Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ТЕХНОЛОГИЯ СОРБЕНТА НА ОСНОВЕ СФАГНОВОГО МХА

14.04.01 - Технология получения лекарств

Келус Надежда Васильевна

Томск - 2013

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования

В последние десятилетия возрос и имеет дальнейшую тенденцию к увеличению удельный вес заболеваний, связанных с интоксикацией различных систем организма. Основными причинами такой неблагоприятной динамики являются распространение вирусных и бактериальных инфекций, ухудшение экологической обстановки, рост потребления лекарственных средств и алкоголя, изменение структуры питания, которые сопровождаются ухудшением общего состояния организма и характеризуются наличием конкретных патологических процессов.

При тяжелых формах интоксикаций основным методом эфферентного лечения является сорбционная терапия, позволяющая за короткое время снизить концентрацию токсичных веществ в крови, лимфе, энтеральной среде и других биожидкостях. Одним из перспективных методов сорбционной детоксикации является гастроинтестинальная сорбция или энтеросорбция, преимуществами которой является физиологичность, техническая простота проведения и высокий клиренс токсических метаболитов.

Принимая во внимание преимущества энтеросорбции, для успешного выполнения фармакотерапевтических задач необходимо располагать широким ассортиментом средств, которые обладают выраженной адсорбирующей способностью по отношению к веществам разнообразной природы. Поэтому востребованными являются исследования, направленные на создание новых высокоэффективных препаратов этой группы.

Особого внимания заслуживают энтеросорбенты растительного происхождения, характеризуемые доступностью сырья, низким уровнем побочных реакцией и выраженным сорбционным потенциалом. В этом плане представляют интерес сфагновые мхи, широко распространенные в Западной Сибири.

На основании вышеизложенного разработка технологии нового энтерососорбента на основе сфагновых мхов является актуальной научно-практической задачей.

Степень разработанности темы

Сфагновые мхи известны в народной медицине с 11 века в качестве эффективного перевязочного материала. Данные научной литературы о биологической активности извлечений из сфагнумов указывают на их многостороннее, комплексное действие на организм, включающее антимикробный, бактерицидный, противовирусный, ранозаживляющий, кровоостанавливающий, влагопоглощающий, дезодорирующий и адсорбирующий эффекты. Последнее свойство определяет перспективы использования сфагнумов в фармации в качестве сорбента с широким спектром его функциональной активности. Уровень разработки данного направления требует проведения специальных изысканий и конкретизации в рамках исследований по созданию лекарственного средства.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования является научное обоснование, разработка состава и технологии лекарственного средства с адсорбционной активностью из дерновины сфагновых мхов.

Для достижения поставленной цели в рамках диссертационной работы предполагалось решить следующие задачи:

1. Провести исследования адсорбционной активности сфагновых мхов и определить наиболее перспективный вид.

2. Изучить физико-химические и технологические свойства порошка дерновины перспективного вида.

3. Исследовать механизм сорбции дерновины сфагнума.

4. Оценить детоксикационные свойства исследуемого порошка дерновины сфагнума в опытах in vivo.

5. Подобрать оптимальную комбинацию вспомогательных веществ и разработать технологию рациональной лекарственной формы на основе оптимизированного состава.

6. Определить параметры качества на порошок дерновины сфагнума и лекарственное средство. Составить проекты нормативной документации.

Научная новизна

Впервые проведено целенаправленное изучение адсорбционной активности дерновины 24 видов сфагновых мхов по трем маркерам, экспериментально установлена зависимость адсорбционной активности сфагновых мхов от дисперсности.

Впервые обоснован механизм сорбционного действия порошка дерновины сфагнума бурого и исследованы его физико-химические и технологические свойства.

Впервые изучены детоксикационные свойства порошка дерновины сфагнума бурого на моделях острого и хронического эндотоксикозов.

Впервые экспериментально обоснован состав и исследованы физико-химические, технологические свойства таблеток из порошка дерновины сфагнума бурого, теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность внедрения в медицинскую практику таблетированной формы порошка дерновины сфагнума бурого.

Научный приоритет исследований подтвержден патентом на изобретение РФ: № 2391998 от 20.06.2010 «Энтеросорбент растительного происхождения и способ его получения».

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость исследований обоснована тем, что установлены механизмы сорбционного действия порошка дерновины сфагнума бурого и их связь с физико-химическими и технологическими характеристиками сырья. Впервые изучены детоксикационные свойства порошка дерновины сфагнума бурого на моделях острого и хронического эндотоксикозов.

Практическая значимость работы определяется тем, что на основании комплексных исследований разработано оригинальное средство растительного происхождения, обладающее адсорбционной активностью. Разработан состав, предложены и апробированы технология и методики стандартизации порошка дерновины сфагнума бурого и его таблетированной лекарственной формы. Подготовлены проекты ФС «Порошок дерновины сфагнума бурого», ФС «Сфагновый мох. Таблетки 650 мг» и лабораторный регламент на их производство. Лабораторный регламент на производство «Сфагновый мох. Таблетки 650 мг» апробирован в отделении разработки и экспериментального производства препаратов Филиала Федерального государственного унитарного предприятия «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России, г. Томск «НПО «Вирион» (акт об использовании результатов от 20.04.2012). Результаты исследования могут быть использованы для формирования регистрационного досье на новое лекарственное средство.

Разработано учебное пособие «Характеристика сфагновых мхов флоры Томской области» для студентов фармацевтических и биологических факультетов. Результаты исследований используются в научно-исследовательской работе и в учебном процессе на кафедрах фармацевтической технологии и фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Сибирского государственного медицинского университета (акты о внедрении от 02.10.2008 и от 02.02.2012); кафедре ботаники Томского государственного педагогического университета (акт о внедрении от 16.10.2008), кафедре биологии с экологией и курсом фармакогнозии Красноярского государственного медицинского университета (акт о внедрении от 14.11.2008), кафедре фармакогнозии и ботаники Кемеровской государственной медицинской академии (акт о внедрении от 21.11.2008), кафедре фармакогнозии и ботаники Новосибирского государственного медицинского университета (акт о внедрении от 08.09.2011).

