Размещено на http://www.allbest.ru/

Изолирование лекарственных средств из плазмы крови с применением протеолитических ферментов

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

ЧУВИНА НАТАЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

Санкт-Петербург 2013



Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации на кафедре фармацевтической химии

Научный руководитель: Куклин Владимир Николаевич доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты: Гравель Ирина Валерьевна

доктор фармацевтических наук, профессор ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России, профессор кафедры фармакогнозии

Малкова Тамара Леонидовна

доктор фармацевтических наук, доцент ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России, заведующий кафедры токсикологической химии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится "17" сентября 2013 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 14, лит. А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197277, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей 14).

Автореферат разослан "___" 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, Д 208.088.01,

кандидат фармацевтических наук,

доцент Марченко Наталья Владимировна



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Химико-токсикологический анализ в случае острых отравлений различными ядами, и в частности лекарственными средствами, является одним из наиболее важных этапов в комплексе диагностических и лечебных мероприятий. Проведение лабораторного исследования включает четыре основных этапа: изолирование токсических веществ из биологического объекта (биологических жидкостей, биологического материала), очистку и концентрирование полученного извлечения, идентификацию веществ и их количественное определение.

Для диагностики острых отравлений наиболее информативной жидкостью является кровь, так как после поступления в кровеносное русло любое химическое вещество, в том числе и лекарственное средство, в той или иной степени связывается с белками плазмы крови, преимущественно с альбумином. Исследование плазмы крови позволяет судить о наличии и фактическом содержании токсикантов в организме в определенный момент времени, при этом фармакокинетический показатель степени связывания с белками плазмы крови для некоторых лекарственных средств может достигать 90-98% (например, дифенгидрамин, фенотиазины и др.).

Основным и наиболее важным в анализе токсических веществ является этап изолирования ксенобиотиков из биологического объекта. На этом этапе можно частично или полностью потерять токсическое вещество и впоследствии не обнаружить его даже при использовании современного и высокочувствительного аналитического оборудования. Применяемые в настоящее время методы изолирования лекарственных средств не всегда отвечают требованиям современной аналитической токсикологии. Известно, что для изолирования лекарственных средств из крови (плазмы крови) используются методы: прямой жидкость-жидкостной экстракции органическим растворителем (ЖЖЭ) при определенном значении рН среды; экстракция после использования осаждающих агентов (трихлоруксусной кислоты раствора 50% (ТХУ) или натрия вольфрамата раствора 10% в серной кислоты растворе 25%) или высаливающих агентов (аммония сульфата, натрия хлорида растворы насыщенные); также изолирование после гемолиза эритроцитов крови водой очищенной. В то же время, существующие методы изолирования токсических веществ из крови практически не позволяют выделить фракцию токсиканта, связанную с белками крови, и при ЖЖЭ в органический слой экстрагируется только его свободная фракция.

В связи с вышеизложенным, для целей химико-токсикологического анализа актуальным остается вопрос разработки новых или усовершенствование существующих методик изолирования токсических веществ, позволяющих максимально разрушить комплекс «белок - токсикант». Это позволит существенно увеличить процент выделенного токсического вещества, что, в свою очередь, повысит эффективность лабораторной диагностики острых отравлений. Весьма перспективным является применения с этой целью различных ферментативных препаратов. Методики ферментативного гидролиза биологических жидкостей (мочи) для разрушения водорастворимых метаболитов ксенобиотиков (глюкурониды, сульфаты) с применением ферментов в-глюкуронидазы и в-сульфотазы в литературе описаны, однако сведения о применении протеолитических ферментов для гидролиза крови, плазмы крови с целью выделения токсиканта в литературе отсутствуют.

Цель работы. Разработка метода изолирования лекарственных средств из плазмы крови после гидролиза ее белковых молекул протеолитическими ферментами для целей химико-токсикологического анализа.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Выбрать лекарственные средства, различающиеся по химическому строению, кислотно - основным свойствам, степени связывания с белками плазмы крови и наиболее часто встречающиеся в судебно -- химической и химико -- токсикологической экспертизе.

2. Установить оптимальные условия (время и температура инкубации, значение рН среды, соотношение субстрат : фермент) для проведения гидролиза протеолитическими ферментами (пепсин, трипсин, химотрипсин, химопсин) на примере модельного комплекса «раствор альбумина - раствор кофеина»

3. Применить разработанные методики ферментативного гидролиза для изолирования анализируемых веществ из модельного комплекса «плазма крови - раствор анализируемого вещества».

4. Сравнить эффективность известных методов изолирования изучаемых веществ из плазмы крови (жидкость -- жидкостная экстракция с осаждением и без осаждения белков, твердофазная экстракция) с разработанным методом ферментативного гидролиза белков плазмы крови и определить для него некоторые валидационные характеристики (сходимость, внутрилабораторная воспроизводимость и робастность).

5. Апробировать разработанный метод на экспертном материале и внедрить его в практику работы бюро судебно-медицинской экспертизы и наркодиспансеров.

Научная новизна работы. Доказано, что при прямой ЖЖЭ органическим растворителем извлекается из плазмы крови лишь свободная, не связанная с белками крови фракция анализируемых веществ; предварительное использование осаждающих реагентов при изолировании токсических веществ не всегда приводит к увеличению степени экстракции.

Впервые изучена возможность изолирования исследуемых веществ из плазмы крови с применением гидролиза протеолитическими ферментами и выявлены ее особенности. Показано, что на процесс ферментативного гидролиза белков плазмы крови влияют свойства фермента, время инкубации, соотношение субстрат : фермент, значение рН среды и температура.

