ-6.

Практические рекомендации

1. При неуклонном росте РПЖ в последние годы, представленный в данной работе метод по существу является способом более эффективной диагностики ИЛ-6 продуцирующих опухолей. А именно - продукции ИЛ-6 при аденокарциноме предстательной железы, что в свою очередь определяет степень прогрессии и регуляции опухолевого роста данным цитокином.

2. Результаты проведенного исследования в дальнейшем позволяют дать практические рекомендации по идентификации ИЛ-6 продуцирующих опухолей при аденокарциноме предстательной железы.

3. Полученные данные позволят повысить спектр разрабатываемых методов консервативной терапии данного заболевания, основанных на блокаде рецепторов, обладающих высокой афинностью к ИЛ-6 а также подавлении биологического действия интерлейкинов-6 непосредственно на ткани.



СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. hIL-6 - интерлейкин - 6 человека

2. vIl-6 - вирусный интерлейкин - 6

3. IL6R - a - цепь IL-6-рецепторного комплекса

4. gp130 - в- цепь IL-6-рецепторного комплекса

5. HHV-8 - вирус герпеса человека 8 типа

6. PCR - полимеразная цепная реакция

7. RT-PCR - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Велиев Е.И., Рыбальченко А.В., Широков Д.А., Тупицын Н.Н. Нуклеотидные последовательности HHV-8 в ткани рака предстательной железы: взаимосвязь с экспрессией интерлейкина 6 человека и его вирусного гомолога. //Материалы научно-практической конференции онкологов и врачей общей лечебной сети. // Оренбург - 2006г. - С. 85-91.

2. Велиев Е.И., Рыбальченко А.В., Широков Д.А., Тупицын Н.Н. Роль интерлейкина 6 человека и его вирусного гомолога (HHV-8) в индукции нейроэндокринной дифференцировки рака предстательной железы. //Материалы научно-практической конференции посвященной 60-летию Национального центра онкологии. // Ереван - 2006г. - С. 83-85.

3. Велиев Е.И., Рыбальченко А.В., Широков Д.А., Тупицын Н.Н. Экспрессия интерлейкина-6 человека и его вирусного гомолога в ткани рака предстательной железы. //Журнал «Онкоурология №1».// Москва - 2007 г. - С. 65-68.

Размещено на Allbest.ru