Методология и методы исследований

Методологической базой исследования являются теоретические положения фармацевтической технологии и биофармации, трактовка и использование которых легло в основу методических подходов по созданию оригинального лекарственного средства, проектов фармакопейных статей и технологической документации.

При выполнении работы использованы анатомо-морфологические, физико-химические, технологические, математические, микробиологические, фармакологические, биохимические и гистологические методы исследований.

План и дизайн эксперимента строился исходя из алгоритма и порядка доклинического изучения лекарственных средств и комплексной оценки предлагаемых технологических решений и продуктов. Область исследования включала направления, соответствующие пунктам 3,4,6 паспорта специальности 14.04.01 - технология получения лекарств.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты сравнительной оценки адсорбционной активности сфагновых мхов и выбор перспективного вида.

2. Результаты исследований физико-химических и технологических свойств порошка дерновины перспективного сфагнума.

3. Обоснование механизма сорбции дерновины сфагнумов.

4. Результаты исследования детоксикационных свойств порошка дерновины сфагнума бурого в опытах in vivo.

5. Теоретическое и экспериментальное обоснование состава, технологии и параметров качества таблеток порошка дерновины сфагнума бурого.

Степень достоверности и апробация результатов

Все экспериментальные данные исследований обработаны с применением пакета статистических программ Statistica 6.0 для Windows. Статистическую значимость различий в сравниваемых группах определяли по непараметрическому U-критерию Манна-Уитни. Различия между группами полагали статистическими значимыми на уровне статистической значимости р<0,05. Средние величины представлены в виде (М±m), где М - среднее арифметическое, а m - стандартная ошибка среднего значения.

Материалы настоящего исследования докладывались и обсуждались на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2005 г.), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.Н. Березнеговской (г. Томск, 2006 г.), Международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (г. Шымкент, Казахстан, 2009 г.), Межрегиональной научной конференции с международным участием, посвященной 70-летию фармацевтического факультета «Актуальные вопросы развития фармацевтической науки и образования» (г. Томск, 2011 г.).

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ: из них 4 в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК», 1 учебное пособие, 1 патент РФ на изобретение.

2. Основное содержание работы

Введение

Проанализированы и обобщены известные литературные данные, обосновывающие актуальность, целесообразность и медицинскую значимость разработки энтеросорбента на основе лекарственного растительного сырья.

Глава 1 Обзор литературы

Изложены современные подходы к фармакотерапии эндотоксикоза, его клинические признаки. Рассмотрены механизмы и особенности действия энтеросорбентов, а так же возможности их применения в терапии различных заболеваний.

Приведено описание сфагновых мхов, распространенных на территории Западно-Сибирской равнины. Изложены особенности химического состава сфагнов и их применение в медицине.

Охарактеризованы основные вспомогательные вещества, используемые в технологии твердых лекарственных форм, их влияние на биофармацевтические параметры энтеросорбентов.

Глава 2 Материалы и методы исследования

Объектами исследования являлась дерновина 24 видов сфагновых мхов: S. girgensohnii Russ, S. capillifolium (Ehrh.) Hedw, S. fimbriatum Wils. in Wils.et Hook.f., S. fuscum (Schimp.) Klinggr, S.russowii Warnst., S. rubellum Wils., S. aongstroemii C. Hartm., S. centrale C.Jens. ex H.Arnell et C.Jens, S. magellanicum Brid, S. palustre L., S. papillosum Lindb, S. squarrosum Crome., S. angustifolium (Russ. ex Russ.) C.Jens., S. balticum (Russ.) Russ. ex C.Jens, S. cuspidatum Ehrh ex Hoffm., S. lindbergii Schimp. ex Lindb, S. lenense H.Lindb. ex Savicz., S. majus (Russ.) C.Jens, S. flexuosum Dozy et Molk., S. fallax (Klinggr.) Klinggr., S. obtusum Warnst., S. riparium Aongstr., S. jensenii H. Lindb., S. wulfianum Girg.

В экспериментальных исследованиях использовались энтеросорбенты: уголь активированный ОУ-А (ГОСТ 4453-74, «Уголь активный осветляющий древесный порошкообразный»), Полисорб МП по ФС 42-3731-99.

При проведении исследований по разработке технологии таблеток использовали разрешенные к применению вспомогательные вещества, соответствующие требованиям нормативной документации (ГФ ХI и ХII, фармакопейных статей, ГОСТ, ОСТ, ТУ).

Для выявления механизмов сорбции дерновины сфагнума бурого исследовали: анатомо-морфологическое строение с помощью сканирующего электронного микроскопа Quanta 200 3D (EDAX, Нидерланды), площадь удельной поверхности по методике одноточечного БЭТ на приборе Chemisorb 2750 («Micromeritics», США), ИК-спектры в режиме пропускания на Фурье-спектрометре инфракрасном Avatar 360 ESP, элементный состав методом нейтронно-активационного анализа.

У порошка дерновины сфагнума бурого общепринятыми фармакопейными методиками ГФ XII определяли дисперсность, влажность, общую золу, тяжелые металлы и микробиологическую чистоту. Форму и размер частиц определяли с помощью инвертированного микроскопа «Биомед ЗИ» («Биомед», Россия).

Параметры качества таблетируемых смесей и таблеток оценивали по внешнему виду, отклонению от средней массы, гранулометрическому (фракционному) составу, сыпучести (прибор «ERWEKA GT-L»), влажности (влагомер весовой «AND MS-70», Япония), насыпной плотности (прибор «ERWEKA SVM-101»), распадаемости (прибор «ERWEKA ZT 222»), прочности на истирание (прибор «ERWEKA TAR 120»), прочности на раздавливание (тестер «ERWEKA ТВН 125»), пористости (вакуумный насос «Vacuubrand MZ 2CNT»).

Адсорбционную активность растительного сырья, порошка дерновины сфагнума бурого и препаратов сравнения in vitro оценивали по отношению к метиленовому синему (МС), метиловому оранжевому (МО) и белкам (желатину, бычьему сывороточному альбумину (БСА), человеческому сывороточному альбумину (ЧСА)) спектрофотометрическим способом (В.И. Решетников, 2003), сорбционную способность никеля (II) исследовали на атомно-эмиссионном спектрометре с микроволновой плазмой Agilent 4100 (Agilent Technologies, США).