Установлено, что по сравнению с методом ЖЖЭ изолирование исследуемых веществ из плазмы крови после гидролиза химопсином для кофеина, целекоксиба, оснований дифенгидрамина, хлоропирамина, клемастина, папаверина и ферментом трипсином для производных барбитуровой кислоты (фенобарбитал, барбамил) приводит к увеличению степени экстракции в 1.8-2 раза, как и при изолировании их методом твердофазной экстракции (ТФЭ) на патронах марки Oasis HLB. Использование при гидролизе ферментов: пепсин, химотрипсин приводит к незначительному увеличению степени экстракции изученных лекарственных средств по сравнению с методами ЖЖЭ и ТФЭ, ввиду их большой специфичности по отношению к гидролизу пептидных связей определенных пар аминокислот в белковой молекуле.

При целенаправленном исследовании оснований дифенгидрамина, хлоропирамина, клемастина, папаверина и целекоксиба следует использовать патроны марки Oasis МСХ, а для веществ кислотного характера (производные барбитуровой кислоты) - патроны марки Oasis МАХ, что также позволяет увеличить степень экстракции по сравнению с методом ЖЖЭ. Патроны марки Oasis WCX и WAX не могут быть использованы для изолирования изучаемых ксенобиотиков, так как они не осаждаются на сорбенте патрона. гидролиз фермент альбумин кофеин

Впервые показано, что при использовании метода ферментативного гидролиза плазмы крови с целью изолирования ксенобиотиков и метода ТФЭ результаты исследования сопоставимы. Метод ферментативного гидролиза можно рекомендовать для использования в практике работы судебно-химических и химико-токсикологических лабораторий.

Практическое значение работы. Разработаны методики гидролиза плазмы крови протеолитическими ферментами с целью последующего изолирования токсических веществ.

Проведена сравнительная оценка методов изолирования токсикантов из плазмы крови: ЖЖЭ органическим растворителем, изолирование после осаждения белков, изолирование после ферментативного гидролиза и изолирование методом ТФЭ.

Определены некоторые валидационные характеристики (прецизионность - сходимость и внутрилабораторная воспроизводимость, робастность) для разработанного метода ферментативного гидролиза плазмы крови ферментом химопсином для изолирования кофеина, целекоксиба, дифенгидрамина, хлоропирамина, клемастина, папаверина и трипсином для некоторых производных барбитуровой кислоты (барбамила, фенобарбитала).

Разработанные методики апробированы, утверждены и внедрены в практику работы судебно-химических отделений ГКУЗ БСМЭ ЛО и СПб ГБУЗ БСМЭ, химико-токсикологической лаборатории СПБ ГБУЗ МНД №1 и ГУ СПб НИИ СП им. И.И. Джанелидзе и используются в учебном процессе кафедр фармацевтической химии ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России и ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России.

Апробация работы. Основные материалы работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90 и 95-летию СПб ГУЗ БСМЭ, «Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы трупа» (Санкт-Петербург, 2008, 2013); Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009); Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2011); Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2011 и 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 6 в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.

Связь задач исследования с планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом исследовательских работ ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России «Синтез, изучение строения, фармакологического действия новых биологических веществ или модифицированных субстанций, препаратов и разработка валидированных методик их стандартизации», номер государственной регистрации ЦИТиФ №01201252028.

Основные положения, выносимые на защиту:

Обоснование результатов экспериментальных исследований по изолированию заявленных ксенобиотиков из плазмы крови методом ЖЖЭ органическим растворителем, и производных барбитуровой кислоты после осаждения белков трихлоруксусной кислоты раствором 50% и натрия вольфрамата раствором 10% в серной кислоты растворе 25% .

Данные экспериментальных исследований по изолированию ксенобиотиков из плазмы крови после ферментативного гидролиза протеолитическими ферментами.

Результаты экспериментальных исследований по изолированию веществ методом ТФЭ на патронах марки Oasis (HLB, MCX, WAX, MAX).

Сравнительная оценка разработанного метода ферментативного гидролиза с методами прямой ЖЖЭ органическими растворителем, с осаждением и без осаждения белков плазмы крови и ТФЭ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками и 45 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), результатов и выводов, списка литературы, включающего 150 наименований (источников 35 зарубежной литературы) и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

Во введении приведена актуальность, цели и задачи исследования, его научная новизна и практическая значимость. В литературном обзоре указаны данные по степени связывания ксенобиотиков с белками плазмы крови; факторы, влияющие на степень связывания веществ с альбумином. Описаны условия по проведению ферментативного гидролиза белков; факторы, влияющие на полноту гидролиза.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Выполнение исследования осуществлялось нами с использованием оборудования лаборатории «МНД №1» (газовый хроматограф с масс-селективным детектором Agilent Technologies 7890А, высокоэффективный жидкостной хроматограф «Waters 2695», СФ-2000, ИК-Фурье-спектрометр модель ФСМ-1201), применением плазмы донорской крови, протеолитических ферментов (трипсин, химотрипсин, химопсин, пепсин). В качестве объектов исследования использовались вещества:

Выбранные вещества отличаются по химическому строению, кислотно-основным свойствам, степени связывания с белками плазмы крови, относятся к разным фармакологическим группам. По данным литературы связывание с белками плазмы крови составляет для кофеина - 40-50%, фенобарбитала, барбамила - 50-60%, дифенгидрамина - 90-92%, хлоропирамина -70-80%, клемастина - 95%, папаверина - 70%, целекоксиба - около 97%. В зависимости от кислотно-основных свойств (рКа) объекты исследования вещества можно разделить на группы: производные барбитуровой кислоты (фенобарбитал, барбамил) извлекаются органическим растворителем из водных растворов с рН<7 среды; кофеин, являясь слабым основанием, извлекается как из кислых, так и щелочных водных растворов, а основания хлоропирамина, дифенгидрамина, клемастина, папаверина и целекоксиб из водных растворов с рН>7среды.

Предварительно методами газовой хроматографии с масс -- селективным детектором (ГХ/МС); высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), инфракрасной (ИК) и ультрафиолетовой (УФ) спектроскопии и тонкослойной хроматографии (ТСХ) установлена подлинность, чистота и определены некоторые физико-химические характеристики всех объектов исследования, используемые, в дальнейшем для их анализа в извлечениях из плазмы крови.

