Влияние глутоксима на рост лекарственно-резистентных микобактерий туберкулеза и на активность основных противотуберкулезных препаратов в культуре легочной ткани

Размещено на http://www.allbest.ru/

Научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии ММА

им. И.М.Сеченова

Влияние глутоксима на рост лекарственно-резистентных микобактерий туберкулеза и на активность основных противотуберкулезных препаратов в культуре легочной ткани

А.Д.Куничан, Г.Б.Соколова,

М.В.Синицын, С.Е.Бугаенко, М.И.Перельман

Москва

Проведено изучение влияния Глутоксима на рост лекарственно-резистентных микобактерий туберкулеза (ЛР МБТ) в клеточной и внеклеточной среде в культуре легочной ткани мышей. В этом же аспекте представляло интерес исследование действия Глутоксима на рост ЛР МБТ в присутствии противотуберкулезных препаратов, к которым микобактерии устойчивы (изониазид и рифампицин).

Методы: легочную ткань мышей культивировали модифицированным методом эксплантации в силиконовых перфузионных камерах. Кусочки легочной ткани (эксплантанты) помещали на покровное стекло камеры и фиксировали их к стеклу с помощью плазмы крови кролика. В камеры вводили среду 199. В течение 5-6 дней культивирования вокруг эксплантантов образовывалась обширная зона выселения и роста клеточных элементов, среди которых преобладали макрофаги и фибробласты. По периметру эксплантантов возникал фибропластический вал, который отслаивался, образуя кольцевидную структуру, заполненную разнообразными подвижными клеточными элементами легочной ткани. Здесь также преобладали большие и малые макрофаги.

Лекарственно-резистентные МБТ получали от больных туберкулезом. Устойчивость к изониазиду составляла 1 мкг/мл, к рифампицину - 50 мкг/мл. Взвесь ЛР МБТ в среде 199 получали без количественного дозирования микробных тел. В этом не было необходимости, поскольку во все камеры с культурой ткани, включая контрольные, вводили одинаковый объем взвеси ЛР МБТ. глутоксим микобактерия противотуберкулезный препарат

В первой серии экспериментов изучали влияние одного Глутоксима на рост ЛР МБТ. Глутоксим из ампул с 1 мл 3% раствора препарата разбавляли до окончательной концентрации 1 мкг/мл в среде 199, содержавшей 10% сыворотки крупного рогатого скота и взвесь ЛР МБТ. В контрольном варианте использовали ту же питательную среду с равным содержанием взвеси ЛР МБТ без Глутоксима. В камерах с культурой ткани производили замену среды на содержавшую и не содержавшую Глутоксим и помещали их в термостат при t 37 C⁰.

Во второй серии экспериментов изучали влияние Глутоксима на рост ЛР МБТ в присутствии изониазида или рифампицина. Изониазид разбавляли в среде 199, содержавшей те же компоненты, что и в первой серии, до концентрации 1 мкг/мл, рифампицин - до концентрации 50 мкг/мл, Глутоксим - до концентрации 1 мкг/мл. Было выделено 5 групп камер: 1. Контрольные камеры без препаратов; 2. Камеры, содержавшие один изониазид; 3. Камеры с одним рифампицином; 4. Камеры, содержавшие изониазид+Глутоксим; 5. Камеры, содержавшие рифампицин+Глутоксим.

Наблюдение за ростом микроколоний ЛР МБТ в зоне выселения и роста клеточных элементов (ВНУ) и за ее пределами (ВНЕ) вели в фазовом контрасте с помощью инвертированного микроскопа МБИ-13 (ЛОМО, Россия). Микроколонии ЛР МБТ, представлявшие собой характерные морфологические образования, известные под названием «кос», подсчитывали в 100 полях зрения при увеличении 21040. Одновременно оценивали состояние клеточных элементов: жизнеспособность, подвижность, фагоцитирующую активность, состояние внутренних структур (ядер, гранул, эндо- и эктоплазмы).

Данные о количестве микроколоний ЛР МБТ обрабатывали статистически с помощью компьютерной программы «Статистика».