Детоксикационные свойства исследуемого порошка дерновины сфагнума бурого и энтеросорбентов изучали на моделях острого эндотоксикоза (ОЭТ) и хронического эндотоксикозов (ХЭТ) (В.В. Новочадов, 2005). Эксперименты проводили в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», 2005.

ОЭТ индуцировали внутрижелудочным введением тетрахлорметана (ТХМ) в масляном растворе (1:1) в дозе 1 мл/кг ежедневно в течение 6-ти дней, на 7-ой день липополисахарид S. thyphi (ЛПС) внутрибрюшинно. Животным ХЭТ вводили внутрижелудочно ТХМ в масляном растворе (1:1) 1 мл/кг веса животного в течение 20 дней через день_, на 6, 13, 20 день - ЛПС в дозе 20 мг/кг внутрибрюшинно. Контрольные животные получали эквиобъемное количество растворителей.

Животным 3?5 групп вводили внутрижелудочно ТХМ в масляном растворе (1:1) в дозе 1 мл/кг ежедневно в течение 6-ти дней, с третьего дня ежедневно в дозе 500 мг/кг порошок угля активированного, 500 мг/кг порошок дерновины сфагнума бурого (ПДСБ), 450 мг/кг - Полисорб МП в водных растворах в течение 4-х дней. На 7-ой ЛПС внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг.

Крысам 8?10 групп вводили внутрижелудочно ТХМ в масляном растворе (1:1) в дозе 1 мл/кг через день в течение 20-ти дней, с третьего дня ежедневно в дозе 500 мг/кг порошок угля активированного, 500 мг/кг ПДСБ, 450 мг/кг - Полисорб МП в водных растворах ежедневно в течение 21 дня. На 7, 14, 21-ый день ЛПС внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг.

Степень развития интоксикации оценивали по активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), определяемых кинетическим методом с помощью наборов фирмы “ChronolabAG” (Швейцария), содержанию мочевины, общего белка, измеряемого биуретовым методом с использованием набора "Ольвекс диагностикум" (г. Санкт-Петербург) и уровню малонового диальдегида (МДА) по методу К. Jagi.

Печень, почки, легкие и сердце животных подлежали гистологическому исследованию. Микропрепараты просматривали в проходящем свете на микроскопе Axioskop 40 (Karl Zeiss, Germany). Для количественной оценки изменений вычисляли объемные доли основных (ОД) гистологических компонентов исследуемых органов.

Глава 3 Адсорбционная активность сфагновых мхов

На первом этапе работы исследована адсорбционная активность сфагновых мхов в зависимости от дисперсности дерновины. Объектами испытаний являлась высушенная дерновина широко распространенных сфагновых мхов: бурого и обманчивого (S. fuscum и S. fallax). В качестве маркера, позволяющего определять эффективность действия сорбентов в отношении среднемолекулярных токсинов, использовали краситель метиленовый синий. Полученные результаты представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 - Адсорбционная активность дерновины сфагновых мхов (сфагнума бурого и сфагнума обманчивого) по метиленовому синему в мг/г в зависимости от ее дисперсности (мм)

Результаты испытаний свидетельствуют, что с увеличением дисперсности сырья до 0,1 мм способность дерновины поглощать метиленовый синий увеличивается. Дальнейшее уменьшение размеров частиц дерновины не приводило к росту ее адсорбционной активности. Это может быть связано с разрушением структур растительной ткани, ответственных за обеспечение основных механизмов сорбционного эффекта.

Оценка адсорбционной активности дерновины 24 видов сфагновых мхов в отношении МС, МО и желатина проводилась на образцах сырья, дисперсность которых составляла 0,1 ? 0,125 мм. В качестве препаратов сравнения использовали уголь активированный и Полисорб МП с аналогичными размерами частиц.

Средние значения адсорбционной активности 15-ти видов дерновины сфагновых мхов по МС статистически значимо отличались от соответствующего показателя угля активированного (табл. 1). Из них у 9-ти видов мхов S. girgensohnii, S. majus, S. flexuosum, S. obtusum, S. lenense, S. centrale, S. cuspidatum, S. fuscum, S. palustre адсорбционная активность дерновины выше, и для 6-ти видов мхов ниже - S. jensenii, S. fallax, S. balticum, S. aongstroemii, S. papillosum, S. squarrosum, чем у угля активированного (р0,05). Способность связывать МС у Полисорба МП оказалась в 3 раза ниже адсорбционной активности угля активированного (р0,05).

Таблица 1 - Адсорбционная активность дерновины сфагновых мхов, мг/г (М ± m, n=6)

Исследуемый образец	Адсорбционная активность по маркерам
Секция	Вид	метиленовый синий	Метиловый оранжевый	желатин
Acutifolia	S. girgensohnii	458,4±8,3 *,**	16,3±4,6 *	162,1±2,6 *,**
	S. capillifolium	292,9±1,5 **	16,3±2,3 *	160,3±3,2 *,**
	S. fimbriatum	291,2±5,1 **	14,5±2,5 *	176,4±3,6 *,**
	S. fuscum	352,6±3,1 *,**	11,6±3,2 *	160,5±5,3 *,**
	S. russowii	292,6±1,0 **	12,3±3,6 *	153,2±4,5 *,**
	S. rubellum	273,3±9,9 **	14,3±4,8 *	156,2±3,5 *,**
Cuspidata	S. angustifolium	261,0±10,0 **	16,7±,2,6 *	159,6±2,3 *,**
	S. balticum	255,7±2,6 *,**	13,6±2,5 *	164,3±3,6 *,**
	S. cuspidatum	404,7±1,3 *,**	15,3±4,6 *	168,9±2,6 *,**
	S. lindbergii	279,9±11,4 **	14,3±5,4 *	163,5±2,3 *,**
	S. lenense	387,6±1,2 *,**	15,6±2,6 *	186,5±1,5 *,**
	S. majus	351,0±75,1 *,**	13,6±2,3 *	196,3±1,3 *,**
	S. jensenii	180,4±0,3 *,**	12,4±2,8 *	162,2±4,3 *,**
	S. flexuosum	367,3±0,3 *,**	15,6±5,9 *	168,9±1,2 *,**
	S. fallax	255,8±9,8 *,**	14,5±4,6 *	163,2±2,5 *,**
	S. obtusum	376,0±11,3 *,**	13,2±2,5 *	163,5±2,6 *,**
	S. riparium	272,8±12,6 **	15,3±3,7 *	176,3±2,4 *,**
Insulosa	S. aongstroemii	282,1±0,4 *,**	14,3±4,7 *	176,3±3,2 *,**
Sphagnum	S. centrale	414,9±27,7 *,**	15,6±2,3 *	183,6±5,6 *,**
	S. magellanicum	244,4±32,4 **	11,2±2,5 *	156,4±2,6 *,**
	S. palustre	320,3±1,2 *,**	12,4±3,4 *	153,6±2,7 *,**
	S. papillosum	243,5±5,9 *,**	11,4±1,3 *	163,1±2,3 *,**
Squarrosa	S. squarrosum	268,1±21,8 *,**	11,6±2,3 *	162,5±3,6 *,**
Polychida	S. wulfianum	295,8±3,8 **	12,3±3,6 *	154,3±3,5 *,**
Уголь активированный	295,5±1,7	170,3±5,3	46,3, ±3,2
Полисорб МП	88,9±2,6 *	17,9±2,2 *	300,2±2,0 *