Количественное определение анализируемых веществ в полученных извлечениях из плазмы крови определяли методом ВЭЖХ на приборе «Waters 2695» с колонкой Nova Pak C18 4 мкм 3,9х150 мм. Условия хроматографирования подобраны в соответствии с ФС и данными литературы: температура колонки - 30 ?С; УФ-детектор с аналитической длиной волны 220 нм; объем вводимой пробы - 10 мкл; режим подачи элюентов изократический. На хроматограммах наблюдался один пик анализируемого вещества (таблица 1). Количественное содержание анализируемого вещества в извлечении рассчитывали по калибровочному графику зависимости площади пика вещества от его концентрации.

Таблица 1 - Условия хроматографирования и время удерживания веществ

Анализируемое вещество	Условия хроматографирования	Время удерживания (мин)
кофеин	Подвижная фаза - ацетонитрил : фосфатный буфер с рН=3 (60:40). Скорость подачи подвижной фазы - 400 мкл/мин	2,90+0,15
дифенгидрамин		6,80+0,35
хлоропирамин		8,50+0,43
папаверин		3,40+0,18
клемастин	Подвижная фаза - ацетонитрил : фосфатный буфер с рН=3 (60:40). Скорость подачи подвижной фазы - 1мл/мин	11,90+0,55
барбамил	Подвижная фаза - ацетонитрил : вода деионизованная (60:40). Скорость подачи подвижной фазы - 300 мкл/мин	3,70+0,19
фенобарбитал		3,50+0,18
целекоксиб		7,90+0,40

Для методик ВЭЖХ были определены валидационные характеристики (линейность, прецизионность и открываемость). Параметр линейности определялся путем анализа растворов исследуемых веществ на 5 уровнях концентраций. Значение коэффициентов корреляции находится в пределе 0,99 ? R ? 1,0. Прецизионность метода устанавливали по показателям: сходимость и внутрилабораторная воспроизводимость. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) при оценке сходимости и воспроизводимости не превышало 2,0% и соответствовало критерию приемлемости (при RSD<10% изменчивость вариационного ряда считается незначительной). Правильность методики определяли путем анализа растворов исследуемых веществ с известной концентрацией. Открываемость (R, %) находится в диапазоне 98,6-100,4% (критерий приемлемости определяется пределом 97-103%). При оценке робастности метода ВЭЖХ контролировали параметры: соотношение элюентов в подвижной фазе, значение рН среды и скорость подачи подвижной фазы, тип и температура колонки. Специфичность методики определялась характерным временем удерживания для каждого анализируемого вещества, измеренного на определенном приборе в определенных условиях.

Глава 3. Изолирование анализируемых веществ из плазмы крови методом ЖЖЭ

Для создания модельного комплекса «плазма крови - раствор анализируемого вещества» использовали метод, описанный в литературе Чёгёром С.И.: к 2.5 мл плазмы крови добавляли 2.5 мл раствора анализируемого объекта в фосфатном буферном растворе с рН=7.4 среды. Полученную модельную смесь тщательно перемешивали и инкубировали в термостате 1 ч при 37єС. Концентрация в фосфатном буферном растворе составляла для клемастина фумарата - 100 мкг/мл; фенобарбитала, барбамила, кофеина - 1 мг/мл; хлоропирамина гидрохлорида - 200 мкг/мл; папаверина гидрохлорида - 400 мкг/мл; дифенгидрамина гидрохлорида и целекоксиба - 500 мкг/мл.

Полученный модельный комплекс после инкубирования переносили в делительную воронку и экстрагировали 3 раза хлороформом по 5 мл, 5 мин при оптимальных значениях рН среды, контролируемых по универсальному индикатору: кофеин - 4-5; фенобарбитал, барбамил 2-3; основания дифенгидрамина, хлоропирамина, клемастина, папаверина 9-10 и целекоксиба 11-12. Оптимальные значения рН среды для экстракции определяли в соответствии со значениями рКа и законом Гендерсона-Гассельбаха. Корректировали рН среды с помощью хлористоводородной кислоты раствора 0,1 М или аммиака водного. Объединённое хлороформное извлечение фильтровали через складчатый фильтр с натрия сульфатом безводным, выпаривали до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в 1 мл ацетонитрила сорта 0 и исследовали методом ВЭЖХ (таблица 2).

Таблица 2 - Результаты статистической обработки данных по степени экстракции веществ из модельного комплекса методом прямой ЖЖЭ

Анализируемое вещество	Метрологические характеристики (n=6, t=2,01)
	_ X, %	S	S x	?X	е %	CV
фенобарбитал	29,4	1,04	0,42	2,1	7,1	3,8
барбамил (кислотная форма)	22,1	0,90	0,40	1,8	8,1	4,7
кофеин	45,4	0,50	0,20	1,0	2,2	1,1
целекоксиб	18,7	0,38	0,16	0,8	4,1	2,4
дифенгидрамин	8,9	0,33	0,13	0,7	7,3	3,7
хлоропирамин	16,5	0,67	0,27	1,3	8,1	4,6
клемастин	3,2	0,13	0,06	0,3	8,4	4,5
папаверин	11,2	0,20	0,08	0,4	3,6	1,8

Полученные данные по степени экстракции анализируемых веществ из плазмы крови методом прямой ЖЖЭ органическим растворителем совпадают с данными литературы по степени связывания веществ с белками плазмы крови. Для изолирования исследуемых веществ из плазмы крови методом ЖЖЭ были определены некоторые валидационные характеристики. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышало 5,2%, что соответствует критериям приемлемости.

Изолирование анализируемых веществ из плазмы крови с использованием осаждающих агентов

При изолировании лекарственных средств из крови или плазмы крови для осаждения белковых молекул, мешающих определению токсических веществ, наиболее часто используется трихлоруксусная кислота раствор 50%.

Изолирование анализируемых веществ после осаждения белков проводили по методике: к 5 мл модельного комплекса «плазма крови - раствор анализируемого вещества» добавляли 3 мл ТХУ раствора 50% и перемешивали. Раствор центрифугировали 10 мин при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость переносили в делительную воронку и корректировали рН среды до оптимальных для каждого исследуемого вещества значений. Изолирование и количественное определение анализируемых веществ проводили по описанной выше методике.