Результаты: в первой серии экспериментов микроколонии ЛР МБТ появлялись в виде мелких «кос» на 3-4 дни после инокуляции микробной взвеси как в контрольных (без Глутоксима), так и в опытных камерах в большом количестве за пределами зоны выселения и роста клеточных элементов и в незначительном количестве в пределах этой зоны. В последующие 3-5 дней нарастало их количество и размеры. К этому времени производили окончательный подсчет микроколоний ЛР МБТ, поскольку при дальнейшем культивировании они переплетались, что затрудняло выделение и подсчет отдельных микроколоний. Количественные данные о росте микроколоний ЛР МБТ представлены в табл.1.

При использовании одного Глутоксима в концентрации 1 мкг/мл в зоне выселения и роста клеточных элементов число выросших микроколоний ЛР МБТ было значимо меньше, чем за ее пределами, что подтверждается высокой степенью статистической достоверности различий. В контрольных камерах число микроколоний ЛР МБТ в пределах клеточного массива статистически не отличалось от такового за ее пределами.

В контрольных камерах большинство клеточных элементов потеряло признаки жизнеспособности: макрофаги были неподвижны, не образовывали псевдоподий, в их цитоплазме определялись крупные бесформенные включения. Из многих макрофагов имелись выросты «кос» микроколоний МБТ. Фибробласты деформировались, гранулярные структуры в них были комковаты, ядра визуально не определялись.

В камерах с Глутоксимом также наблюдались признаки деградации клеточных элементов, однако они не были столь выраженными. Сохранялась некоторая подвижность макрофагов, цитоплазма их представлялась более структурной. Часть макрофагов образовывала псевдоподии, что свидетельствовало о продолжении процесса фагоцитирования. Часть фибробластов деформировалась, однако часть сохраняла типичную веретенообразную форму с правильным расположением гранул и отчетливо видимым ядром.

Тем самым, Глутоксим, в отсутствии противотуберкулезных препаратов, способствовал более эффективному фагоцитозу МБТ в клеточной среде культуры легочной ткани и уменьшал повреждаемость клеточных элементов, обусловленную инфекцией.

Во второй серии экспериментов введение Глутоксима в сочетании с противотуберкулезными препаратами - изониазидом или рифампицином - привело к значительным изменениям численности лекарственно-резистентной микробной популяции в зоне выселения и роста клеточных элементов по сравнению с таковой за ее пределами. Таким образом, Глутоксим оказывал существенное влияние на рост ЛР МБТ в клеточной среде как в присутствии изониазида, так и рифампицина. Количество микроколоний здесь было в 10 раз меньше при сочетании Глутоксима с изониазидом и в 5 раз меньше при сочетании его с рифампицином по сравнению с таковым во внеклеточной среде.

При сопоставлении этих данных с данными, полученными в первой серии экспериментов, создается впечатление усиления Глутоксимом противотуберкулезной активности рифампицина и, особенно, изониазида. Это может быть связано со значительным ослаблением жизнеспособности ЛР МБТ при активации фагоцитарной способности макрофагов, в результате чего действие противотуберкулезных препаратов становится более выраженным.

Характерным было полное сохранение жизнеспособности клеточных элементов легочной ткани при сочетании Глутоксима с изониазидом или рифампицином. Макрофаги были подвижны, морфологические признаки деградации в них отсутствовали. Фибробласты имели характерную продолговатую форму, овальное ядро с ядрышками, в них отмечалось перинуклеарное расположение гранул.

В контрольных камерах без препаратов, с одним изониазидом или с одним рифампицином клеточные элементы подверглись значительной деградации и не были жизнеспособными. Отмечался пророст «кос» ЛР МБТ из макрофагов. За пределами клеточного массива во всех случаях наблюдался обильный рост микроколоний ЛР МБТ.

Заключение

1. Глутоксим в отсутствие противотуберкулезных препаратов способствует уменьшению роста лекарственно-резистентных микобактерий туберкулеза в клеточной среде культуры легочной ткани по сравнению с их ростом во внеклеточной среде примерно в 1,8 раза.

2. При сочетании с изониазидом Глутоксим в клеточной среде приводит к уменьшению популяции лекарственно-резистентных МБТ примерно в 10 раз, при сочетании с рифампицином - примерно в 5 раз.

3. Во всех случаях Глутоксим не оказывает влияние на рост ЛР МБТ во внеклеточной среде.

4. Глутоксим способствует сохранению жизнеспособности и функциональной активности клеточных элементов культуры легочной ткани, инфицированной лекарственно-резистентными МБТ, особенно при сочетании его с противотуберкулезными препаратами.

Размещено на Allbest.ru