Примечание: ^* - р0,05 по сравнению с углем активированным,

^** - р0,05 по сравнению с полисорбом МП

Анализ результатов испытаний адсорбционной активности дерновины по МО показал отсутствие выраженного сорбционного эффекта у исследуемых видов сфагновых мхов и Полисорба МП. Адсорбционная активность по желатину у дерновины сфагновых мхов оказалась в 2 раза, а у угля активированного в 6 раз ниже, чем у Полисорба МП (р0,05).

Наибольшие значения адсорбционной активности дерновины мхов по метиленовому синему установлены для видов таких секций как: Acutifolia (S. girgensohnii), Cuspidata (S. cuspidatum) и Sphagnum (S. centrale). S. cuspidatum является редким для Западной Сибири европейским болотным видом, S. girgensohnii и S. centrale встречаются чаще, но обычно не образуют больших зарослей.

Исследования, проведенные на кафедре фармакогнозии с курсами ботаники и экологии СибГМУ, показали, что эксплуатационный запас семи видов сфагновых мхов (S. fuscum, S. balticum, S. papillosum, S. lindbergii, S. fallax, S. angustifolium, S. magellanicum) на территории Томской области составляет 87,5 млн. тонн. Показатели биологического и эксплуатационного запасов сырья у сфагнума бурого и объемы ежегодной заготовки сырья превышают показатели остальных исследуемых видов в 10 раз. Исходя из выше изложенного, для дальнейших углубленных исследований был выбран S. fuscum (сфагнум бурый).

Глава 4 Технология получения порошка дерновины сфагнума бурого

Изучение физико-химических и технологических свойств порошкообразных веществ проводилось с целью прогнозирования технологии и состава таблеток, а также их качества. Дерновина сфагнума, как и большинство порошков из растительного сырья, обладает неприемлемыми для прямого прессования параметрами, что определяет необходимость использования вспомогательных веществ и предварительного гранулирования.

Дальнейшие исследования включали подбор способа измельчения растительного сырья, обеспечивающий высокие адсорбционные свойства порошка, с одной стороны, с другой - приемлемые для получения лекарственной формы технологические характеристики. С этой целью изучали порошки дерновины сфагнума бурого, полученные разными типами измельчающих машин (шаровая и планетарная мельницы). Результаты испытаний физико-химических и технологических свойств соответствующих образцов представлены в таблице 2 и свидетельствуют, что более приемлемые технологические характеристики обеспечивает планетарная мельница.

Таблица 2 - Физико-химические и технологические свойства порошков дерновины сфагнума бурого, полученных разными типами измельчающих машин

Показатели	Объекты исследований
	Порошок S. fuscum шаровая мельница	Порошок S. Fuscum планетарная мельница
Сыпучесть, г/с	0,55± 0,2	0, 85± 0,2
Форма частиц (0,1 мм)	Анизодиаметрическая форма (палочки)	Анизодиаметрическая форма (палочки)
Фракционный состав	Полидисперсная система, с большим количеством пылевидной фракции	Полидисперсная система, с большим количеством пылевидной фракции
Насыпная масса при свободной засыпке, г/см3	0,08± 0,1	0,12 ± 0,1
Насыпная масса при максимальном уплотнении, г/см3	0,15± 0,1	0,23± 0,1
Пористость, %	72± 0,1	76± 0,1
Смачиваемость, L	Исследуемый порошок является гидрофильным (L = 00)	Исследуемый порошок является гидрофильным (L = 00)
Остаточная влажность, %	8,0± 0,1	8,0± 0,1

Оценка адсорбционных свойств порошков дерновины в отношении различных маркеров показала, что наиболее выраженная сорбционная активность характерна для дерновины сфагнума бурого, полученного с помощью планетарной мельницы (табл. 3).

Таблица 3 - Адсорбционная активность порошков дерновины сфагнума бурого и препаратов энтеросорбентов, мг/г (M ± m)

Адсорбционная активность, мг/г	Объекты исследования
	ПДСБ (шаровая мельница)	ПДСБ (планетарная мельница)	Уголь активированный	Полисорб МП
Метиленовый синий	349,6 ± 5,51,2	354,6 ± 5,21,2	323,4 ± 0,82	82,1 ± 8,91
Метиловый оранжевый	11,3 ± 2,31,2	6,9 ± 1,61,2	137,2 ± 4,32	17,9 ± 2,21
Желатин	154,1 ± 2,81,2	211,3 ± 7,71,2	41,1 ± 4,12	305,8 ± 2,61
БСА	208± 1,41,2	210± 2,81,2	203± 3,82	382± 1,41
ЧСА	186± 2,61,2	195± 3,51,2	201± 2,22	312± 3,61

Примечание: ¹ р?0,05 по сравнению с углем активированным,

² р?0,05 по сравнению с Полисорбом МП

Таким образом, в процессе переработки сырья целесообразнее использовать порошок из дерновины сфагнума бурого, полученный с помощью планетарной мельницы.