Сравнение данных таблиц 2 и 3 показывает, что изолирование веществ из плазмы крови после осаждения белков ТХУ раствором 50% по сравнению с методом прямой ЖЖЭ без применения осаждающих агентов не повышает степень экстракции исследуемых веществ, что возможно связано с соосаждением анализируемого вещества на крупнодисперсном осадке белка.

Таблица 3 - Результаты статистической обработка данных по степени экстракции веществ из модельного комплекса после осаждения белков ТХУ раствором 50%

Анализируемое вещество	ЖЖЭ, _ X %	Метрологические характеристики (n=6, t=2,01)
		_ X, %	S	S x	?X	е %	CV
фенобарбитал	29,4	23,1	0,97	0,39	1,9	8,4	4,2
барбамил (кислотная форма)	22,1	12,0	0,60	0,20	1,2	10,0	5,8
кофеин	45,4	31,1	0,65	0,26	1,3	4,1	2,6
целекоксиб	18,7	13,5	0,26	0,11	0,5	3,9	1,9
дифенгидрамин	8,9	4,6	0,21	0,08	0,4	9,0	4,6
хлоропирамин	16,5	8,9	0,42	0,17	0,8	9,4	5,7
клемастин	3,2	1,5	0,06	0,02	0,1	7,9	3,4
папаверин	11,2	8,2	0,38	0,15	0,8	9,3	4,7

Для методики осаждения белков ТХУ раствором 50% были определены некоторые валидационные характеристики: относительное стандартное отклонение (RSD, %) при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышала 6,9%, что соответствует критериям приемлемости.

Известно, что в экспертной практике для изолирования производных барбитуровой кислоты из крови или плазмы крови при целенаправленном исследовании, применяют частный метод. Осаждение белков проводят путем добавления 0,25 мл натрия вольфрамата раствора 10% и 0,25 мл серной кислоты раствора 20%. Дальнейшее изолирование и количественное определение проводили по описанной выше методике. Из полученных данных видно (таблица 4), что результаты сопоставимы при изолировании производных барбитуровой кислоты из модельного комплекса методами прямой ЖЖЭ органическим растворителем и после использования натрия вольфрамата раствора в среде серной кислоты растворе.

Таблица 4 - Результаты статистической обработки данных по степени экстракции производных барбитуровой кислоты частным методом изолирования

Анализируемое вещество	ЖЖЭ, _ X %	Метрологические характеристики (n=6, t=2,01)
		_ X, %	S	S x	?X	е %	CV
фенобарбитал	29,4	26,2	1,30	0,53	2,6	9,9	5,0
барбамил (кислотная форма)	22,1	24,1	0,70	0,30	1,4	5,8	2,5

Глава 4. Изолирование анализируемых веществ из плазмы крови после гидролиза протеолитическими ферментами

Метод ферментативного гидролиза плазмы крови используется при биохимических исследованиях для определения аминокислотной последовательности в белковых компонентах. Данные по применению ферментов для судебно-химических исследований в литературе ограничены. Описаны отдельные случаи применения ферментов для гидролиза глюкуранидов и сульфатов токсических веществ из мочи и отсутствуют данные по применению протеолитических ферментов для изолирования лекарственных средств из плазмы крови.

Поскольку данные о точном месте локализации лекарственного средства на белковой молекуле в литературе отсутствуют, для разработки методики ферментативного гидролиза плазмы крови были использованы протеолитические ферменты животного происхождения с низкой специфичностью - пепсин, трипсин, химотрипсин, химопсин. Оптимальные условия для проведения гидролиза отрабатывали на модельном комплексе «раствор альбумина - раствор кофеина» по параметрам: буферный раствор и рН среды, температура и продолжительность гидролиза. По данным литературы оптимальная температура для проведения гидролиза 37єС, время инкубирования 1-4 ч.

Предварительно было проведено исследование по изолированию кофеина из модельного комплекса «раствор альбумина - раствор кофеина» методом прямой ЖЖЭ органическим растворителем и было получено в среднем 256,5 мкг/мл кофеина (25,7%), а затем проведено исследование по изолированию анализируемых веществ при использовании протеолитических ферментов. В результате проведенных исследований (таблица 5) был сделан вывод, что для максимального изолирования кофеина из модельного комплекса «раствор альбумина - раствор кофеина» ферментом трипсин, химотрипсин, химопсин, пепсин необходимое время инкубации 1 ч. При проведении гидролиза в течение 2-4 ч наблюдалось изменение конформации белка, образование иных связей, что приводит к уменьшению процесса гидролиза.



Таблица 5 - Результаты изучения зависимости степени экстракции кофеина, из модельного комплекса от времени ферментативного гидролиза

Фермент	Извлечено	Время гидролиза
		1 ч	2 ч	3 ч	4 ч
пепсин	мкг/мл	313,0	312,3	255,0	229,1
	%	31,3	31,2	25,5	22,9
трипсин	мкг/мл	688,3	608,9	551,3	532,7
	%	68,8	60,9	55,1	53,3
химотрипсин	мкг/мл	671,1	605,8	497,9	629,1
	%	67,1	60,6	49,8	62,9
химопсин	мкг/мл	747,6	712,0	631,7	615,4
	%	74,8	71,2	63,2	61,5

В качестве буферного раствора необходимо использовать аммония гидрокарбоната раствор 0,1 М с рН среды 8.0, а для фермента пепсина - хлористоводородной кислоты раствор 0,1 М при рН среды 4,0. Оптимальная температура инкубации составляет 37єС. При увеличении температуры до 42 єС наблюдается конформационные изменения в структуре альбумина, что приводит к замедлению процесса гидролиза, как и при уменьшении до 35 єС. Подобранные в ходе эксперимента условия ферментативного гидролиза протеолитическими ферментами модельного комплекса «раствор альбумина - раствор кофеина» были апробированы на комплексе «плазма крови - раствор анализируемого вещества».

Методика гидролиза пепсином

Гидролиз белков плазмы крови для последующего изолирования исследуемых веществ проводили по методике: к 5 мл модельного комплекса «плазма крови - раствор анализируемого вещества» добавляли 5 мл пепсина раствора 0,2% в хлористоводородной кислоты растворе 0,1М, инкубировали 1ч при 37єС. Модельную смесь переносили в делительную воронку и экстрагировали хлороформом 3 раза по 5 мл, 5 мин при оптимальных для каждого анализируемого вещества значениях рН среды. Объединённое хлороформное извлечение фильтровали через складчатый фильтр с натрия сульфатом безводным, выпаривали до сухого остатка. Сухой остаток исследовали физико-химическими методами, указанными выше. При исследовании было определено, что в процессе гидролиза анализируемые вещества под действием ферментов не видоизменяются и извлечения не содержат балластных веществ. Часть сухого остатка растворяли в 1мл ацетонитрила сорта 0 и проводили количественное определение методом ВЭЖХ.

Таблица 6 - Результаты статистической обработки данных по степени экстракции анализируемых веществ из модельного комплекса после гидролиза пепсином

Анализируемое вещество	ЖЖЭ, _ X %	Метрологические характеристики (n=6, t=2,01)
		_ X, %	S	S x	?X	е %	CV
фенобарбитал	29,4	37,5	0,90	0,40	1,8	4,8	2,9
барбамил (кислотная форма)	22,1	28,5	0,60	0,26	1,2	4,2	2,1
кофеин	45,4	46,9	0,50	0,21	1,0	2,1	1,1
целекоксиб	18,7	23,4	0,99	0,40	2,0	8,5	4,2
дифенгидрамин	8,9	14,4	0,29	0,12	0,6	4,0	2,0
хлоропирамин	16,5	21,1	0,30	0,13	0,6	2,8	1,4
клемастин	3,2	4,5	0,06	0,30	0,1	2,7	1,3
папаверин	11,2	15,1	0,17	0,07	0,3	2,3	1,1

Незначительное увеличение степени экстракции исследуемых веществ из плазмы крови после ферментативного гидролиза пепсином (таблица 6) по сравнению с методом прямой ЖЖЭ возможно связано с тем, что разрыв пептидных связей молекулы альбумина ферментом происходит, вероятно, не по месту связывания лекарственного средства с белковой молекулой.

Методика гидролиза трипсином

Гидролиз ферментом трипсином проводили по методике: к 5 мл модельного комплекса «плазма крови - раствор анализируемого вещества» добавляли 5 мл трипсина раствора 0,2% в аммония гидрокарбоната растворе 0,1 М, инкубировали 1ч при 37 єС. Изолирование и количественное определение проводили по методике указанной выше.

Таблица 7 - Результаты статистической обработки данных по степени экстракции веществ из модельного комплекса после гидролиза трипсином

Анализируемое вещество	ЖЖЭ, _ X %	Метрологические характеристики (n=6, t=2,01)
		_ X, %	S	S x	?X	е %	CV
Фенобарбитал	29,4	62,1	1,50	0,60	3,0	4,8	2,4
барбамил (кислотная форма)	22,1	75,1	1,90	0,70	3,8	5,1	3,1
кофеин	45,4	59,3	0,46	0,19	0,9	1,6	0,8
целекоксиб	18,7	37,7	0,88	0,36	1,8	4,8	2,3
дифенгидрамин	8,9	16,3	0,28	0,11	0,6	3,4	1,7
хлоропирамин	16,5	26,8	0,83	0,34	1,7	6,2	3,1
клемастин	3,2	6,9	0,08	0,03	0,2	2,3	1,1
папаверин	11,2	17,7	0,46	0,19	0,9	5,2	2,6

Увеличение степени экстракции исследуемых веществ после гидролиза плазмы крови трипсином более чем 1,5 раза (таблица 7) по сравнению с методом прямой ЖЖЭ связано с разрывом пептидной связи фрагмента лизин - аргинин в аминокислотной последовательности белковой молекулы, которые, возможно являются участками связывания исследуемых веществ. Для методики изолирования производных барбитуровой кислоты после гидролиза трипсином были определены некоторые валидационные характеристики. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышало 3,2%, что соответствует критериям приемлемости.

Методика гидролиза химотрипсином

Гидролиз ферментом химотрипсином проводили по методике: к 5 мл модельного комплекса «плазма крови - раствор анализируемого вещества» добавляли 5 мл химотрипсина раствора 0,2% в аммония гидрокарбоната растворе 0,1 М, инкубировали в термостате 1ч при 37єС. Изолирование и количественно определяли исследуемые вещества в выше указанных условиях.

Увеличение степени экстракции в 1.8 раза (таблица 8) связано с тем, что химотрипсин, как известно из данных литературы менее специфичен к аминокислотной последовательности белковой молекулы по сравнению с трипсином. Химотрипсин гидролизует пептидные фрагменты альбумина, образованные тирозином, триптофаном, лейцином и фенилаланином, на этих фрагментах, возможно и происходит связывание исследуемых веществ с белковой молекулой.

Таблица 8 - Результаты статистической обработки данных по степени экстракции веществ из модельного комплекса после гидролиза химотрипсином

Анализируемое вещество	ЖЖЭ, _ X %	Метрологические характеристики (n=6, t=2,01)
		_ X, %	S	S x	?X	е %	CV
фенобарбитал	29,4	52,5	1,20	0,50	2,4	4,6	3,2
барбамил (кислотная форма)	22,1	37,5	0,70	0,29	1,4	3,7	1,9
кофеин	45,4	70,4	1,90	0,79	3,9	5,6	2,9
целекоксиб	18,7	51,1	1,18	0,48	2,4	4,6	2,3
дифенгидрамин	8,9	19,9	0,69	0,28	1,4	6,9	3,5
хлоропирамин	16,5	35,6	0,96	0,39	1,9	5,3	3,3
клемастин	3,2	13,6	0,33	0,13	0,7	4,9	1,7
папаверин	11,2	22,5	0,36	0,15	0,7	3,2	1,6

Гидролиз ферментом химопсин проводили по методике: к 5 мл модельного комплекса «плазма крови - раствор анализируемого вещества» добавляли 5 мл химопсина раствора 0,2% в аммония гидрокарбоната растворе 0,1 М, инкубировали в термостате 1ч при 37єС. Изолировали и количественно определяли исследуемые вещества в выше указанных условиях.