Глава 5 Механизмы сорбции дерновины сфагнумов

Сфагновые мхи имеют множество мелких листьев, расположенных на стеблях и веточках растения, не менее 2/3 объёма листьев приходится на мёртвые, полые гиалиновые клетки, имеющие поры и волокна.

Для определения размеров клеток и пор проведено сравнительное анатомическое исследование веточных и стеблевых листьев сфагнумов бурого и гиргензона, дерновина которых проявила высокую адсорбционную активность по метиленовому синему (табл. 1). Размеры листьев, клеток и пор представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Размеры пор, клеток и клеточной стенки листьев сфагнума бурого и сфагнума гиргензона, (M ± m)

Объект исследований	сфагнум бурый	сфагнум гиргензона
	длина, мкм	ширина, мкм	длина, мкм	ширина, мкм
поры	13,7 ± 0,2	7,7 ± 0,4	10,2 ± 0,4	7,0 ± 0,6
клетки стеблевых листьев	58,1 ± 3,6	11,7 ± 1,0	64,5 ± 8,5	16,0 ± 1,3
клетки веточных листьев	124,2 ± 4,6	12,9 ± 1,0	50,5 ± 2,8	10,5± 1,4
клетки гиалодермиса	37,6 ± 3,3	23,51 ± 0,8	79,3 ± 7,0	31,2 ±2,9

Результаты измерений пор свидетельствуют, что сорбционное пространство листьев сфагнума бурого представлено макропорами и мезопорами, поры сфагнума гиргензона характеризуются несколько меньшими размерами (рис. 2 и 3).

А Б

Рисунок 2- Клетки и поры веточных (А) и стеблевых (Б) листьев сфагнума бурого (Ч250 (А), Ч250 (Б)), электронный микроскоп Quanta 200 3D

А Б

Рисунок 3 - Клетки и поры веточных (А) и стеблевых (Б) листьев сфагнума гиргензона (Ч250 (А), Ч250 (Б)), электронный микроскоп Quanta 200 3D

При анализе зависимости сигнала термокаталитического детектора (TCD-сигнала) от времени сигнала образца порошка дерновины сфагнума бурого и характеризующих пики сорбции, было отмечено несколько особенностей. На спектре образца наблюдались пики, направленные вниз, которые являются пиками адсорбции, пики, направленные вверх, представляют собой пики десорбции. При этом площадь первых превышала соответствующий показатель вторых (обычно наоборот), что связано с особенностью образца (рис. 4).

Еще более интересной особенностью является раздвоенный пик десорбции, что можно интерпретировать как наличие двух адсорбционных центров, сильно отличающихся по энергии связи с азотом. Можно предположить, что один пик связан с десорбцией азота с поверхности образца, а второй - с десорбцией из пор образца, в которых он удерживается более прочно.

Рисунок 4 - Зависимость сигнала термокаталитического детектора (TCD-сигнала) от времени сигнала порошка дерновины сфагнума бурого, Chemisorb 2750 «Micromeritics»

Адсорбционную активность сфагновых мхов можно связать с наличием в их структуре активных «группировок», способных связывать соответствующие компоненты биологических жидкостей.

Сорбционную способность с возможным участием механизмов ионообмена и комплексообразования исследовали в отношении тяжелого металла - никеля (II). Кривая сорбции никеля (II) показывает, что способность ПДСБ связывать металл увеличивается с ростом его молярной концентрации элемента в растворе (рис. 5). При этом наблюдали изменение pH исследуемых растворов (табл. 5). Из таблицы видно, что разница значений водородного показателя исходного раствора и фильтрата после сорбции возрастает при увеличении исходного содержания никеля (II) до 0,1 моль/л. Это дает основание предположить процессы замещения металлом протонов Н⁺ по карбоксильной группе, что и сопровождается изменением pH.

Рисунок 5 - Сорбционная способность ПДСБ относительно ионов Ni²⁺

Таблица 5- Зависимость pH исследуемых растворов от молярной концентрации

Концентрация исходного раствора, моль/л	0,00001	0,00002	0,0001	0,005	0,02	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
рН раствора РСО	6,7	6,4	6,4	7,0	6,9	6,9	6,4	5,8	5,6	5,3	5,1
рН фильтрата	4,5	4,4	3,6	3,5	3,4	3,5	3,7	4,4	4,6	4,1	4,11
? рН	2,2	2	2,8	3,5	3,5	3,4	2,7	1,4	1	1,2	0,99

О наличии структурных изменений в функциональных группировках ПДСБ при связывании никеля (II) свидетельствуют данные, полученные методом ИК-спектроскопии.

Анализ ИК-спектров образца ПДСБ выявил важные группы химических связей (карбоксильные и гидроксильные группы), содержание которых играет важную роль в проявлении функциональной активности сорбентов (рис. 6).

Рисунок 6 - ИК- спектр ПДСБ до сорбции Ni²⁺ (1), ИК- спектр ПДСБ после сорбции Ni²⁺ (2,3)

Для солей карбоновых кислот характерно наличие полос поглощения в области 1610 см^-1 и 1400-1300 см^-1, которые мы наблюдаем на образце ПДСБ. Широкая полоса поглощения в диапазоне 1550-1280 см^-1 наиболее вероятно связана с сорбцией ионов.

Уменьшение интенсивности полосы поглощения при 1722 см^-1 на ИК-спектрах ПДСБ после сорбции никеля (II) можно объяснить взаимодействием ионов Ni²⁺ с кислородом карбонильной группы по донорно-акцепторному механизму, приводящее к снижению интенсивности валентных колебаний С=О группы, обуславливающих данную полосу.

Изменения ИК-спектра ПДСБ в областях 1550-1280 см^-1, 1722 см^-1 и 500-400 см^-1 после сорбции подтверждает участие функциональных группировок обозначенных типов в процессах связывания исследуемого маркера.

Таким образом, нами было показано, что механизм сорбции ПДСБ ионов никеля (II) заключается как в ионом обмене протонов карбоксильных групп на ионы Ni², так и комплексообразовании по карбонильному атому кислорода.