Таблица 9 - Результаты статистической обработки данных по степени экстракции веществ из модельного комплекса после гидролиза химопсином

Анализируемое вещество	ЖЖЭ, _ X %	Метрологические характеристики (n=6, t=2,01)
		_ X, %	S	S x	?X	е %	CV
Фенобарбитал	29,4	58,8	1,05	0,43	2,1	3,6	1,8
барбамил (кислотная форма)	22,1	38,9	0,91	0,37	1,8	4,7	2,3
кофеин	45,4	77,2	0,85	0,35	1,7	2,2	1,1
целекоксиб	18,7	52,6	0,47	0,19	0,9	1,8	0,9
дифенгидрамин	8,9	22,5	0,78	0,32	1,6	6,9	3,5
хлоропирамин	16,5	36,4	0,64	0,26	1,3	3,5	1,8
клемастин	3,2	11,9	0,13	0,05	0,3	2,2	1,1
папаверин	11,2	22,9	0,42	0,17	0,8	3,7	1,8

Увеличение степени экстракции приблизительно в 2 раза (таблица 9) по сравнению с ЖЖЭ связано с тем, что фермент химопсин, является смесью двух ферментов трипсина и химотрипсина. Фермент трипсин в альбумине гидролизует пептидные связи, образованные лизином и аргинином, а фермент химотрипсин связи, образованные тирозином, триптофаном, лейцином и фенилаланином, которые, на наш взгляд, являются центрами связывания исследуемых веществ с белком. Для метода изолирования изучаемых веществ из плазмы крови после гидролиза химопсином были определены некоторые валидационные характеристики. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышало 3,7%, что соответствует критериям приемлемости. При оценке робастности ферментативного гидролиза химопсином и трипсином контролировали параметры: температура и время инкубации, буферный раствор и рН среды 8,0.

Апробация методики на экспертном материале

Методика гидролиза протеолитическим ферментом трипсином, была апробирована на экспертных образцах крови, в которых был обнаружен фенобарбитал. Количество фенобарбитала, выделенного прямой экстракцией органическим растворителем в 3 экспертных образцах крови, составляло в среднем 5,24; 5,5; 7,7 мг/л. В четвертом образце фенобарбитал обнаружен не был. Количество фенобарбитала, выделенного после гидролиза трипсином, составляло в среднем 7,95; 8,86; 12,5 мг/л в соответствующих пробах, что на 52-62% выше, чем при использовании прямой ЖЖЭ органическим растворителем. После проведения ферментативного гидролиза крови в четвертом образце после изолирования был обнаружен фенобарбитал в количестве 1,13 мг/л.

Глава 5. Изолирование анализируемых веществ из плазмы крови методом ТФЭ

В последнее время в практике токсикологического анализа для изолирования ксенобиотиков из биологических жидкостей (кровь, плазма крови, моча), все чаще используется метод твердофазной экстракции (ТФЭ). Основные преимущества этого метода по сравнению с традиционными - возможность одновременного выделения и концентрирования исследуемого токсиканта, а также значительное увеличение скорости и эффективности экстракции. Метод основан на использовании патронов с разными сорбционными свойствами, что позволяет избирательно адсорбировать на поверхности сорбента патрона вещества разной химической природы.

Экстракция на патронах марки Oasis HLB

Патроны марки Oasis HLB обладают гидрофильно-липофильной двойственностью и способны адсорбировать на себе токсические вещества разной химической природы. Данный вид патронов использовали для изолирования всех исследуемых нами веществ. К 1 мл модельного комплекса «плазма крови - раствор анализируемого вещества» добавляли 20 мкл ортофосфорной кислоты концентрированной. Патроны промывали 1 мл метанола и 1 мл воды очищенной, затем загружали 1 мл подкисленного образца модельного комплекса. Для извлечения лекарственных средств патроны промывали 1 мл метанола раствора 5% и элюировали 1 мл метанола. Элюат выпаривали досуха и исследовали физико-химическими методами, указанными выше. Часть сухого остатка растворяли в 1 мл ацетонитрила сорта 0 и проводили количественное определение метод ВЭЖХ, как описано выше.

Установлено (таблица 10), что использование патронов марки Oasis HLB приводит к увеличению степени экстракции объектов исследования по сравнению с прямой ЖЖЭ, вследствие частичного разрыва сорбентом связи «токсическое вещество -- белок». Это происходит за счет конкурирующей способности сорбента со связывающим центром альбумина за анализируемое вещество и хорошей его адсорбции на сорбенте патрона. Для данного метода изолирования были определены некоторые валидационные характеристики. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышала 5,9%, что соответствует критериям приемлемости.

Таблица 10 - Результаты статистической обработки данных по степени экстракции веществ из модельного комплекса после изолирования на патронах марки Oasis HLB

Анализируемое вещество	ЖЖЭ, _ X %	Метрологические характеристики (n=6, t=2,01)
		_ X, %	S	S x	?X	е %	CV
фенобарбитал	29,4	53,2	0,38	0,15	0,8	1,4	0,7
барбамил (кислотная форма)	22,1	42,9	0,79	0,32	1,6	3,7	1,8
кофеин	45,4	90,8	1,00	0,41	2,0	2,2	1,1
целекоксиб	18,7	51,5	0,44	0,18	0,9	1,7	0,9
дифенгидрамин	8,9	22,3	0,63	0,26	1,3	5,7	2,8
хлоропирамин	16,5	30,4	0,53	0,22	1,1	3,5	1,8
клемастин	3,2	10,6	0,49	0,20	1,0	9,8	4,6
папаверин	11,2	22,5	0,59	0,24	1,2	5,3	2,6



Экстракция на патронах марки Oasis МСХ и WСХ

Патроны марки Oasis МСХ и WСХ содержат полимер со смешанной обращенно-фазовой и катион-обменной функциональностью. Данные патроны обладают особой избирательностью к веществам основного характера (МСХ содержат сульфгидрильные группы; WСХ - карбоксильные группы). На данных патронах изолировали кофеин, основания дифенгидрамина, хлоропирамина, клемастина, папаверина и целекоксиб. Изолирование анализируемых веществ на патронах марки Oasis МСХ и WСХ проводили по методики: к 1 мл модельного комплекса добавляли 20 мкл ортофосфорной кислоты концентрированной. Патроны последовательно промывали 1 мл метанола и 1 мл воды очищенной, затем загружали 1 мл подкисленного образца модельного комплекса. Патроны МСХ промывали 1 мл хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М, а затем 1 мл метанола. Элюировали анализируемое вещество 1 мл аммиака раствором 5% в метаноле.

Патроны WСХ промывали 1 мл аммиака раствором 5% и 1 мл метанола. Элюировали 1 мл уксусной кислоты раствором 2% в метаноле. Элюаты выпаривали, растворяли в 1 мл ацетонитрила сорта 0 и проводили количественное определение действующих веществ методом ВЭЖХ.

Установлено (таблица 11), что использование патронов марки Oasis МСХ увеличивает извлечение веществ по сравнению с методом ЖЖЭ органическим растворителем в 2 раза для целекоксиба, дифенгидрамина, хлоропирамина и клемастина. Для кофеина и папаверина, установлено, уменьшение степени экстракции, так как они не сорбируются на патроне.



Таблица 11 - Результаты статистической обработка данных по степени экстракции веществ из модельного комплекса после изолирования на патронах Oasis МСХ и WСХ

Анализируемое вещество	ЖЖЭ, _ X %	Метрологические характеристики (n=6, t=2,01)
		Патроны Oasis МСХ	Патроны Oasis WСХ
		_ X+?X, %	е %	CV	_ X+?X, %	е %	CV
кофеин	45,4	5,2+0,1	2,3	1,2	13,1+0,3	2,2	1,1
целекоксиб	18,7	52,6+1,8	3,5	1,7	9,4+0,3	3,4	1,7
Дифенгидрамин	8,9	22,3+1,6	7,4	3,7	2,6+0,2	7,3	3,6
хлоропирамин	16,5	30,0+2,7	8,9	4,5	1,8+0,2	5,9	4,6
клемастин	3,2	9,2+0,8	9,0	4,5	1,9+0,2	9,0	4,5
папаверин	11,2	8,6+0,3	3,6	1,8	1,7+0,1	3,6	1,8

Изолирование на патронах марки Oasis WСХ проводить нецелесообразно, так как исследуемые ксенобиотики не сорбируются на их поверхности.

Экстракция на патронах марки Oasis МАХ и WАХ

Патроны марки Oasis МАХ и WАХ содержат полимер со смешанной обращенно-фазовой и анион-обменной функциональностью. Данные патроны обладают особой избирательностью к веществам, обладающим кислотными свойствами (патроны марки Oasis МАХ содержат группы четвертичного алифатического амина; патроны Oasis WАХ - четвертичного ароматического амина). С помощью данных патронов изолировали из комплекса барбитураты. Изолирование на патронах марки Oasis МАХ и WАХ проводили по методике: к 1 мл модельного комплекса добавляли 20 мкл ортофосфорной кислоты концентрированной. Патроны промывали 1 мл метанола и 1 мл воды очищенной, затем загружали 1 мл подкисленного образца модельного комплекса. Патроны МАХ промывали 1 мл аммиака раствора 5%, затем 1 мл метанола. Элюировали 1 мл уксусной кислоты раствора 2% в метаноле.

Патроны WАХ промывали 1 мл уксусной кислоты раствора 2%, а затем 1 мл метанола. Элюировали 1 мл аммиака раствора 5% в метаноле. Элюаты выпаривали досуха, растворяли в 1 мл ацетонитрила сорта 0 и проводили количественное определение методом ВЭЖХ, вышеописанных условиях.

Установлено (таблица 12), что изолирование на патронах Oasis МАХ увеличивает степень экстракции в сравнении с прямой ЖЖЭ органическим растворителем более чем в 2 раза, вследствие частичного разрыва связи токсического вещества с белками плазмы крови и за счет адсорбции вещества на сорбенте патрона. Изолирование на патронах марки Oasis WАХ приводит к потере токсических веществ, так как они не сорбируются на их поверхности.

Таблица 12 - Результаты статистической обработка данных по степени экстракции веществ из модельного комплекса после изолирования на патронах Oasis МАХ и WАХ

Анализируемое вещество	ЖЖЭ, _ X %	Метрологические характеристики (n=6, t=2,01)
		Патроны Oasis МАХ	Патроны Oasis WАХ
		_ X+?X, %	е %	CV	_ X+?X, %	е %	CV
фенобарбитал	29,4	61,7+4,8	7,7	3,8	7,5+0,6	7,8	3,9
барбамил (кислотная форма)	22,1	56,5+3,5	6,2	3,1	3,2+0,3	9,7	4,5



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Метод ферментативного гидролиза плазмы крови с целью последующего изолирования веществ является наиболее перспективным методом при химико-токсикологических и судебно-химических исследованиях. Разработанные методики позволяют улучшить качество работы и приводят к более достоверным исследованиям при отравлении токсическими веществами, особенно в малых дозах.