Глава 6 Детоксикационные свойства порошка дерновины сфагнума бурого

В экспериментах по оценке детоксикационных свойств исследуемых объектов установлено, что порошок дерновины сфагнума бурого эффективнее Полисорба МП и угля активированного снижал концентрацию АлАТ и АсАТ в сыворотке крови у животных с ОЭТ и ХЭТ (табл. 6 и 7).

Таблица 6 - Влияние сорбентов на активность ферментов сыворотки крови при ОЭТ, (М ± m)

Показатели	Контрольная группа	ТХМ + ЛПС	ТХМ + ЛПС+УА	ТХМ + ЛПС + ПДСБ	ТХМ + ЛПС Полисорб МП
АлАТ, U/L	45,7±3,5	141,5±1,52	112,9±10,71	86,8±7,41	89,9±2,51
АсАТ, U/L	61,8±1,4	166,8±11,82	113,3±6,61	98,5±7,41	92,7±3,01
Мочевина, ммоль/л	9,7±1,1	5,5±0,82	7,6±0,61	8,3±0,81	8,0±0,71
Белок, г/л	83,5±3,8	62,04±5,42	77,16±2,21	80,63±4,651	75,19±2,91
МДА, мкмоль/л	1,61±0,12	3,37±0,152	2,18±0,131	2,03±0,221	1,94±0,261

Примечание ¹ - р<0,01 по сравнению с эндотоксикозом, вызванным ТХМ + ЛПС

² - р<0,01 по сравнению контрольной группы с эндотоксикозом, вызванным ТХМ + ЛПС

Таблица 7 - Влияние сорбентов на активность ферментов сыворотки крови при ХЭТ, (М ± m, средние из 8 наблюдений)

Показатели	Контрольная группа	ТХМ + ЛПС	ТХМ + ЛПС+УА	ТХМ + ЛПС + ПДСБ	ТХМ + ЛПС Полисорб МП
АлАТ, U/L	48,04±0,4	102,7±3,32	90,6±1,81	73,8±5,31	83,0±7,61
АсАТ, U/L	65,6±0,8	111,4±3,72	94,1±3,01	89,2±4,51	87,9±4,21
Мочевина, ммоль/л	9,0±0,4	6,4±0,62	7,9±0,31	7,5±0,11	7,2±0,11
Белок, г/л	93,8±2,9	69,0±6,02	90,6±7,91	86,7±3,11	82,9±2,31
МДА, мкмоль/л	1,5±0,1	3,7±0,62	2,2±0,31	2,6±0,41	2,1±0,31

Примечание ¹ - р<0,05 по сравнению с эндотоксикозом, вызванным ТХМ + ЛПС

² - р<0,05 по сравнению контрольной группы с эндотоксикозом, вызванным ТХМ + ЛПС

Энтеросорбенты препятствовали развитию гипопротеинемии, уменьшение концентрации МДА и увеличение уровня мочевины под их влиянием также свидетельствовало о снижении токсического проявления ТХМ и ЛПС.

Для количественной оценки морфофункциональных изменений в печени, почках, легких и сердце при ОЭТ и ХЭТ, индуцированных ТХМ и бактериальным ЛПС, и коррекции их препаратами вычисляли объемные доли (ОД, мкм³/мкм³) основных гистологических компонентов изученных органов.

Как показали гистологические исследования паренхимы печени крыс с ОЭТ и ХЭТ, у экспериментальных животных развивался жировой гепатоз. Сравнение результатов в группах показало, что эффективность протекторного действия энтеросорбентов в отношении паренхимы печени на модели ОЭТ убывала в ряду: ПДСБ > уголь активированный > Полисорб МП и модели ХЭТ ПДСБ > Полисорб МП > активированный уголь.

В эксперименте с ОЭТ наблюдали нарушение канальцевой реабсорбции в почках, усиление гемодинамических нарушений в микрососудах всех исследованных органов паренхимы почек. Эффективность протекторного действия энтеросорбентов в отношении почечной паренхимы на модели ОЭТ убывала в ряду: Полисорб МП > ПДСБ > уголь активированный и модели ХЭТ Полисорб МП > активированный уголь > ПДСБ.

Изменения в легких и сердце при ХЭТ характеризовались увеличением ОД соединительной ткани, альвеолоцитов и отека. При введении энтеросорбентов наблюдалось уменьшение тканевого повреждения.

Полученные данные свидетельствуют о том, что курсовое назначение исследуемых энтеросорбентов в значительной мере уменьшает тяжесть эндотоксикоза, снижает выраженность тканевого повреждения и частично нормализует биохимические показатели крови. ПДСБ на моделях острого и хронического эндотоксикоза, вызванных тетрахлорметаном и липополисахаридом, обладает детоксикационными свойствами.

Глава 7 Разработка состава и технология таблеток ПДСБ

К наиболее рациональным лекарственным формам, предназначенным для энтерального применения, относятся таблетки. Исходя из этого, задача по разработке лекарственного средства на основе дерновины сфагнума бурого включала обоснование рациональной комбинации вспомогательных веществ и способа ее таблетирования.

Для подбора оптимального состава вспомогательных веществ при получении гранул и, в последующем, таблеток из порошка дерновины сфагнума бурого, были проведены эксперименты с использованием трехфакторного симметричного дробного плана на основе латинского квадрата первого порядка «3Ч3». Из факторов, определяющих процесс гранулирования и последующего прессования таблеток, в качестве объектов исследования изучали: А - антифрикционные вещества; В - связывающие вещества; С - размер гранул, мм (табл. 8). В качестве связывающих компонентов использовали водные гели крахмала, гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ) и поливинилпирролидона (ПВП).

Таблица 8 - Параметры латинского квадрата в определении компонентного состава таблеток дерновины сфагнума бурого

А - антифрикционные вещества	В - связывающие вещества	С - размер гранул, мм
а1	кальция стеарат	b1	3 % гель крахмала	с1	1,0-0,5
а2	магния стеарат	b2	3% гель ПВП	с2	0,25-0,125
а3	тальк	b3	3% гель ГПМЦ	с3	0,5-0,25

В качестве параметров оптимизации выбраны характеристики, определяющие, с одной стороны, доброкачественность таблеток и их соответствие требованиям нормативной документации: Y₁ - коэффициент прочности на излом (н/м²), и Y₂ - время распадаемости таблеток (мин).