1. Доказано, что прямая ЖЖЭ органическим растворителем приводит к извлечению из плазмы крови лишь свободной фракции изученных веществ, не связанной с белками крови. Степень извлечения веществ метод ЖЖЭ коррелирует с процентом связывания их с белками. Предварительное использование осаждающих реагентов при изолировании не увеличивает процент экстракции анализируемых веществ, вследствие соосаждения их на поверхности белка.

2. Изучена возможность и выявлены особенности изолирования веществ из плазмы крови с применением гидролиза протеолитическими ферментами. Установлено, что процесс ферментативного гидролиза плазмы крови зависит от свойств фермента, времени инкубации, значения рН среды и температуры.

3. Показано, что изолирование объектов исследования из плазмы крови после гидролиза химопсином, (для производных барбитуровой кислоты ферментом трипсином) увеличивает степень экстракции веществ по сравнению с методом ЖЖЭ, за счет гидролиза пептидных связей определенных пар аминокислот активных центров белковой молекулы с высвобождением связанной фракции ксенобиотика.

Использование ферментов пепсин, химотрипсин не приводит к значительному увеличению степени экстракции лекарственных средств по сравнению с методами ЖЖЭ и ТФЭ вследствие большей специфичности фермента к аминокислотной последовательности белка.

4. Установлено, что изолирование исследуемых ксенобиотиков методом ферментативного гидролиза химопсином и методом ТФЭ на патронах марки Oasis HLB дают сопоставимые результаты. Для методики изолирования анализируемых веществ, с применением ферментов химопсина и трипсина определены некоторые валидационные характеристики (сходимость, внутрилабораторная воспроизводимость, робастность). Показано, что метод ферментативного гидролиза имеет преимущества перед методом ЖЖЭ без осаждения и с осаждением белков и может быть использован в практической работе БСМЭ и наркодиспансеров.

5. Патроны марки Oasis МСХ следует использовать при целенаправленном исследовании дифенгидрамина, хлоропирамина, клемастина, целекоксиба, а патроны марки Oasis МАХ - для фенобарбитала и барбамила. Патроны марки Oasis WCX и WAX не могут быть применены для изолирования изучаемых веществ, так как они не сорбируются на поверхности сорбента патрона.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чувина, Н.А. Оценка эффективности методов изолирования токсических веществ из крови / Н.А. Чувина, О.Ю. Стрелова // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008 .- №3. - С.22-24.

2. Чувина, Н.А. Изолирование кофеина из крови с применением ферментативного гидролиза на примере модельного вещества / Н.А. Чувина, О.Ю. Стрелова // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008. - №4. - С.28-30.

3. Чувина, Н.А. Изолирование производных барбитуровой кислоты из крови методом ферментативного гидролиза / Н.А. Чувина, А.С. Колупаева, О.Ю. Стрелова, Т.В. Горбачева // Труды Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию СПб ГУЗ БСМЭ «Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы трупа». - 2008. - С.377-378.

4. Чувина, Н.А. Исследование капсул препарата «Целебрекс» с целью химико-токсикологического анализа / Н.А. Чувина, Ю.Л. Кириллова, О.Ю. Стрелова // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» / Пермская гос. фармац.академия - Пермь, 2009. - С.82-85.

5. Чувина, Н.А. Использование метода ферментативного гидролиза для изолирования производных барбитуровой кислоты из крови (на примере фенобарбитала и барбамила) / Н.А. Чувина, А.С. Колупаева, О.Ю. Стрелова, И.В. Заблоцкая // Судебно-медицинская экспертиза. - 2010. - №5. - С.19-21.

6. Чувина, Н.А. Применение ферментативного гидролиза для изолирования токсических веществ различных химических групп из биологической жидкости (крови, плазмы) с целью химико-токсикологического анализа / Н.А. Чувина, О.Ю. Стрелова, В.Н. Куклин // Вестник Российской Военной медицинской академии им. Кирова. - 2011. - №1(33). - С.154-155.

7. Чувина, Н.А. Применение ферментативного гидролиза для изолирования токсических веществ разных химических групп из биологической жидкости (крови, плазмы) с целью химико-токсикологического биофармацевтического анализа / Н.А. Чувина //Тезисы докладов Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего», Санкт-Петербург, 2011. - С. 91-92

8. Чувина, Н.А. Химико-токсикологический анализ препарата «Целебрекс» / Н.А. Чувина, Ю.Л. Кириллова, О.Ю. Стрелова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорская гос. фармац.академия. - Вып. 66. - Пятигорск, 2011. - С. 475-477.

9. Чувина, Н.А. Изучение возможности применения метода ферментативного гидролиза для изолирования производных барбитуровой кислоты из крови / Н.А. Чувина, О.Ю. Стрелова // Сборник Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии». - 2011. - С.79.

10. Чувина, Н.А. Химико-токсикологическое исследование антигистаминных препаратов (димедрол, супрастин, тавегил) / Н.А. Чувина, О.Ю. Стрелова, В.Н. Куклин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорская гос. фармац.академия. - Вып. 67. - Пятигорск, 2012. - С.291-293.

11. Чувина, Н.А. Изолирование лекарственных веществ из плазмы крови методом твердофазной экстракции / Н.А. Чувина, О.Ю. Стрелова, В.Н. Куклин // Бутлеровские сообщения. - 2013. -Т. 33. - №1. - С. 35-42.

12. Чувина, Н.А. Ферментативный гидролиз плазмы крови как метод химико-токсикологического анализа, используемый для изолирования токсических веществ / Н.А. Чувина, О.Ю. Стрелова, В.Н. Куклин // Токсикологический вестник. - 2013. - №1. - С.31-35.

13. Чувина, Н.А. Изолирование токсических веществ из крови (плазмы крови) методом ферментативного гидролиза с целью химико-токсикологического анализа / Н.А. Чувина, О.Ю. Стрелова, В.Н. Куклин // Сборник материалов расширенной научно-практической конференции, посвященной 95-летию СПб ГБУЗ БСМЭ «Актуальные вопросы профилактики и лабораторной диагностики в судебно-медицинской экспертизе». - 2013. - С.247-250.

Размещено на Allbest.ru