С другой стороны, представляет интерес изучить влияние вспомогательных веществ на адсорбционную активность разрабатываемого препарата по различным маркерам: Y₃ - адсорбционная активность по метиленовому синему, мг/г; Y₄ - адсорбционная активность по метиловому оранжевому, мг/г; Y₅ - адсорбционная активность по желатину, мг/г.

Матрица планирования эксперимента и результаты исследований по подбору вспомогательных веществ для таблеток, представлены в таблице 9.

Таблица 9 - Матрица планирования эксперимента и результаты исследований

Номер опыта	Фактор	Исследуемый параметр
	А	В	С	Y1, н/м2	Y 2, мин	Y3, мг/г	Y4,мг/г	Y5,мг/г
1	а1	b3	с3	129± 0,2	3,1± 0,2	118±10,8	0,3±0,2	94±3,2
2	а3	b2	с1	119± 0,2	4,0± 0,2	333±20,7	0,1±0,2	195±6,3
3	а2	b2	с3	122± 0,2	1,3± 0,2	332±9,7	0,1±0,1	150±2,3
4	а3	b3	с2	132± 0,2	4,1± 0,2	250±10,8	0,2±0,2	100±3,1
5	а1	b2	с2	116± 0,2	1,2± 0,2	305±3,7	0,1±0,1	170±3,4
6	а2	b1	с2	122± 0,2	0,5± 0,2	56±1,8	0,9±0,1	54±3,4
7	а3	b1	с3	135± 0,2	0,3± 0,2	71±1,6	0,8±0,1	62±2,2
8	а2	b3	с1	116± 0,2	4,8± 0,2	303±1,7	0,4±0,1	96±3,2
9	а1	b1	с1	119± 0,2	2,2± 0,2	59±1,4	0,6±0,1	50±3,4

Установлено, что размеры гранул влияют на прочность на излом (F_эксп. 28,4>F_табл.19) и распадаемость (F_эксп.20,1 >F_табл.19). Антифрикционные вещества определяют значение прочности на излом (F_эксп.21,7>F_табл.19), связующие вещества - распадаемости (F_эксп.36,5 >F_табл.19).

Существенное влияние на адсорбционную активность в получаемых таблетках ПДСБ оказывали связующие вещества по метиленовому синему (F_эксп.19,1>F_табл.19), метиловому оранжевому (F_эксп.19,7 >F_табл.19) и желатину (F_эксп.65,7 >F_табл.19).

Следующий этап работы был направлен на изучение влияния различных концентраций связывающих веществ в таблетках на их адсорбционную активность (табл. 10).

Таблица 10 - Адсорбционная активность таблеток и ПДСБ в зависимости от концентрации связующих веществ

Связующий агент	Адсорбционная активность, мг/г
	МС	МО	Желатин
3% гель ПВП	305±1,7 1,4	0,3±0,5 1, 4	170±1,8 1, 4
10% гель ПВП	365± 2,4	0,3±0,54	210±2,1
3% гель крахмала	71±1,5 2, 4	0,6±0,6 2, 4	54±0,8 2, 4
10% гель крахмала	81±1,4 4	0,6±1,5 4	60±0,9 4
3% гель ГПМЦ	250±2,7 3, 4	0,2±1,2 3, 4	96±1,5 3, 4
10% гель ГПМЦ	265±2,0 4	0,2±1,4 4	100±1,4 4
ПДСБ	354±5,2	6,9±1,64	211±7,7

Примечание: ¹ р?0,05 по сравнению с 10% гелем ПВП, ² р?0,05 по сравнению с 10% гелем крахмала, ³ р<0,05 по сравнению с 10% гелем ГПМЦ, ⁴ р?0,05 по сравнению с ПДСБ

Результаты исследований свидетельствуют, что введение в состав таблеток ПДСБ связующих реагентов ограничивало их сорбционную активность по отношению к метиловому оранжевому.

Пропись таблеток с содержанием 3% геля крахмала проявляла адсорбционную активность по метиленовому синему на 80%, а по желатину - на 75% ниже адсорбционной активности ПДСБ. В таблетках с 10% гелем крахмала адсорбционную активность уменьшалась по аналогичным маркерам на 77% и 72 %, соответственно.

3% и 10% гели ГПМЦ умеренно подавляли адсорбционную активность дерновины сфагнума в таблетках по метиленовому синему на 30% и 25%, желатину - 55% и 53%, соответственно.

Введение в состав таблеток 3% геля ПВП снижало их адсорбционную активность по метиленовому синему на 14%, желатину - 20% по сравнению с соответствующим показателем ПДСБ. Увеличение концентрации геля ПВП до 10% приводило к росту адсорбционной активности разрабатываемых таблеток по метиленовому синему и желатину на 20% по сравнению с активностью 3% геля до уровня соответствующего показателя порошка (рис. 7).

Рисунок 7 - Зависимость адсорбционной активности от массовой доли связующих веществ, %

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о целесообразности использования в качестве связующего агента гелей ПВП, введение которых в состав таблетируемой смеси не снижало адсорбционную активность исходного ПДСБ. По результатам проведенных исследований предложен следующий состав таблеток (m_табл=650 мг):

Порошок дерновины сфагнума бурого - 92,3%;

ПВП - 8,7 %;

Магния стеарат - 1%.

Рациональность предложенного состава подтверждается оценкой белок связующей активности изучаемых образцов. Таблетки, изготовленные по предложенной прописи, более эффективно, чем ПДСБ сорбировали бычий сывороточный и человеческий альбумины: на 63% и 64% соответственно (р<0,05), (табл. 11).

Таблица 11 - Адсорбционная активность ПДСБ и таблеток на его основе

Объекты исследования	Адсорбционная активность, мг/г
	БСА	ЧСА
ПДСБ	210±2,8	195±3,5
Таблетки с 10 % гелем ПВП	343±2,1	320±1,4

Таблетки предложенного состава были стандартизированы по внешнему виду, отклонению от средней массы, распадаемости, прочности на истирание, микробиологической чистоте и адсорбционной активности.

дерновина сфагнум адсорбционный детоксикационный

Заключение

Таким образом, в результате выполненных комплексных физико-химических, технологических и биофармацевтических исследований предложено оригинальное лекарственное средство на основе дерновины сфагнового мха с выраженной адсорбционной и детоксикационной активностью.

Выводы

1. Из 24 видов сфагновых мхов наибольшей адсорбционной активностью обладает дерновина видов: S. girgensohnii, S. cuspidatum, S. centrale, которые относятся к секциям Acutifolia, Cuspidata и Sphagnum. Максимальная адсорбционная активность дерновины по метиленовому синему и желатину характерна для 9-ти видов сфагновых мхов из секций Acutifolia (S. capillifolium, S. fuscum), Cuspidata (S. angustifolium, S. balticum, S. fallax, S. lindbergii, S. majus), Sphagnum (S. magellanicum, S. papillosum). С учетом эксплуатационных запасов перспективным объектом для разработки сорбента является S. fuscum.

2. Параметры качества ПДСБ отвечают следующим требованиям: размер частиц менее 0,1 мм; влажность не более 8,0 ± 0,1 %; содержание общей золы 5,4 ± 0,2 % и тяжелых металлов - менее 0,01 %; адсорбционная активность по метиленовому синему ? не менее 250 мг/г; адсорбционная активность по желатину ? не менее 200 мг/г; по микробиологической чистоте относится к категории 3Б.

3. Механизм сорбции ПДСБ обусловлен адсорбцией, ионообменом и комплексообразованием.

4. ПДСБ на моделях острого и хронического эндотоксикоза, вызванных тетрахлорметаном и липополисахаридом, проявляет детоксикационные свойства.

5. Оптимальный состав таблеток ПДСБ: порошок дерновины сфагнума бурого - 92,3%; поливинилпирролидон - 8,7 %; магния стеарат - 1%. Определяющее влияние на прочность таблеток на излом имеют антифрикционные вещества, на распадаемость и адсорбционную активность по отношению к различным маркерам - связующие агенты.

6. Параметры качества таблеток ПДСБ характеризуются следующими значениями: внешний вид ? таблетки светло-коричневого цвета, с плоскоцилиндрическими гладкими, однородными поверхностями, цельными краями; распадаемость ? не более 15 минут; прочность на истирание ? не менее 97 %; адсорбционная активность по метиленовому синему ? не менее 200 мг/г; адсорбционная активность по желатину ? не менее 100 мг/г.

Результаты данного диссертационного исследования могут быть рекомендованы для использования в фармацевтической практике с целью расширения ассортимента средств с детоксикационным свойством.

Перспективы дальнейшей разработки темы диссертационного исследования заключаются в совершенствовании технологических приёмов и схемы производства, разработке опытно-промышленного регламента и продолжении исследований по формированию регистрационного досье на оригинальное лекарственного средство с адсорбционной активностью с целью его регистрации и серийного выпуска.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Келус Н.В. Адсорбционная активность сырья водно-болотных растений Западной Сибири / Н.В. Келус, Л.Г. Бабешина, С.Е. Дмитрук др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. - № 4. - С. 37-41.

2. Субботина Н.С. Исследование исходного сырья и экстрактов на содержание тяжелых металлов / Н.С. Субботина, С.Е. Дмитрук, Н.В. Келус и др. // Вестник Новосибирского государственного университета. - 2010. - №3. - С. 92-98.

3. Келус Н.В. Разработка проекта фармакопейной статьи на субстанцию сфагнума бурого (Sphagnum L.) / Н.В. Келус, В.В. Шейкин, А.Е. Гундарева и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - №5. - С. 121-126.

4. Келус Н.В. Терапевтическая эффективность энтеросорбентов на модели острого эндотоксикоза / Н.В. Келус, В.С. Чучалин, В.В. Иванов и др. // Вестник новых медицинских технологий. - 2013. - №3. - С. 90-99.

5. Келус Н.В. Исследование рынка энтеросорбентов и перспективы их поиска среди лекарственного растительного сырья / Н.В. Келус, Ю.А. Музыра, Л.Г. Бабешина и др. // Сб.: «Современные проблемы фармакологии и фармации»: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Новосибирск, 2005. - С.469-472.

6. Келус Н.В. Изучение адсорбционной способности сфагнового мха / Н.В. Келус, Л.Г. Бабешина, В.Н. Дмитрук // Сб.: «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения»: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Л.Н. Березнеговской. - Томск: Издательство «Печатная мануфактура», 2006. - С. 165-169.

7. Дмитрук В.Н. Обоснование перспективы комплексного применения сфагнового мха в медицинской практике / В.Н. Дмитрук, Л.Г. Бабешина, Н.В. Келус и др. // Сб.: «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения»: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Л.Н. Березнеговской. - Томск: Издательство «Печатная мануфактура», 2006. - С. 189-193.

8. Бабешина Л.Г. Исследование химического состава Sphagnum fallax / Л.Г. Бабешина, Н.В. Келус, М.Д. Федотова // Сб.: «Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения»: Материалы Всероссийской научно-практической конференции ПГФА. - Пермь, 2008. - С.173-175.

9. Бабешина Л.Г. Элементный состав водно-болотных растений / Л.Г. Бабешина, Н.С. Субботина, Н.В. Келус и др. // Сб: «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства»: Материалы международной научно-практической конференции. Шымкент, (Казахстан), 2009. - Т.1. - С. 208-211.

10. Энтеросорбент растительного происхождения и способ его получения: пат. 2391998 Рос. Федерация, МПК⁷ А61К 36/902, А61Р 1/04 / Дмитрук С.Е., Бабешина Л.Г., Келус Н.В.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Сибирский государственный университет» Росздрава. - № 2008147659/15; заявл. 02.12.2008; опубл. 20.06.2010, Бюл. №17.

11. Характеристика сфагновых мхов флоры Томской области: учебное пособие / Л.Г. Бабешина, В.Н. Дмитрук, Н.В. Келус, - Томск.: ОАО ТМДЦ «Технопарк», 2008.- 92 с.

Размещено на Allbest.ru